專利名稱：微藻油脂的檢測方法
微藻油脂的檢測方法技術領域
本發明屬于油脂檢測領域。
技術背景
微藻能源是近年來興起的一種新能源，其中利用微藻油脂生產生物柴油更是得到 了人們的廣泛關注。生物柴油具有“碳平衡”的特性，因此能夠緩解全球溫室效應，而且其 污染物排放水平較石化柴油要低。近年來生物柴油的產量出現了大幅提高，然而生物柴油 高昂的成本和不足的原料供應，阻礙了生物柴油的進一步推廣應用。微藻油脂作為生物柴 油的原料，已被提出并經過實驗驗證，不過受限于培養和收集等成本，還無法與石化能源等 進行競爭。
降低微藻生物柴油成本的方法之一就是提高采收藻細胞的脂含量，從而降低后續 油脂提取成本。由于藻細胞在不同的生長條件下或不同的生長階段時，其細胞內的脂含量 相差很大，為了優化藻細胞的培養條件，確定合理的采收時間，以得到具有最高脂含量的藻 細胞，需要經常對藻細胞的脂含量進行檢測。
稱重法是最常用的微藻油脂測定方法，該方法一般是通過高速離心或過濾分離含 微藻的溶液，得到微藻生物質后，將其凍干或烘干，然后再以有機溶劑將細胞所含的油脂提 取出來，稱重，并與微藻生物質的干重相除，以得到藻細胞的脂含量。該方法準確度高，但是 所需樣品量大，否則準確度會明顯下降，并且整個測定過程所需時間較長，若采取烘干，則 干藻粉的制備約需數小時，如果采取凍干，則干藻粉的制備需要數天，油脂的提取過程也需 消耗數小時，測量成本也很高。因此目前迫切需要一種穩定可靠的微藻油脂快速檢測方法。發明內容
本發明要解決稱重法所需樣品大、耗費時間長的技術問題；而提供了微藻油脂的 檢測方法。
本發明微藻油脂的檢測方法是按下述步驟進行的一、將微藻培養液稀釋至 0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一的稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶 液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒 光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下 離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色， 選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度 記為X2 ；四、取步驟一的稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X3;五、按公式X1-(X2+X3)計算出最大熒光強度差 值，然后根據熒光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的檢測。
本發明微藻油脂的檢測方法還可以按下述步驟進行的一、將微藻培養液預處理， 然后稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一的稀釋液，然后加入100 μ L 尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫度為4°c、轉速為lOOOOr/min的 條件下離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光 下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度， 熒光強度記為X2 ；四、取步驟一的稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波 長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X3 ；五、按公式X1_(X2+X3)計算出最大熒 光強度差值，然后根據熒光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂 的檢測。
本發明利用尼羅紅與脂類物質結合后能夠發出熒光信號的特性，能夠快速、敏感、 可靠地檢測藻類細胞內的脂含量。本發明減少了總消耗時間，降低了成本，所需樣品少。本 發明方法適用對小球藻、柵藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、輪藻等單細胞藻類進行檢 測，也可對細胞破碎預處理后的大型藻類進行檢測。
圖1是具體實施方式
二十五發射波長530nm 650nm之間的熒光強度， 表示染 色稀釋液，□表示染色上清液；Δ表示稀釋液；圖2是具體實施方式
二十五的熒光強度-脂 含量標準曲線。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式中微藻油脂的檢測方法是按下述步驟進行的一、 將微藻培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一的稀釋液，然后 加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長 450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為 10000r/min的條件下離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼 羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之 間的熒光強度，熒光強度記為X2 ；四、取步驟一的稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長， 測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X3 ；五、按公式Xl-(X2+X3)計 算出最大熒光強度差值，然后根據熒光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂含量；即完成 了微藻油脂的檢測。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中稀釋含微藻 的溶液用的溶劑為蒸餾水、自來水、去離子水、超凈水或礦泉水。其它步驟和參數與具體實 施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二所述尼羅 紅溶液的溶劑為丙酮、乙醇、丙醇、二氧六環、四氫呋喃或甲乙酮。其它步驟和參數與具體實 施方式一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 001g/L 0. 5g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至三之一相 同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 01g/L 0. 5g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 05g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟三所述 尼羅紅溶液的溶劑為丙酮、乙醇、丙醇、二氧六環、四氫呋喃或甲乙酮。其它步驟和參數與具 體實施方式一至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟三所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 01g/L 0. 5g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至七之一相 同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟三所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 01g/L 0. 2g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至七之一相 同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟三所述 尼羅紅溶液的濃度為0. 05g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一至十一之一不同的是步驟所 述熒光強度-脂含量標準曲線測定方法如下步驟a、從同一藻種的培養液中取處于不同生 長階段的培養液；步驟b、將所取的培養液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心 IOmin,并用蒸餾水清洗3 5次后，取離心所得的微藻生物質，并在_70度條件下凍干獲 得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. 8mL蒸餾水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振蕩2min后， 超聲破碎lmin，再加入Iml氯仿振蕩lmin，再加入Iml蒸餾水，再振蕩lmin，然后在4000r/ min條件下離心5min，離心后，取氯仿相轉移到另一試管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重 復三次，將得到的氯仿相氮吹干到質量恒定，稱重計算得到微藻脂含量；步驟c、將所取的 培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液，取IOmL稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶 液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒 光強度，熒光強度記為XI，將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心 IOmin,取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇 400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為 X2，取稀釋液，選擇500nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒 光強度記為X3，按公式X1_(X2+X3)計算出最大熒光強度差值；步驟d、以步驟b所測得的微 藻脂含量為坐標，以步驟c尼羅紅染色的最大熒光強度差值為橫坐標，繪制熒光強度_脂含 量標準曲線。
具體實施方式
十二 本實施方式中微藻油脂的檢測方法是按下述步驟進行的 一、將微藻培養液預處理，然后稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一 的稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測 定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫 度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然 后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波 長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X2 ；四、取步驟一的稀釋液，選擇500nm作 為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X3 ；五、按公式CN 102033059 A說明書4/7頁X1-(X2+X3)計算出最大熒光強度差值，然后根據熒光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂 含量；即完成了微藻油脂的檢測。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
十二不同的是所述微藻培養液 的預處理采用蒸餾水清洗預處理、二甲基亞砜預處理、超聲預處理、凍融預處理、高溫預處 理或酸熱預處理進行的。其它步驟和參數與具體實施方式
十二相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
十三不同的是蒸餾水清洗預處 理是按下述步驟進行的將微藻培養液離心，棄去上清液后，加入同等體積的蒸餾水(與棄 去上清液的體積相等)，混勻后，再次離心，重復三次后，加入同等體積的蒸餾水后混勻。其 它步驟和參數與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
十三不同的是二甲基亞砜預處 理是按下述步驟進行的取50mL微藻培養液，加入5mL 二甲基亞砜溶液，振蕩IOmin后，離 心，加入50mL蒸餾水使其重新懸浮。其它步驟和參數與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
十三不同的是是按下述步驟進行 的超聲預處理微藻培養液用超聲破碎lOmin。其它步驟和參數與具體實施方式
十三相 同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
十三不同的是是按下述步驟進行 的凍融預處理將微藻培養液在-20°C冰凍后在煮沸5min，反復上述操作3次。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
十三不同的是高溫預處理是按 下述步驟進行的將微藻培養液在121°C條件下加熱20min。其它步驟和參數與具體實施方 式十三相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
十三不同的是酸熱預處理取 50mL小球藻培養液，高速離心后，向濃縮的培養液中加入10mL，4mol/L HC1，浸泡lh，離心 后，加入50mL蒸餾水，煮沸5min。其它步驟和參數與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
十二至十九之一不同的是所述尼 羅紅溶液的溶劑為丙酮、乙醇、丙醇、二氧六環、四氫呋喃或甲乙酮。其它步驟和參數與具體 實施方式十二至十九之一相同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
十二至二十之一不同的是所 述尼羅紅溶液的濃度為0. 001g/L 0. 5g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
十二至二十 之一相同。
具體實施方式
二十二 本實施方式與具體實施方式
十二至二十之一不同的是所 述尼羅紅溶液的濃度為0. 01g/L 0. 2g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
十二至二十之 一相同。
具體實施方式
二十三本實施方式與具體實施十二至二十之一不同的是所述尼 羅紅溶液的濃度為0. 05g/L。其它步驟和參數與具體實施方式
十二至二十之一相同。
具體實施方式
二十四本實施方式與具體實施方式
十二至二十三之一不同的是 步驟五所述熒光強度-脂含量標準曲線測定方法如下步驟a、從同一藻種的培養液中取處 于不同生長階段的培養液；步驟b、將所取的培養液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條 件下離心lOmin，并用蒸餾水清洗3 5次后，取離心所得的微藻生物質，并在_70度條件 下凍干獲得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸餾水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振蕩anin后，超聲破碎lmin，再加入Iml氯仿振蕩lmin，再加入Iml蒸餾水，再振蕩lmin，然后 在4000r/min條件下離心5min，離心后，取氯仿相轉移到另一試管，再向原管中加入2mL氯 仿提取，重復三次。將得到的氯仿相氮吹干到質量恒定，稱重計算得到微藻脂含量；步驟C、 將所取的培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液，取IOmL稀釋液，然后加入IOOyL 尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm 之間的熒光強度，熒光強度記為XI，將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條 件下離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下 染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒 光強度記為X2，取稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm 之間的熒光強度，熒光強度記為X3，按X1-(X2+X;3)公式計算出最大熒光強度差值；步驟d、 以步驟b所測得的微藻脂含量為坐標，以步驟c尼羅紅染色的最大熒光強度差值為橫坐標， 繪制熒光強度-脂含量標準曲線。其它步驟和參數與具體實施方式
十二至二十之一相同。
具體實施方式
二十五本實施方式中對小球藻(Chlorella vulgaris)中的油脂 進行檢測，具體方法的是按下述步驟進行的
一、將含小球藻(Chlorella vulgaris)的溶液稀釋至0. lg/L，得到稀釋液；二、 取IOmL步驟一的稀釋液，然后加入100 μ L濃度為0. 05g/L的尼羅紅溶液，避光，快速混勻 10s,靜置15min后，選擇500nm作為激發波長，測定在發射波長530 650nm之間的熒光 強度；三、將步驟一稀釋后的含微藻的溶液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心 IOmin,取上清液作為空白，然后用尼羅紅染色，然后選擇500nm作為激發波長，測定在發射 波長530 650nm之間的熒光強度值；四、取步驟一的稀釋液，選擇500nm作為激發波長， 測定在發射波長530nm 650nm之間的熒光強度(見圖1)；五、計算尼羅紅染色后的稀釋 液與染色后的上清液和未染色稀釋液在發射波長530 650nm之間的最大熒光強度差值 (56.幻，將上述最大熒光強度差值根據熒光強度-脂含量標準曲線(Y = 0. 0927*X-0. 5144， R2 = 0. 9964，Y-溶液脂含量，mg/L, X-熒光強度差值)，計算微藻油脂含量(4.7%)0
本實施方式中的標準曲線的測定步驟a、從Chlorella vulgaris的純培養物中 取處于不同生長階段的培養液；步驟b、將所取的培養液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min 的條件下離心lOmin，并用蒸餾水清洗3 5次后，取離心所得的微藻生物質，并在_70度 條件下凍干為干藻粉。取0. Ig凍干藻粉，加入0. SmL蒸餾水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇， 振蕩anin后，超聲破碎lmin，再加入Iml氯仿振蕩lmin，再加入Iml蒸餾水，再振蕩lmin， 4000rpm離心5min，離心后，取氯仿相轉移到另一試管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重復 三次。將得到的氯仿相氮吹干到質量恒定，稱重計算得到微藻脂含量。步驟以c將所取的 培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液，取IOmL稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶 液，避光下染色，選擇500nm作為激發波長，測定在發射波長530 650nm之間的熒光強度， 熒光強度記為XI，將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心lOmin， 取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇500nm 作為激發波長，測定在發射波長530 650nm之間的熒光強度，熒光強度記為X2，取稀釋液， 選擇500nm作為激發波長，測定在發射波長530nm 650nm之間的熒光強度，熒光強度記為 X3，按X1-(X2+X;3)公式計算出最大熒光強度差值；步驟d、以步驟b所測得的微藻脂含量為 坐標，以步驟c尼羅紅染色的最大熒光強度差值為橫坐標，繪制熒光強度-脂含量標準曲線(圖2)
以丙酮作為溶劑，配制尼羅紅染色液。通過對預處理方法、尼羅紅濃度、染色時 間等條件的優化，建立了微藻油脂含量的快速檢測方法。與直接染色、凍融、高溫等預處 理方法相比，超聲預處理進行染色培養液的熒光強度最大，靈敏度最高；當尼羅紅濃度在 0. 05g/L 1. Og/L時，隨著尼羅紅濃度的增加，培養液的熒光強度有所下降，實驗結果顯 示0.05g/L的尼羅紅溶液效果最好。染色時間和光照的實驗結果表明，在避光、染色時間 15min時，培養液的熒光強度最大，靈敏度最高。該方法適于小球藻脂含量的快速檢測，應用 該方法測定藻細胞脂含量，可在Ih內完成，并且所需樣品量不超過40mL，可以直接用于藻 類培養液脂含量的測定，與稱重法、核磁共振法相比，由于省略了干燥步驟，因此減少了總 消耗時間，降低了成本。而且尼羅紅法所需樣品量少，因此還適用于科研或小批量微藻油脂 生產時的測定。盡管尼羅紅法的脂含量測定范圍與相對偏差與稱重法和核磁共振法相比較 差，但是已經可以滿足生產過程中的需要。三種方法的具體性能比較見表1。
表1.不同油脂測定方法比較表
權利要求
1.微藻油脂的檢測方法，其特征在于微藻油脂的檢測方法是按下述步驟進行的一、 將微藻培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一的稀釋液，然后 加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長 450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為 10000r/min的條件下離心lOmin，取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼 羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之 間的熒光強度，熒光強度記為X2 ；四、取步驟一的稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長， 測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X3 ；五、按X1_(X2+X3)公式 計算出最大熒光強度差值，然后根據熒光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂含量；即完 成了微藻油脂的檢測。
2.根據權利要求1所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟一中稀釋微藻培養液 用的溶劑為蒸餾水、自來水、去離子水、超凈水或礦泉水。
3.根據權利要求2所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟二所述尼羅紅溶液的 溶劑為丙酮、乙醇、丙醇、二氧六環、四氫呋喃或甲乙酮。
4.根據權利要求3所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟二所述尼羅紅溶液的 濃度為 0. 01g/L 0. 5g/L。
5.根據權利要求3所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟二所述尼羅紅溶液的 濃度為0. 05g/L。
6.根據權利要求1-5中任一項權利要求所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟 五所述熒光強度-脂含量標準曲線測定方法如下步驟a、從同一藻種的培養液中取處于不 同生長階段的培養液；步驟b、將所取的培養液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下 離心lOmin，并用蒸餾水清洗3 5次后，取離心所得的微藻生物質，并在_70度條件下凍干 獲得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸餾水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振蕩^iin后， 超聲破碎lmin，再加入Iml氯仿振蕩lmin，再加入Iml蒸餾水，再振蕩lmin，然后在4000r/ min條件下離心5min，離心后，取氯仿相轉移到另一試管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重 復三次，將得到的氯仿相氮吹干到質量恒定，稱重計算得到微藻脂含量；步驟c、將所取的 培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液，取IOmL稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶 液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒 光強度，熒光強度記為XI，將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心 IOmin,取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇 400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為 X2，取稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光 強度，熒光強度記為X3，按Xl- (X2+X3)公式計算出最大熒光強度差值；步驟d、以步驟b所 測得的微藻脂含量為坐標，以步驟c尼羅紅染色的最大熒光強度差值為橫坐標，繪制熒光 強度-脂含量標準曲線。
7.微藻油脂的檢測方法，其特征在于微藻油脂的檢測方法是按下述步驟進行的微藻 油脂的檢測方法是按下述步驟進行的一、將微藻培養液預處理，然后稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液；二、取IOmL步驟一的稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染 色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為Xl ；三、將步驟一稀釋液在溫度為4°c、轉速為lOOOOr/min的條件下離心lOmin， 取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為X2 ；四、 取步驟一的稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的 熒光強度，熒光強度記為X3 ；五、按X1-(X2+X;3)公式計算出最大熒光強度差值，然后根據熒 光強度-脂含量標準曲線計算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的檢測。
8.根據權利要求7所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于所述微藻培養液的預處理 采用蒸餾水清洗預處理、二甲基亞砜預處理、超聲預處理、凍融預處理、高溫預處理或酸熱 預處理進行的。
9.根據權利要求7或8所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于所述尼羅紅溶液的濃 度為 0. 01g/L 0. 5g/L。
10.根據權利要求9中任一項權利要求所述的微藻油脂的檢測方法，其特征在于步驟 五所述熒光強度-脂含量標準曲線測定方法如下步驟a、從同一藻種的培養液中取處于不 同生長階段的培養液；步驟b、將所取的培養液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下 離心lOmin，并用蒸餾水清洗3 5次后，取離心所得的微藻生物質，并在_70度條件下凍干 獲得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸餾水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振蕩^iin后， 超聲破碎lmin，再加入Iml氯仿振蕩lmin，再加入Iml蒸餾水，再振蕩lmin，然后在4000r/ min條件下離心5min，離心后，取氯仿相轉移到另一試管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重 復三次，將得到的氯仿相氮吹干到質量恒定，稱重計算得到微藻脂含量；步驟c、將所取的 培養液稀釋至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀釋液，取IOmL稀釋液，然后加入100 μ L尼羅紅溶 液，避光下染色，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒 光強度，熒光強度記為XI，將步驟一稀釋液在溫度為4°C、轉速為lOOOOr/min的條件下離心 IOmin,取上清液作為空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼羅紅溶液，避光下染色，選擇 400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光強度，熒光強度記為 X2，取稀釋液，選擇400 600nm作為激發波長，測定在發射波長450 700nm之間的熒光 強度，熒光強度記為X3，按Xl- (X2+X3)公式計算出最大熒光強度差值；步驟d、以步驟b所 測得的微藻脂含量為坐標，以步驟c尼羅紅染色的最大熒光強度差值為橫坐標，繪制熒光 強度-脂含量標準曲線。
全文摘要
微藻油脂的檢測方法，它屬于油脂檢測領域。本發明解決了稱重法所需樣品大、耗費時間長的技術問題。本發明方法一、將微藻培養液稀釋，得到稀釋液；二、測定稀釋液染色后的熒光強度；三、將稀釋液離心，取上清液測定染色后的熒光強度；四、取稀釋液，測定未染色時的熒光強度；五、計算最大熒光強度差值，根據熒光強度-脂含量標準曲線，計算微藻油脂含量。本發明方法適用對小球藻、柵藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、輪藻等單細胞藻類進行檢測，也可對細胞破碎預處理后的大型藻類進行檢測。
文檔編號G01N21/64GK102033059SQ20101056397
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者馮玉杰, 劉佳, 張大偉, 李超 申請人:哈爾濱工業大學