專利名稱：一種篩選治療腦損傷藥物的方法
一種篩選治療腦損傷藥物的方法技術領域
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種篩選腦損傷藥物的方法，具體涉及一種用核磁共振技術篩選治療腦損傷藥物的方法。本發明還提供突觸后致密物質-95(PSD-95)的 PDZ2結構域的核磁共振指紋圖譜。
背景技術：
現有技術公開了 N-methyl-D-aspartate受體(NMDAR)是一種離子型的谷氨酸受體，在中樞神經系統的發展過程中，對于神經元分化、遷移、突觸的形成、以及軸突的生長形態起關鍵作用。但是，NMDAR的持續過激導致的細胞內一氧化氮(NO)的過量生產將引起缺血缺氧性神經損傷，其代表病例為通常稱謂的中風。
現代醫學研究發現，在經由NMDAR進入后突觸神經元的鈣流的過度刺激下，nNOS 產生的過量NO是導致中風類神經損傷的一個主要原因。由于NMDAR及nNOS參與多種重要的細胞生理活動，用NMDAR或nNOS的直接抑制劑來治療NO過量導致的神經損傷通常會引發細胞毒性等副作用，因而近年來醫學研究一直在尋找其替代療法。PSD-95蛋白由于其PDZ2結構域在NMDAR/nNOS通路中起到重要的支架作用[1，2]，而成為一類針對NO過量生產引發的神經損傷的極有潛力的藥物靶標可以通過小分子化合物阻斷NMDAR/PSD-95/ nNOS復合體的形成，進而切斷NMDAR與nNOS的物理偶聯來抑制中風。有關生化研究表明， 阻斷PSD-95PDZ結構域上nNOS的結合位點在理論上是可行的[3_5]。研究還表明，神經細胞中PSD-95的缺失將減少NO的生成并抑制興奮性中毒，而NMDAR的正常生理活性不受影響[6，7]。Aarts等的體內及體外實驗還證實，小肽可以通過阻礙NMDAR NR2B與PSD-95的相互結合而具有神經保護作用[6]。這些研究結果表明，破壞PSD-95與NMDAR或nNOS之間的相互作用可能代表一種治療NMDAR介導的神經毒性的極具潛力的替代療法。
與本發明相關的現有技術有下述參考文獻
1. KornauiH. C. , et al· ,Domain interaction between NMDA receptor subunits and thepostsynaptic density protein PSD-95. Science,1995. 269(5231) :p. 1737-40.
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3.Tochio， H. ， et al. ， Solution structure and backbone dynamics of the second PDZdomain of postsynaptic density-95. J Mol Biol,2000. 295 (2) :p.225-37.
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5. Tochio, H. ,et al. , Solution structure of the extended neuronal nitric oxidesynthase PDZ domain complexed with an associated peptide. Nat Struct Biol, 1999. 6(5) :p. 417-21.
6.Aarts, M. , et al. , Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDAreceptor-PSD-95 protein interactions. Science,2002. 298(5594) :p. 846-50.
7. Sattler, R. , et al. , Specific coupling of NMDA receptor activation to nitricoxide neurotoxicity by PSD-95 protein.Science,1999. 284(5421) :p. 1845-8.
8. Zhang, M. and W. Wang, Organization of signaling complexes by PDZ-domainscaffold proteins. Acc Chem Res, 2003. 36 :p.530—538。發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種篩選腦損傷藥物的方法， 具體涉及一種用核磁共振技術篩選治療腦損傷藥物的方法。
本發明還提供突觸后致密物質-95 (PSD-95)的PDZ2結構域的核磁共振指紋圖譜。
本發明通過破壞N-methyl-D-aspartate受體(NMDAR) /神經元一氧化氮合成酶(nNOS)與突觸后致密物質-95 (PSD-95)的 PDZ2 (PSD-95 ；Disc Large 和 Zonula occludens-1)結構域的相互作用，提供篩選治療缺血性中風潛力的小分子化合物。
具體而言，本發明通過對PSD-95PDZ2結構域的1H, 1N HSQC核磁共振指紋譜圖的研究，提供一種可與PSD-95 PDZ2結構域相結合的小分子化合物的篩選方法，該方法篩選出的小分子化合物因與PSD-95的PDZ2結構域結合，從而可以破壞PSD-95與NMDAR或nNOS 的相互結合；
上述的化合物也可用于進一步完善基于其他PDZ結構域的疾病治療策略。
本發明的快速篩選腦損傷藥物方法，其特征在于，其包括步驟
(1)獲得自由態的PSD-95 PDZ2結構域蛋白樣品；
(2)采取上述自由態PSD-95 PDZ2結構域的第一次核磁共振譜(3)在該PDZ2樣品中加入一種待測化合物，制得一個測試樣本；
(4)培育混合后的PDZ2樣品，使待測化合物與PDZ2結構域完全、充分反應；
(5)采取培育后PDZ2結構域的第二次核磁共振譜(6)比較第一和第二次核磁共振譜圖以確定反應情況；
(7)確認上述待測化合物的結合使PSD-95 PDZ2的β B折疊和α B螺旋上的氨基酸發生化學位移變化。
本發明步驟(7)中，所述的氨基酸至少包含PSD-95 PDZ2由甘氨酸169-丙氨酸 175所組成的β B折疊，以及組氨酸225-賴氨酸233所組成的α B螺旋中各一個氨基酸。
本發明中，所述的PSD-95蛋白PDZ2結構域的氨基酸序列(單字母表示，氨基酸 155-249)為序列 1。
本發明采用核磁共振光譜法提供的快速篩選方法，可用于高速高效地篩選與 PSD-95的PDZ2結構域相互作用的化合物。
本發明中，所述的測試樣本中含有天然中藥成分黃芩苷(baicalin)。
所述的的黃芩苷的有效劑量，可用于治療人類腦缺血缺氧導致的腦損傷。
本發明利用核磁共振光譜技術(化學位移)的精湛靈敏度來探測靶標蛋白與其潛在配體的結合，為目標蛋白PSD-95與小分子化合物之間直接結合提供一個靈敏的檢測方法，該方法不需要知道待篩選化合物以及目標蛋白的任何生物活性；而且，由于該篩選方法僅僅依賴于化合物與靶標蛋白的直接相互作用，因此也不存在任何錯誤。
本發明研究結果顯示，PSD-95蛋白可通過15N (或13C)進行同位素標記，15N (或13C) 標記后的PSD-95可通過采集1H, 15N(或1H, "C) HSQC (異核單量子相干)譜，識別所述的與 PSD-95蛋白相結合化合物的高靈敏度和高效；自由態PDZ2的1H, 15N HSQC譜圖中的共振峰可用于確定待測化合物是否有能力部分或全部破壞PSD-95 PDZ2結構域與NMDAR或nNOS 的結合。
本發明研究結果還顯示，由于每個氨基酸都具有特異的化學位移，即在譜圖中的位置都已被歸屬，因此通過比較二張譜圖，還可確定化合物特異地結合在PDZ結構域的部分。由于PDZ結構域典型的靶物結合位點是由第二個折疊以及第二個α-螺旋之間形成的凹槽，根據在加入化合物后PDZ2的靶物結合凹槽上的氨基酸是否發生化學位移變化，判斷上述化合物與PDZ2之間是否為典型的結合模式。例如，PSD-95 PDZ2的異亮氨酸 174(位于PDZ2的第二個β-折疊，其化學位移為1H 8. 47ppm, 15N 114. 6ppm，標記為1174， 如圖1所示)及亮氨酸232(位于PDZ2的第二個α-螺旋，其化學位移為屮7. 46ppm, 15N 115. 5ppm，標記為L232，如圖1所示)在結合化合物時都會發生化學位移的變化(這一方法也被稱為化學位移微擾法)，如果PSD-95 PDZ2上與某配體化合物的結合區域與NMDAR/ nNOS的結合區域重疊[4]，則說明上述配體阻礙PDZ2與NMDAR或nNOS的結合。
本發明的快速篩選治療腦損傷藥物的方法，具有核磁共振光譜法快速、容易、可重復性、以及不需要有高純度分析標的物作為標準品的特殊優點，所述的化學位移微擾法還可應用于同時篩選多種化合物的混合物(例如，化合物庫)或復雜的提取物。如某個復雜測試樣本中包含一個積極的結果，可將該樣本提取出來，通過粗分再細分的方法，逐步簡化測試樣本成分，最終把該樣本中的單一有效化合物鑒定出來。
根據本發明所述的化學位移微擾法，本發明的一個實施例中，發現傳統中草藥黃芩水溶性提取物中的成分黃芩苷(baicalin)可結合PSD-95的PDZ2結構域，并特異地結合到PDZ2的NMDAR/nNOS結合口袋里。依據結合位點的分析，本發明進一步合成與PSD-95結合的天然化合物的衍生物，獲得比天然化合物更高的結合能力。
本發明的方法根據PSD-95 PDZ2因靶物結合引起化學位移變化的高靈敏性，可運用化學位移微擾法很容易地識別與PSD-95結合的化合物；同時，本發明也為分析水溶性草藥提取物中可與PDZ結合的活性成分提供一個有效手段。
本發明的方法篩選出的小分子化合物可用于治療中風，同時也可為干擾其他PDZ 結構域介導的信號傳導通路的小分子藥物的優化與篩選提供指導依據。
本發明中提供的化合物可作為治療由PSD-95PDZ結構域介導的信號傳導通路相關疾病的潛在藥物，還是一種降低NMDA受體相關神經毒性損害的替代療法。
為了便于理解，下面通過附圖和具體實施例對本發明進行詳細的描述。需要特別指出的是，具體實施例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的技術人員可以根據本文說明，對本發明進行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本發明范圍之內。
圖1顯示自由態PSD-95 PDZ2的1H, 15N HSQC譜圖。每個主鏈共振峰都標記上其代表的氨基酸名稱(單字母表示)及序列號。5
圖2顯示在加入NMDAR NR2B肽段后的束縛態PSD-95 PDZ2的1H, 15N HSQC譜圖。
圖3是圖1及2的重疊譜圖，圖中自由態PDZ2的譜峰為深色，束縛態PDZ2的譜峰為淺色。
圖4是黃芩苷的化學結構。
圖5是用增量的黃芩苷滴定自由態PDZ2 (譜峰為黑色)的1H, 15N HSQC重疊譜圖； 圖中顯示加入黃芩苷的量越多，譜峰的灰階顏色越淡，箭頭標示選定氨基酸隨加入黃芩苷而發生的化學位移變化。
圖6顯示PDZ2的1174及L232隨加入黃芩苷的增加而發生化學位移變化的劑量-反應曲線。
具體實施方式
實施例1. PSD-95重組蛋白的表達與同位素標記
為了提高篩選的特異性和靈敏度，PSD-95蛋白的PDZ2結構域使用重組蛋白的方法用1N均一標記。PDZ結構域蛋白的表達方法參見文獻[3]。
首先將包含PSD-95 PDZ2的pET14b質粒通過電穿孔轉化到大腸桿菌菌株 BL2KDE3)中。挑取單菌落接種于LB培養基中并于37°C搖床中生長過夜。細菌的飽和溶液再以1 100的比例接種于大劑量的LB培養基中，在37°C搖床中培養至0D600達到 0.6，再用終濃度為0. 2mM的異丙基-β三維-半乳糖苷(IPTG)誘導，接著在30°C搖床中中速培養4-5小時即可。
為了獲得1N均一標記的PDZ2，蛋白表達需采用M9培養基并使用15NH4CKl克/升) 作為唯一氮源，并加入終濃度為0. 4mM的IPTG以誘導蛋白表達。將1升細菌培養液低速離心得到的細胞沉淀加入40毫升冰凍處理的Ni2+-NTA親和柱結合緩沖液(5mM咪唑，0. 5M氯化鈉，20mM Tris-HCl,pH 7.9)以懸浮細胞，然后使用細胞破碎儀進行一到兩次簡短的超聲破碎以裂解細胞。細胞裂解液在39，OOOxg的轉速下離心20分鐘以除去細胞碎片，上清通過 0. 2 !濾膜過濾后加載到Ni2+-NTA柱上，再用100毫升的結合緩沖液沖洗。最后，His-標簽的PDZ2蛋白用15毫升洗脫緩沖液(1M咪唑，0. 5M氯化鈉，20mM Tris-HCl, pH 7. 9)洗脫。
洗脫蛋白在包含50mM Tris-HCl (pH 7. 5)，2mM乙二胺四乙酸，2mM DTT的緩沖液中進行透析。N末端的His-標簽通過凝血酶蛋白進行酶切(1毫克的His-PDZ2加入一單位的酶，在室溫下酶切4小時)。酶切后的蛋白通過kphacryl-100凝膠過濾柱去除His-標簽， 凝血酶及其他污染物。包含PDZ2的組分收集后在碳酸氫銨溶液中梯度透析(由5克/4升下降到0. 5克/4升)，最后在雙重蒸餾水中透析。蛋白樣品冷凍干燥后于-20°C保存。
實施例2.自由態PDZ2蛋白的核磁共振譜圖分析
如上所述，1N均一標記的PSD-95PDZ2結構域將用于核磁共振實驗。溫度30°C時， 使用瓦里安VNMRS 600MHz核磁共振譜儀采集譜圖。凍干的15N標記的PDZ2蛋白溶解于 IOOmM的磷酸鉀鹽緩沖液(pH 6. 0)，蛋白濃度 0. 1-0. 2mM (通常體積為0. 5毫升)。
如圖1所示的PSD-95PDZ2結構域的1H, 15N HSQC(異核單量子相干)頻譜，由于蛋白質中每個氨基酸殘基(且只有氨基酸殘基)都用1N標記，可在采集的1H，1N HSQC譜圖中觀察記錄該蛋白的每個氨基酸殘基的單一共振峰；每個共振峰的歸屬在早先的實驗中已被闡明[3]，而PSD-95PDZ2蛋白上直接參與NMDAR或nNOS結合的氨基酸也已被確定[3，4]。
實施例3.束縛態PDZ2蛋白的核磁共振譜圖分析
使用PSD-95結合蛋白NMDAR NR2B羧基端的9個氨基端小肽(NR2B肽段)檢測采用核磁共振作為靈敏篩選方法的效果。已有報道NR2B蛋白可以結合PDZ2[1]。
由于PSD-95PDZ2結構域的1H-1N HSQC譜圖中每個共振吸收峰的歸屬已知，并可直接聯系到PDZ2結構域的三維空間結構，PDZ2每個氨基酸殘基由于靶物結合誘導的化學位移變化值可以用公式計算
Δ …=[(Δ δΗΝ)2+(Δ δΝ· αΝ)2]1/2
其中用于歸一化1H和1N的比例因子％為0. 17，Δ δ ra為某一共振峰與1N相連的H原子的化學位移變化，而△ δ N為該共振峰1N的化學位移變化。
如圖2所示的PSD-95 PDZ2在結合NR2B肽段之后的1H，15N HSQC譜圖，該譜圖顯示 PSD-95PDZ2每個氨基酸殘基的化學位移變化值可以進一步映射到其三維結構上，并以此判斷化合物與蛋白質的具體結合情況。
如圖3所示，譜圖重疊更清晰地顯示了 PSD-95在結合NR2B肽段之后化學位移的變化。對于粗略確定是否有任何化合物與PDZ2結構域結合，可以用計算機設置氨基酸殘基檢查點，如圖 1 中絲氨酸 173(117. lppm,8. 60ppm)，異亮氨酸 174(114. 6ppm,8. 47ppm)， 丙氨酸 175(123. 2ppm，9. llppm)，組氨酸 225 (125. lppm，9. 81ppm)，谷氨酸 226 (115. Ippm, 9. 64ppm)，丙氨酸 228 (1. 253ppm, 7. 57ppm)，丙氨酸 231 (1. 203ppm, 7. 78ppm)，和亮氨酸 232(115. 5ppm, 7. 46ppm)。圖3清楚地表明，NR2B肽段的結合導致PSD-95 PDZ2結構域中直接參與配體結合的第二個β-折疊及第二個α-螺旋上的氨基酸(包括上面提到的氨基酸殘基)發生了化學位移變化。
解析PSD-95 PDZ2結構域的高分辨率溶液結構，并通過1N弛豫實驗及無模型 (model-free)的方法詳細研究PDZ2結構域的主鏈動力學。PSD-95 PDZ2在βΒ和β C折疊間有一條長環，而這條獨特的長環直接參與靶物結合[3]。可將配體結合誘導的每個氨基酸殘基的化學位移變化值定量計算后繪制到蛋白的三維結構上(參見[3])。配體結合誘導的化學位移變化僅限于PSD-95PDZ2結構域的第二個β -折疊及第二個α-螺旋之間的凹槽。
實施例4.篩選與PDZ2結合的天然化合物
由上述實施例3中的數據證明，本發明中的化學位移微擾法可以有效地篩選出與 PDZ2相結合的肽段。
在本發明的方法中，PSD-95 PDZ2結構域由上述實施例1所述重組表達并用工％標記。1N標記的PSD-95 PDZ2結構域在大腸桿菌中表達并純化。濃度為0. 1-0. 2mM純化的重組蛋白(0.5毫升，溶于IOOmM磷酸鹽緩沖液，pH 6.0)將與天然小分子化合物混合(得到束縛態PDZ2)。
使用上述制備技術，將束縛態與自由態( 0. ImM,同樣緩沖溶液條件)PDZ2蛋白 & ，15Ν HSQC譜圖記錄后進行對比。基于核磁共振的化學位移微擾法可用來檢測1N標記的PSD-95 PDZ2與小分子化合物之間的結合情況。在與小分子化合物混合后，與自由態相比PDZ2的化學位移發生變化的將被認為該化合(混合)物中含有可與PSD-95 PDZ2相結合的活性成分。
本發明發現，使用這種方法，傳統中草藥黃芩的水溶性成分之一黃芩苷可誘導PSD-95PDZ2發生顯著的化學位移變化。圖5顯示了 PSD-95 PDZ2在混合入增量的黃芩苷之后的1HZ5NHSQC重疊譜圖。在加入10倍于PDZ2劑量的過量黃芩苷后，60%的PDZ2結構發生擾動。
如圖6所示，為了進一步確定黃芩苷與PSD-95 PDZ2的結合情況，本發明構建異亮氨酸174(1174)和亮氨酸232仏23幻化學位移變化幅度隨黃芩苷劑量改變的劑量-反應曲線。1174和L232分別處于蛋白的B折疊與B螺旋上，其滴定曲線都顯示出對于黃芩苷劑量依賴性和飽和性的特點，證實了黃芩苷與PDZ2-95 PDZ2的特異性相互作用。同時，通過將 PSD-95 PDZ2的1174與L232的酰胺基團的誘導化學位移變化與其最大化學位移變化作歸一化處理，還可定量計算黃芩苷與PDZ2的解離常數(Kd 2mM)。由此，基于核磁共振技術的篩選結果表明，黃芩苷可以特異地結合于PDZ2的配體結合α B/ β B凹槽，從而對其結構造成擾動。值得注意的是，黃芩苷與NMDAR/nNOS都結合在PSD-95 PDZ2結構域的同一位點 [3]0
與多肽誘導的PDZ2化學位移變化[3]相比，由黃芩苷誘導的PDZ2化學位移變化在空間范圍上更狹小。由黃芩苷誘導的PDZ2結構變化主要集中在αΒ/βΒ溝槽的中間部位，這表明，上述化合物與PSD-95 PDZ2的相互作用主要發生在配體結合凹槽的中心，而羧基結合環以及可容納肽鏈羧基端氨基酸側鏈的疏水口袋是空置的。因此，本發明為合成具有同PSD-95 PDZ2更高親和力的黃酮類衍生物提供了參考依據。
黃酮類黃芩苷為天然中草藥提取物，已被廣泛認為可直接作用于NMDAR，本發明的實驗結果進一步證實黃芩苷有可有效地用于治療缺血性中風；同時，由于黃芩苷為天然中草藥提取物，在其草藥混合物狀態已長期用于中風治療，普遍認為在治療劑量下無毒。因此，運用本發明所篩選出的與PDZ2相結合的天然化合物，以及以此為模板設計的改良型化合物，與完全人工設計合成的化合物相比可能具有副作用小的優勢。
權利要求
1.一種篩選治療腦損傷藥物的方法，其特征在于，其包括步驟(1)獲得自由態的PSD-95PDZ2結構域蛋白樣品；(2)采取上述自由態PSD-95PDZ2結構域的第一次核磁共振譜圖；(3)在該PDZ2樣品中加入一種待測化合物，制得一個測試樣本；(4)培育混合后的PDZ2樣品，使待測化合物與PDZ2結構域完全、充分反應；(5)采取培育后PDZ2結構域的第二次核磁共振譜圖；(6)比較第一和第二次核磁共振譜圖以確定反應情況；(7)確認上述待測化合物的結合使PSD-95PDZ2的β B折疊和α B螺旋上的氨基酸發生化學位移變化。
2.按權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(7)中的氨基酸至少包含 PSD-95PDZ2由甘氨酸169-丙氨酸175所組成的β B折疊，以及組氨酸225-賴氨酸233所組成的αB螺旋中各一個氨基酸。
3.按權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的測試樣本中含有天然中藥成分黃芩苷。
4.按權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的PSD-95蛋白PDZ2結構域的氨基酸序列為序列1。
5.一種權利要求1的方法篩選的化合物，其特征在于，確定為有效劑量的黃芩苷。
6.權利要求5所述的有效劑量的黃芩苷在制備治療人類腦損傷藥物中的用途。
7.按權利要求6的用途，其特征在于所述的腦損傷是腦缺血缺氧導致的腦損傷。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種篩選治療腦損傷藥物的方法，本發明通過對PSD-95 PDZ2結構域的1H，15N HSQC核磁共振指紋譜圖的研究，提供一種可與PSD-95 PDZ2結構域相結合的小分子化合物的篩選方法，該方法篩選出的小分子化合物因與PSD-95的PDZ2結構域結合，從而可以破壞PSD-95與NMDAR或nNOS的相互結合；本發明還提供一種治療缺血性中風潛力的小分子化合物篩選方法，篩選得到的有效劑量的黃芩苷，可用于治療人類腦缺血缺氧導致的腦損傷。本發明篩選出的化合物還可治療由PSD-95PDZ結構域介導的信號傳導通路相關疾病，還可作為降低NMDA受體相關神經毒性損害的替代療法。
文檔編號G01N31/00GK102539466SQ201010594928
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者張明杰, 溫文玉, 王文寧 申請人:復旦大學