專利名稱：一種用于肝癌早期診斷的蛋白質指紋圖譜模型的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用飛行質譜技術檢測人肝癌血清，以獲得血清腫瘤標志物的方法，為肝癌的早期診斷提供實驗基礎。
背景技術：
肝癌(liver cancer)是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，肝癌起病常隱匿，多在肝病隨訪中或體檢普查中應用AFP及B型超檢查偶然發現肝癌。此時病人既無癥狀，體格檢查亦缺乏腫瘤本身的體征，此期稱之為亞臨床期。早期癥狀肝癌從第一個癌細胞形成發展到有自覺癥狀，大約需要2年時間，在此期間，病人可無任何癥狀或體征，少數病人會出現食欲減退，上腹悶脹、乏力等，有些病人可能輕度肝腫大。肝癌一旦出現癥狀，而來就診者其病程大多已進入中晚期。中、晚期癥狀肝癌的典型癥狀和體征一般出現于中、晚期，主要有肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。臨床上一般采取西醫的手術、放化療與中藥結合療法，但晚期患者因癌細胞擴散而治愈率較低，因此做到肝癌的早期發現、早期診斷、早期治療具有非常重要的意義。近年來，蛋白質組學已成為檢測和篩查腫瘤標志物的重要手段之一。表面加強激光解析電極一飛行時間質譜技術是最近幾年發展起來的一種新的蛋白質組學研究方法， 它能夠直接從未處理的生物樣品獲取蛋白質組圖譜。基于此技術開發的蛋白質芯片可以非特異性或特異性地結合各種蛋白質，并在質譜儀中受到激光轟擊，各種結合蛋白質會被激發而形成氣化離子，根據不同電離子在電場中飛行的時間長短，形成強弱不同的質譜峰，進而形成圖譜用于分析。近年來該技術在差異表達蛋白質組、蛋白質相互作用及疾病檢測方面得到了廣泛的應用，尤其適合于多肽及低分子量蛋白質譜分析。該技術在尋找前列腺、膀胱、乳腺等疾病的診斷標記物方面已經取得了較大進展。
發明內容
本發明利用Bio-Rad公司的蛋白質飛行時間質譜儀系統，檢測早期肝癌和健康人血清的蛋白質譜，利用軟件分析肝癌與正常人血清對照蛋白質組的差異，發表肝癌相關的蛋白質譜，并構建診斷模型，用于診斷早期肝癌。本發明將早期肝癌和健康人血清分別利用Bio-Rad公司蛋白質芯片檢測，得到數據利用該公司的Biosystems軟件的Biomarker wizard功能，分別對肝癌和正常組樣品的蛋白質波譜進行比較，得出特異的蛋白質圖譜，再根據統計分析發現肝癌與正常組有統計學顯著差異(P < 10-e5)的蛋白質峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a軟件對肝癌與對照組差異顯著特異蛋白質進行分析，采用三倍交叉證實的方法抽樣，重復抽樣1000 次，得到1000個決策樹。從中選出交叉證實正確率最高的20個決策樹對盲法篩選組進行歸類預測，建立了肝癌與正常人蛋白質指紋圖譜模型。利用該指紋質譜模型，將受檢人血清中相應的蛋白質的質荷比與本發明指紋圖譜模型逐一進行比對，可為早期肝癌診斷提供輔助指導。
指紋質譜模型的檢測方法如下1.血清標本制備肝癌患者術前血和正常對照外周靜脈血采集后立即放入4°C冰箱。檢測時，融解冰凍血清，離心，取血清樣品加緩沖液，振搖。2.平衡芯片將醋酸鈉溶液加入芯片的加樣孔中，平衡芯片2次，每次5min。3.血清樣品稀釋取血清樣品，加入尿素，振蕩30min，加入醋酸鈉溶液中，混勻稀釋。4.芯片上樣取稀釋后的血清樣品加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育90min。5.樣品洗脫取醋酸鈉溶液加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。取去離子水沖洗芯片。6.芯片和蛋白質結合反應取能量吸收劑加入芯片加樣孔，待自然揮發后再重復加吸收劑一次。7.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機中，用加有標準蛋白質的芯片校正儀器。設置芯片閱讀儀參數，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1軟件收集數據。其中縱坐標為蛋白質相對含量， 橫坐標為蛋白質質荷比(M/Z)。經過臨床試用，20個決策樹模型可以較好地區分早期肝癌和正常對照，預測準確率為85%。
圖1指紋質譜模型的檢測方法流程。
具體實施例方式1.材料1. 1檢測血清
取受試者靜脈血5ml，在4度冰箱中靜置2小時后離心(4000rpm，5min).取血清， 置低溫冰箱(負80度)或液氮保存，備用。1. 2所需主要試劑與儀器乙酸鈉、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均購自上海化學試劑公司。CMW蛋白芯片和蛋白質芯片閱讀機(PBS II型)購自美國Bio-Rad公司。2.方法2. 1平衡芯片取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸鈉(NaAc)溶液加入芯片的加樣孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2血清樣品稀釋取 6ul 血清樣品，加入 12ul 9mmol/L 尿素，振蕩 30min，加入 222ul 50mmol/L pH 為3. 0的NaAc溶液中，混勻稀釋。2.3.芯片上樣取稀釋后的血清樣品200ul/孔加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育90mino2. 4.樣品洗脫取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。 取300ul/孔的去離子水沖洗芯片。2.5.芯片和蛋白質結合反應取能量吸收劑SPA(含飽和白芥子酸溶液與質量分數50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加樣孔，待自然揮發后再重復加SPA —次。2. 6.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機中，用加有AU-in_0ne標準蛋白質的NP20芯片校正儀器至0. 1 %范圍內。芯片閱讀儀參數設置激光強度150，檢測靈敏度7，優化范圍1984. 2 9921 u，最高分子量49605u，芯片上的每個點采集130次。用CipheEgen Proteinchip 3. 1. 1軟件收集數據。其中縱坐標為蛋白質相對含量，橫坐標為蛋白質質荷比(M/Z)。將分析得到的受檢者的血清蛋白波譜根據指紋質譜模型(圖1)中特異蛋白質質荷比進行比較， 以判斷受檢者是否患有肝癌(見實施實例)。實驗實例取受檢者血清，經檢驗得到其血清蛋白圖譜，按肝癌與正常組鑒別的蛋白質指紋質譜模型，運用20個決策樹來對受檢者進行預測，結果顯示20個模型中有1個(5%)決策樹預測結果認為該樣本是病例組，19個(95% )認為是對照組，投票結果以多數為準，即把受檢者歸為病例組，即早期肝癌病人。如果20個決策樹有大于50%的決策樹將受檢者歸為對照組，則該受檢者為正常人。以上是對本發明的描述而非限定，基于本發明思想的其它實施方式，均在本發明的保護范圍之中。
權利要求
1.用于肝癌早期診斷的蛋白質指紋圖譜模型，其特征在于由蛋白質芯片飛行時間質譜儀系統檢測的血清蛋白質圖譜經過軟件統計分析得到肝癌患者多個特異蛋白質的質荷比m/z，利用這些差異m/z構建了 20個決策樹，決策樹分別采用了 m/z4476，m/zll812, m/ z4095, m/z2819, m/z6198, m/z3361, m/z3361, m/z3377, m/z5639, m/z4820, m/z4259, m/ zll812, m/z8699。
全文摘要
本發明涉及醫學診斷技術領域，是一種可以用于早期肝癌診斷的蛋白質指紋圖譜模型。本發明用蛋白質芯片飛行時間質譜系統，檢測正常人及早期肝癌病人的外周血清樣品，找出與肝癌患者差異顯著的特異蛋白質峰，根據各蛋白質峰的質荷比(m/z)，采用決策樹算法，得到擁有20個決策樹的蛋白質指紋圖譜模型。只要將檢測人血清中相應的蛋白質的m/z與本發明的模型進行分析，依據決策樹少數服從多數的原則，就可以初步用于肝癌診斷。其預測準確率為85％。
文檔編號G01N27/62GK102323325SQ20101056167
公開日2012年1月18日 申請日期2010年11月25日 優先權日2010年11月25日
發明者曾華宗 申請人:上海聚類生物科技有限公司