專利名稱：一種豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是豬的主要傳染病之一，以母豬妊娠后期發生流產、死胎和產木乃伊胎、新生仔豬死 亡，小豬及育肥豬實質性肺炎為特征的疾病。PRRSV主要在單核巨噬細胞和淋巴系統內復 制，破壞這些細胞的機能并最終破壞感染豬只的免疫力。結果將導致對其他病毒的抵抗力 下降及多種病原微生物如多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬副嗜血桿菌和沙門氏菌等混合感 染，造成大批豬只死亡。2006年下半年以來，由PRRSV變異株引起的“高熱病”在我國爆發 并持續流行，除極少數隔離條件好且管理水平高的豬場外，幾乎100%的豬場受到沖擊，據 估計有超過4000萬頭的豬場在這場疫病暴發中死亡，而一些中型和小型的養豬場則因此 被迫關閉，給養豬業造成了巨大的經濟損失。就目前人類擁有的技術來看，疫苗是對付病毒的最佳選擇，雖然現在國內外已生 產出多種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗在市場上使用，但目前該病的防治工作仍面臨很大的困 難。其中主要的問題是沒有準確區別感染與免疫、確定保護性免疫力的方法和標準，這造成 疫苗評價和使用方面的混亂，也妨礙了高效疫苗的研制工作。自20世紀80年代發現豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)以來，許多專家、學者對 該病進行了多方面的研究，其中包括該病毒的免疫機理，研究發現在不同的狀態下，PRRSV 感染機體后產生的抗體類型和保護力是不一致的，這給傳統免疫學提出挑戰，給有效免疫 預防設置了障礙，其結果是到目前為止人類沒能對PRRSV的疫苗保護作用進行有效的評 價。具體難題有如下幾點
(1)利用現有的檢測方法對自然感染或傳統疫苗免疫后的動物體進行抗體檢測，檢測 的抗體存在無保護作用甚至有害的現象。已經知道，PRRSV可誘導產生抗體的抗原表位位于基質(M)、糖蛋白GP3和GP5蛋 白、核(N)蛋白，其中基質(M)、糖蛋白GP3和GP5蛋白可誘導產生中和抗體，核(N)蛋白和 GP5蛋白可誘導ADE抗體，中和抗體參與清除病毒過程，產生免疫保護作用，而ADE抗體能使 PRRSV的感染和復制增強(抗體介導的增強作用，ADE)。現有的檢測方法只能檢測出動物體 內PRRSV誘導的所有抗體，而不能區別其抗原表位特異性，因此雖然有時檢測到很高的抗 體滴度，但中和抗體的水平很低，仍然起不了保護作用。(2)中和抗體與免疫力間的關系有待進一步明確
Osorio研究小組用來自PRRSV康復高免豬血清的免疫球蛋白注射妊娠母豬，產生極好 的免疫保護，免疫豬均未發生繁殖障礙。進一步研究證明，該免疫球蛋白有效成分主要是中 和抗體，從而明確了中和抗體與保護性免疫的相關性。Lopez OJ等人近來報導，給妊娠母豬輸入中和抗體可保護其不發生繁殖障礙，并 在母豬和其后代產生永久性免疫力。但為了得到完全保護，需要輸入高滴度PRRSV中和抗體(1:32)，但即使如此，只有50%得到保護。另外，在血液中存在滴度1:8的中和抗體足以 阻止PRRSV病毒血癥，但不能阻止其向周圍組織接種及向與之接觸的豬傳播病毒。母豬血 液中較低水平的NA可表明它產生了對PRRSV的永久保護力，而斷奶小豬產生完全保護時 需要的NA量明顯高。由此可以看出，NA滴度在一定程度上有助于判定疫苗的保護作用。從臨床實驗感染動物體內的免疫特征來看，在接種后14-120天可檢測到血清中 和抗體(Batista L, et al. 2004)。這些結果提示中和抗體參與清除病毒過程，但早期中 和抗體出現時間差異較大。目前還不完全清楚中和抗體在PRRSV疫苗功效中的地位，Diaz I等(2006)用兩 個不同株PRRSV疫苗免疫小豬，到42天時未發檢測到中和抗體。Nilubol D等(2004)報導 PRRSV滅活疫苗激發已感染動物產生中和抗體。同樣Bassaganya-Riera J等(2004)人也 發現，滅活疫苗可刺激曾免疫動物產生中和抗體。研究并掌握疫苗功效與中和抗體的規律， 對研制高效疫苗、正確使用疫苗、縮短決策周期均有重要意義。我國2007年在PRRSV疫苗 突擊生產時，因缺乏關鍵的標志性檢驗技術而導致生產周期延長這一事實就充分說明了這
——占
；^ ο(3)現有檢驗方法不能滿足防控需要
目前國內外篩查PRRSV感染的主要方法是用RT-PCR檢測病毒核酸，用免疫過氧化 物酶單層試驗(IPMA)、間接熒光抗體試驗(IFA)、血清中和試驗(SN)、酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)等血清學方法檢測特異性抗體。值得指出的是，由于SN法的靈敏度較低、操作復 雜，目前無法在獸醫臨床實踐中廣泛使用。受病毒在感染動物體內的動態變化規律影響， RT-PCR僅適用于感染早期。Horter等對ELISA、RT-PCR和病毒分離進行的比較表明，接種 后63 105天期間，ELISA敏感性和特異性最高，均為98%，RT-PCR特異性為100% (口咽拭子 和扁桃體樣品)敏感性為81%和66%，病毒分離敏感性為47%和27%。Torremorell等發現 ELISA試驗存在一定的假陽性，IDEXX ELISA假陽性率為0. 89%，且成年豬出現假陽性幾率 高于小豬。由于對PRRSV的免疫機理尚缺乏完全的了解，因此在PRRSV免疫學方面的研究 及建立完善的免疫評估方法和標準仍然是最重要的研究方向。現有的檢測試劑存在一定缺陷，不能區分野毒感染產生的抗體和疫苗免疫產生 的抗體，也不能區分疫苗免疫后產生的抗體是保護性抗體還是非保護性抗體，因此檢測的 數據不能真正判斷出豬群是否對PRRSV具有保護力，對疫苗的免疫效果不能作出正確的評 估，這是制約現有檢測試劑廣泛使用的最重要原因。
發明內容
針對上述不足，本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒及其應 用。該試劑盒操作簡便，穩定性和重復性好，具有良好的可靠性。本發明的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒，其組成包括
1)96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板
2)洗滌液
3)兔抗豬酶標抗體
4)顯色液
5)終止液6)陽性對照
7)陰性對照。其中所述96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板包括一對引物，上游引物PNl 5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，，酶 標板的制備為利用所述引物進行基因擴增，形成一長度為372bp的核酸片段，將此擴增產 物連接至一表達載體上進行原核細胞表達，然后將表達的N蛋白進行純化，抗原量達到5 μ g/mL時即可包被于酶標板上。所述試劑盒中的試劑配制如下
(1)洗滌液
含0. 05%Tween-80的PBS緩沖溶液，使用時進行10倍稀釋；所述PBS緩沖溶液濃度為 0. lmol/L, pH=7.2 ；
(2)兔抗豬酶標抗體
辛酸-SAS沉淀法提純豬血清IgG后，用DEAE-52纖維素層析、S印hadeX-G200分子 篩層析進一步提純IgG，按常規方法免疫家兔，制備兔抗豬IgG抗血清，然后經過辛酸-50% SAS-35% SAS鹽析以及過DEAE-52纖維素層析柱提純兔抗豬IgG，最后用辣根過氧化物酶標 記得到兔抗豬酶標抗體；
(3)顯色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加雙蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1檸檬酸-0. 2磷酸氫二鈉緩沖液 PH5. (Γ5. 4 磷酸氫二鈉14. 6g 檸檬酸9.33g 加雙蒸水至1000ml調pH值；使用時按底物A 底物B=I :1 混合后加過氧化氫至終濃度為0. 75% ；
(4)終止液=IMHCl。利用上述的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒 的方法，具體步驟如下
(1)分別取陽性對照及陰性對照加入酶標板孔內，50ul/孔，各加兩個孔；
(2)加樣待測樣品孔中每孔各加入待測血清樣品50ul;(3)將酶標板置于37 °CX60 min或2-8°C冰箱中過夜孵育；(4)吸出酶標板孔中的液體并棄去；
(5)用250 350ul的洗滌液洗滌每個孔5次，每次洗滌后，甩去孔中液體，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液體；(6)每孔加入兔抗豬酶標抗體IOOul ； (7) 將酶標板置于37 V 30 min ； (8)重復步驟4和5; (9)每孔中加入顯色液lOOul，置于室 溫暗處反應5 10 min ； (10)每孔中加入IOOul終止液終止反應。(11)用酶標儀在450nm 處測吸光值。其中陽性對照和陰性對照可根據現有技術中的常規方法制備。本發明的試劑盒可用于對PRRSV感染與保護性免疫的鑒別診斷。(1)確定對不同PRRSV感染/免疫狀態的標志性抗原表位(群)
不同PRRSV狀態下，豬體內抗體變化較大，但對這些抗體的特異性研究較少。為掌握這 些抗體的特異性譜，擬建立高靈敏的免疫分析方法，對動物在不同PRRSV狀態下M、GP3和 GP5單抗原表位的免疫反應性逐個分析，可得出具有標志性的抗原的信息。(2)建立相應的靈敏檢測方法
現有免疫分析方法的靈敏度不足，不能監測到感染或免疫早期特定免疫反應的變化，因而無法直接用于需要快速評價免疫效果的情況(如新疫苗評價、新藥評價等)。根據目前 檢測技術的發展和實踐應用的結果，建立基于不同原理的酶免疫檢測技術，以排除血清學 的干擾，找出真正反映免疫力水平的指標和方法。
( 3 )商品化試劑的試制
根據已建立的檢測方法進行商品化試劑的試制，并進行符合性試驗。本發明采用基因工程方法，構建病毒特定中和表位多肽片段和酶免疫技術制成， 能有效區分各類抗體，并建立評判免疫保護作用的的技術標準，對豬繁殖與呼吸綜合征的 防控具有非常重要的意義，應用市場廣闊。本發明試劑盒便于操作、使用成本低、重復性好， 適合大規模推廣應用。
具體實施例方式1、本發明的試劑盒的組成包括
1)96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板
2)洗滌液
3)兔抗豬酶標抗體
4)顯色液
5)終止液
6)陽性對照
7)陰性對照。2、所述試劑盒中的試劑配制如下
(1)洗滌液
含0. 05%Tween-80的PBS緩沖溶液，使用時進行10倍稀釋；所述PBS緩沖溶液濃度為 0. lmol/L, pH=7.2 ；
(2)兔抗豬酶標抗體
辛酸-SAS沉淀法提純豬血清IgG后，用DEAE-52纖維素層析、kphadex-G200分子 篩層析進一步提純IgG，按常規方法免疫家兔，制備兔抗豬IgG抗血清，然后經過辛酸-50% SAS-35% SAS鹽析以及過DEAE-52纖維素層析柱提純兔抗豬IgG，最后用辣根過氧化物酶標 記得到兔抗豬酶標抗體；
(3)顯色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加雙蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1檸檬酸-0. 2磷酸氫二鈉緩沖液 PH5. (Γ5. 4 磷酸氫二鈉14. 6g 檸檬酸9.33g 加雙蒸水至1000ml調pH值；使用時按底物A 底物B=I :1 混合后加過氧化氫至終濃度為0. 75% ；
(4)終止液=IMHCl ；
(5)N蛋白利用引物(上游引物 Pm :5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，)進行基因擴增，94°C預變性 3min，94°C變形 50s，56°C退 火40s，72°C延伸lmin，30CyCles，形成一長度為37^p的核酸片段，將此擴增產物連接至 一表達載體(pET-32a)上進行原核細胞表達，然后將表達的N蛋白進行純化，抗原量達到5 μ g/mL時即可用于包被酶標板上。(6)陽性對照為PRRSV弱毒疫苗免疫健康豬，21日后采血所分離到的血清，抗體效價可達到1:256。(7)陰性對照為采集健康豬血所分離到的血清。3、利用所述的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病 毒的方法，具體步驟如下
(1)分別取陽性對照及陰性對照加入酶標板孔內，50ul/孔，各加兩個孔；
(2)加樣待測樣品孔中每孔各加入待測血清樣品50ul;(3)將酶標板置于37 0C X60 min或2-8°C冰箱中過夜孵育；(4)吸出酶標板孔中的液體并棄去；
(5)用250 350ul的洗滌液洗滌每個孔5次，每次洗滌后，甩去孔中液體，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液體；(6)每孔加入兔抗豬酶標抗體IOOul ； (7) 將酶標板置于37 V 30 min ； (8)重復步驟4和5; (9)每孔中加入顯色液lOOul，置于室 溫暗處反應5 10 min ； (10)每孔中加入IOOul終止液終止反應。(11)用酶標儀在450nm 處測吸光值。4、結果
當陽性對照OD值平均值(ODp)與陰性對照OD值平均值(ODn)之差大于或等于0. 150， ODn小于或等于0. 250時檢測結果成立。PRRSV抗體是否存在由S/P值決定。S/P= (0D樣一ODn)/ (0DP—ODn) 5、結果判定
1)當S/P大于或等于0. 3時的被檢樣品判為PRRSV抗體陽性。2) S/P大于或等于0. 2，但小于0. 3被檢樣品判為PRRSV抗體可疑。3) S/P小于0. 2的被檢樣品判為PRRSV抗體陰性。6、結果分析
通過臨床采集80份血清樣本，與RT-PCR結果相比，該方法的特異性為89%，敏感性為
90%。實施例1
取兩頭豬，1只確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬，1只健康豬。分別對兩只豬 采血，采用如具體實施方式
所述制備的試劑盒對樣本進行檢測。結果表明，感染病毒豬的S/ =0.4，健康豬的5/卩=0. 15。
權利要求
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒組成包括96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板洗滌液兔抗豬酶標抗體顯色液終止液陽性對照7)陰性對照。
2.根據權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒，其特征 在于所述96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板包括一對引物，上游引物Pm 5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，，酶 標板的制備為利用所述引物進行基因擴增，形成一長度為372bp的核酸片段，將此擴增產 物連接至一表達載體上進行原核細胞表達，然后將表達的N蛋白進行純化，抗原量達到5 μ g/mL時即可包被于酶標板上。
3.根據權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒，其特征在于試劑盒 中的試劑配制如下(1)洗滌液含0. 05%Tween-80的PBS緩沖溶液，使用時進行10倍稀釋；所述PBS緩沖溶液濃度為 0. lmol/L, pH=7. 2 ；(2)兔抗豬酶標抗體辛酸-SAS沉淀法提純豬血清IgG后，用DEAE-52纖維素層析、kphadex-G200分子 篩層析進一步提純IgG，按常規方法免疫家兔，制備兔抗豬IgG抗血清，然后經過辛酸-50% SAS-35% SAS鹽析以及過DEAE-52纖維素層析柱提純兔抗豬IgG，最后用辣根過氧化物酶標 記得到兔抗豬酶標抗體；(3)顯色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加雙蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1檸檬酸-0.2磷酸氫二鈉緩沖液 ΡΗ5.(Γ5.4:磷酸氫二鈉14. 6g 檸檬酸9.33g 加雙蒸水至1000ml調pH值；使用時按底物A 底物B=I :1 混合后加過氧化氫至終濃度為0. 75% ；(4)終止液=IMHCl。
4.一種利用權利要求1、2或3所述的豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒檢測豬繁殖 與呼吸綜合征病毒的方法，其特征在于所述方法具體步驟如下(1)分別取陽性對照及陰性對照加入酶標板孔內，50ul/孔，各加兩個孔；(2)加樣待測樣品孔中每孔各加入待測血清樣品50ul；(3)將酶標板置于37V X60 min或2-8°C冰箱中過夜孵育；(4)吸出酶標板孔中的液體并棄去；(5)用250 350ul的洗滌液洗滌每個孔5次，每次洗滌后，甩去孔中液體，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液體；(6)每孔加入兔抗豬酶標抗體IOOul；(7)將酶標板置于37V 30 min ；(8)重復步驟4和5 ；(9)每孔中加入顯色液lOOul，置于室溫暗處反應5 10 min ；(10)每孔中加入IOOul終止液終止反應；(11)用酶標儀在450nm處測吸光值。
全文摘要
本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征免疫檢測試劑盒及其應用。試劑盒中包括96孔PRRSV N蛋白包被的酶標板、洗滌液、兔抗豬酶標抗體、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。本發明采用基因工程方法，構建病毒特定中和表位多肽片段和酶免疫技術制成，能有效區分各類抗體，并建立評判免疫保護作用的技術標準，對豬繁殖與呼吸綜合征的防控具有非常重要的意義，應用市場廣闊。本發明試劑盒便于操作、使用成本低、重復性好，適合大規模推廣應用。
文檔編號G01N33/569GK102062775SQ20101058115
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者吳潤生, 陳先進 申請人:福州大北農生物技術有限公司