專利名稱：斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，可用于科研、疾病診斷和食 品安全領域。
背景技術：
金標免疫檢測技術是繼同位素、熒光素和酶標記技術之后的一種新型免疫標記技 術。該方法簡便、快捷、不需要特殊設備，結果判定有極好的可視性。適用于‘床邊’檢測、 疾病普查和流行病監測，以及海關、食品安全和養殖業等領域。常用的金標免疫檢測包括側向免疫金層析法(Bilateral immune-chromatographic assay)禾口SE；1^ 1:^^50 ! (Dot immune-gold filtration assay)。側向免疫金層析法是受測樣本和膠體金標記探針在一種微孔膜(例如硝酸纖維素 膜)上受虹吸作用做側向運動，與預先包被在膜另一端的捕獲探針相遇而聚集，呈現肉眼可 見的紅色線條。由于受測樣本和標記探針是在混合狀態下做同步運動，這種方法在檢測抗 體時會因為待測樣本中的非特異性抗體存在而消耗標記探針，從而降低檢測的靈敏度。在 這種情況下通常使用雙抗原夾心法取代間接抗體法。但雙抗原夾心法要求包被抗原與標記 抗原的抗原決定簇有盡可能大的差異而避免競爭性抑制，從而對試劑質量和成本提出更高 的要求，成為該技術的主要缺陷。競爭法則以不顯色為陽性結果，在很多情況下給結果判定 帶來不便。所以，目前該技術的臨床應用受到局限。斑點免疫金滲濾法是讓待測樣本垂直滲濾過微孔膜(例如硝酸纖維素膜)，被膜 上包被的捕獲探針捕獲，再以同樣方式讓膠體金標探針滲濾過微孔膜，與被捕獲的配體結 合后聚集形成肉眼可見的紅色斑點。這種方法的缺陷是大部分待測樣本和標記探針從斑點 以外的非相關區域流失，影響檢測靈敏度，致使該技術尚未在臨床檢驗中廣泛使用。
發明內容
本發明的目的是提供一種高靈敏度和高準確度的斑點免疫金定向滲濾檢測試劑 盒，以克服現有技術的不足。本發明的另一目的是提供斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒在科研、疾病診斷和 食品安全領域中的應用。本發明的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒包括斑點免疫金滲濾卡片，納米膠體 金或乳膠微球標記的檢測探針，陰性和陽性標準品以及沖洗液，其工作原理是在傳統斑點 免疫金滲濾法的基礎上，在微孔膜與吸水膜之間設置一個滲濾限制裝置，使待測樣本和膠 體金標探針依次沿著包被探針所覆蓋的區域滲濾，避免試劑在其它非相關區域的流失，以 提高檢測靈敏度。本發明實現過程如下一種斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，包括斑點免疫金滲濾卡片，納米膠體金或乳 膠微球標記的檢測探針，陰性和陽性標準品以及沖洗液，其特征在于該斑點免疫金滲濾卡片為斑點免疫金定向滲濾卡片，其能夠使待測樣本和膠體金標探針依次沿著包被探針覆蓋 的區域滲濾。所述的斑點免疫金定向滲濾卡片有以下兩種實現方式，可以使待測樣本和膠體金 標探針依次沿著包被探針覆蓋的區域滲濾。其中一種實現方式是在傳統斑點免疫金滲濾 法的基礎上，在具有微孔和層析作用的微孔膜與吸水墊之間設置滲濾限制層，使待測樣本 和金標探針通過微孔膜時先向膜中央聚集，然后通過膜中央的探針包被區垂直滲濾至吸水 墊，從而降低試劑在其它非相關區域里的流失，提高檢測靈敏度。這種斑點免疫金定向滲濾 卡片從上到下由表層、微孔膜、滲濾限制層和吸水墊4層組成，表層為非吸水材料，中央有 一開孔；微孔膜為一種與蛋白分子有親和力的微孔膜(孔徑為0. 2-5 μ m的硝酸纖維素膜、 醋酸纖維素膜或PVDF膜)，其上至少包被一種探針；滲濾限制層為非吸水材料(非吸水高分 子薄膜、雙面膠或防水涂料)，中央有一開孔。另一種實現方式是從上到下由表層、微孔膜和吸水墊3層組成，表層為非吸水材 料，中央有一開孔；微孔膜為一種與蛋白分子有親和力的微孔膜(孔徑為0. 2-5 μ m的硝酸 纖維素膜、醋酸纖維素膜或PVDF膜)，微孔膜上至少包被一種探針；吸水墊中央設置有凹 槽，凹槽的中心設置有與包被探針形狀大小相匹配的突起，探針包被區域與吸水墊突起部 分緊密接觸，微孔膜其余部分與吸水墊非接觸，也就是微孔膜的其余部分與吸水墊相對應 的凹槽懸空隔離。使用微量點樣或噴涂技術，將1-2μ 1捕獲探針(lmg/ml)在微孔膜中央固定成直 徑為2 3mm的圓形斑點或2X IOmm2的條形，常溫或37°C吹風干燥，用1%牛血清白蛋白、 小牛血清或脫脂牛奶浸泡微孔膜，以封閉膜上的空白結合點，常溫或37°C吹風干燥。所述的斑點免疫金定向滲濾卡片表層開孔為圓形或橢圓形，開孔直徑8 12mm。所述的斑點免疫金定向滲濾法卡片表層為PVC、ΡΕ、PP、PS、ABS塑料、或其它非吸 水高分子材料。所述的吸水墊為2_3mm厚的吸水紙板、吸水纖維板或吸水棉墊。所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒還可以設置有與卡片表層開孔適配的 漏斗狀濾過膜，與卡片表層中央的微孔膜適配，并可自由拆卸。該濾過膜為孔徑0. 2-0. 45 微米濾紙制成，吸附有抗凝劑，可濾除樣本中的有形成分。所述的納米膠體金或乳膠微球標記的檢測探針是用10-40nm膠體金或乳膠微球 連接的檢測探針，包括抗原、半抗原、抗體、蛋白分子、多肽、核酸，這些標記探針在滲濾過程 中與配體結合后聚集，呈現肉眼可見的顏色。所述的沖洗液為磷酸緩沖液，Tris-緩沖液，或含有Tween 20的緩沖液。本發明斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒可用于科研、食品安全和疾病診斷，檢 測抗原、半抗原、抗體、蛋白分子、多肽、核酸；可檢測食品中的藥物殘留和化學物質殘留； 可檢測多種疾病標志物感染性疾病包括單純泡疹病毒1/2、水痘病毒、EB病毒、巨細胞病毒、人類泡疹病 毒-6/8 ；流感病毒A/B、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、非典病毒、肝炎、 脊髓灰質炎病毒、流行性乙腦病毒、出血熱病毒、多價禽流感病毒、艾滋病毒1/2、狂犬病毒； 腦膜炎球菌、布魯氏菌、破傷風桿菌、梅毒、肺炎支原體、兔弓形體、百日咳桿菌、多價肺炎球 菌、多價大腸桿菌、多價白喉桿菌、結核桿菌、傷寒桿菌、幽門螺旋體、血吸蟲；自身免疫性疾病包括雙鏈DNA、組蛋白、心磷脂、核仁抗原、著絲粒抗原、髓過氧化酶、 蛋白激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲狀腺球蛋白、 線粒體抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、腎小球基底膜抗原、膠原I-IV、髓磷脂基本蛋白、蛋白 脂質蛋白、髓磷脂神經膠質細胞糖蛋白、以及類風濕因子和環瓜氨酸多肽；腫瘤標志物包括癌抗原27.四、癌胚抗原、癌抗原19. 9、甲胎球蛋白、絨毛膜促性腺 激、癌抗原125、抗-癌抗原27.四、前列腺癌特異性抗原；心腦血管疾病包括肌紅蛋白、肌鈣蛋白I、超敏-C反應蛋白、磷酸肌酸激酶MB、新型脂 肪酸結合蛋白；家禽家畜疾病包括雞禽流感病毒、雞新城疫病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒、豬口蹄 疫、豬藍耳病病毒、偽狂犬病毒、犬細小病毒；寄生蟲病包括豬蛔蟲病、旋毛蟲病、姜片吸蟲病、囊尾蟲病、肉孢子蟲病、弓形蟲病、棘 頭蟲病；豬肺線蟲病、豬鞭蟲病、豬類圓線蟲病、豬結節蟲病、豬腎蟲病、豬胃蟲圓線蟲病、牛 焦蟲病、牛球蟲病、牛住肉孢子蟲病、牛弓形蟲病、牛胎毛滴蟲病、牛囊尾蚴病、牛棘球蚴病、 牛肝片形吸蟲病、牛血吸蟲病、羊肝片吸蟲病、羊血吸蟲病、羊前后盤吸蟲病、羊雙腔吸蟲 病、羊腦多頭蚴病、羊棘球蚴病、羊細頸囊尾蚴病、羊胃腸線蟲病、羊肺線蟲病、羊絳蟲病、羊 血孢子蟲病、羊球蟲病、羊泰勒蟲病；疫苗效價測定包括牛痘疫苗、脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、腺病毒疫苗、黃熱病疫苗、 風疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗、水痘疫苗、輪狀病毒疫苗、乙型腦炎疫苗、 狂犬病疫苗、流行性出血熱疫苗、卡介苗、傷寒疫苗、斑疹傷寒疫苗、霍亂疫苗、布氏菌疫苗、 炭疽疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎鏈球菌疫苗、沙門Vi多糖疫苗、腦膜炎球 菌A/C疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎鏈球菌疫苗、沙門Vi多糖疫苗、腦膜炎 球菌A/C疫苗、流感嗜血桿菌疫苗、白喉疫苗，SARS疫苗。發明的優點與積極效果(1)本發明所述的斑點免疫金定向滲濾技術與傳統斑點免疫金滲濾法相比，顯著提高 了檢測靈敏度。(2)本發明與免疫金層析法相比，制作簡單，試劑消耗量少，檢測范圍廣，可操作性 更好。
( 3 )本發明技術成本低，適合大規模推廣。
圖1是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片(4層)的結構示意圖； 圖2是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片(4層)的滲濾方向示意圖； 圖3是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片(3層)的結構示意圖；圖4是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片(3層)的滲濾方向示意圖； 圖5是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片檢測的陽性結果示意圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發明斑點免疫金定向滲濾卡片從上到下由①非吸水材料制成的表 層、②包被有捕獲探針的微孔膜、③非吸水材料制成的滲濾限制膜和④吸水墊4層組成，四層復合后成為本發明斑點免疫金定向滲濾卡片。如圖2所示，將斑點免疫金定向滲濾卡在室溫下水平放置，將受測血清或血漿做 適當稀釋(1: (5-10))，用微量移液器將50-100μ1該稀釋樣本滴注到卡片中央的微孔膜 上，待其滲濾完后滴注50-100 μ 1 PBS沖洗液；待其滲濾完后滴注50-100 μ 1金標檢測探 針；待其滲濾完后滴注50-100 μ 1 PBS沖洗液；用同樣方法對陽性和陰性標準品檢測，作為 檢測過程的質量控制。肉眼觀察捕獲探針區域的顯色反應紅色斑點為陽性，不顯色為陰 性。結果判定若陽性對照和受測樣本均為陽性，則判定受測樣本為陽性；若陽性對照為陽 性，受測樣本為陰性，則判定受測樣本為陰性；若陽性對照為陰性，說明試驗過程有誤，應重 復。整個過程大約需要3-5分鐘。預先對受測樣本做梯度稀釋，可對被檢品滴度作定量分 析。如圖3、4所示，本發明斑點免疫金定向滲濾卡片從上到下由非吸水材料制成的表 層①、包被有捕獲探針的微孔膜②和吸水墊④3層組成，三層復合后成為本發明斑點免疫 金定向滲濾卡片。吸水墊④中央設置有凹槽，凹槽的中心設置有與包被探針形狀大小相匹 配的突起，探針包被區域與吸水墊突起部分緊密接觸，微孔膜的其余部分與吸水墊相對應 的凹槽懸空隔離，非接觸，以保證溶液按照箭頭所指方向定向滲濾，富集樣品，提高檢測靈 敏度。本發明還可以在斑點免疫金定向滲濾卡中央的微孔膜上加置一個過濾膜，用微量 移液器將5-10 μ 1血清、血漿或全血樣本滴注到過濾膜上，隨即滴注50-100 μ 1 PBS沖洗 液，待其滲濾完后滴注50-100 μ 1金標檢測探針，以下步驟同上。圖5是本發明斑點免疫金定向滲濾卡片檢測的陽性結果示意圖，根據捕獲探針的 包被區域形狀顯示為①圓斑狀或②條狀。實施例1斑點免疫金定向滲濾試劑盒的制備斑點免疫金定向滲濾卡片的表層為白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直徑為 0. 8cm的圓孔；滲濾卡片的微孔膜為直徑為1. 2cm的NC膜(微孔為0. 45)。使用微量點樣或 噴涂技術將1-2 μ 1捕獲探針(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直徑為2mm的圓型斑點(或 條狀)，室溫或吹風干燥后，浸入1%牛血清1分鐘，室溫或吹風干燥后室溫或吹風干燥20分 鐘；滲濾卡片的滲濾限制層為5X4X0. 5cm3的雙面膠薄膜，中央開有一直徑為2mm的圓孔 (或條狀)，與微孔膜中央的包被探針區相對應；滲濾卡片的吸水墊為5X4X0. 3cm3的吸水 紙板。以上四層經不干膠依次緊密粘合，制成的卡片用鋁箔袋密封保存。陽性和陰性對照品分別為經標準品校對過的陽性和陰性樣品。金標捕獲探針為直 徑為20nM標記的檢測探針，沖洗液為0. IM的PBS緩沖液。或者，上述的滲濾限制層的雙面膠薄膜被省略，在滲濾卡片的吸水墊中央沖壓一 直徑為10mm、深為1. 5mm的圓形凹陷，凹陷中央保留一直徑為2mm的圓柱狀突起。將該吸水 墊與上述的微孔膜和PVC卡片依次由下而上緊密粘合，制成的卡片用鋁箔袋密封保存。實施例2雙斑點免疫金定向滲濾卡片的制作雙斑點免疫金定向滲濾卡片是在同一檢測孔中同時顯示陽性對照和檢測斑點。斑 點免疫金定向滲濾卡片的表層為白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直徑為Icm的 圓型或橢圓形開孔；滲濾卡片的微孔膜為直徑為1. 5cm的NC膜(微孔為0. 45)。使用微量 點樣或噴涂技術將1_2μ 1抗金標探針抗體(lmg/ml)和捕獲探針(lmg/ml)分別固定于微孔膜中央，二者相距4mm，呈直徑為2mm的圓型斑點(或條狀)，室溫或吹風干燥后，浸入 1%牛血清1分鐘，室溫或吹風干燥后室溫或吹風干燥20分鐘；滲濾卡片的滲濾限制層為 5X4X0. 5cm3的雙面膠薄膜，中央開有兩個直徑為2mm的圓孔(或條狀)，與微孔膜中央的2 個包被探針區相對應；滲濾卡片的吸水墊為5X4X0. 3cm3的吸水紙。以上四層經不干膠依 次緊密粘合，完成卡片的制作。制成的卡片用鋁箔袋密封保存待用。實施例3檢測抗原的斑點免疫金定向滲濾卡片(雙抗體法)的制作斑點免疫金定向滲濾卡片的表層為白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直徑為 0. 8cm的圓孔；滲濾卡片的微孔膜為直徑為1. 2cm的NC膜(微孔為0. 45)。使用微量點樣或 噴涂技術將1-2 μ 1捕獲抗體(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直徑為2mm的圓型斑點(或 線狀和環狀)，室溫或吹風干燥后，浸入1%牛血清1分鐘，室溫或吹風干燥后室溫或吹風干 燥20分鐘；其余操作同實施例1。實施例4檢測抗體的斑點免疫金定向滲濾卡片(間接抗體法)的制作斑點免疫金定向滲濾卡片的表層為白色5X4X0. 5cm3的PVC卡片，中央有一直徑為 0. 8cm的圓孔；滲濾卡片的微孔膜為直徑為1. 2cm的NC膜(微孔為0. 45)。使用微量點樣或 噴涂技術將1-2 μ 1抗原(捕獲探針)(lmg/ml)固定于微孔膜中央，呈直徑為2mm的圓型 斑點(或線狀和環狀)，室溫或吹風干燥后，浸入1%牛血清1分鐘，室溫或吹風干燥后室溫或 吹風干燥20分鐘；其余操作同實施例1。實施例5檢測乙肝病毒抗原(雙抗體法)試劑盒內容包括乙肝病毒表面抗原(HbsAg)、核心抗原(HbcAg)和e抗原(HbeAg)特 異性抗體分別包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，乙肝病毒陽性和陰性對照血清，20nm膠體 金標記的抗乙肝病毒表面抗原、核心抗原和e抗原特異性抗體，以及PBS沖洗液。操作過程 如下將受測血清或血漿用PBS做1 :10稀釋，用移液器將100 μ 1該稀釋樣本滴注在卡片 中央的微孔膜上，待滲濾后滴注100 μ 1 PBS緩沖液沖洗；待滲濾后滴注50 μ 1金標探針；待 滲濾后滴注100 μ 1 PBS緩沖液沖洗；觀測斑點顯色。陽性和陰性對照血清并行檢測作為質 量控制，同時與傳統斑點免疫金滲濾卡片做比較。對20例乙肝陽血清和20例正常對照檢 測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別 為95%和40% ；特異性均為100%ο實施例6檢測丙肝病毒抗體(間接抗體法)試劑盒內容包括重組丙肝病毒非結構抗原(HCVns)和核心抗原(HCVc)包被的斑點免 疫金定向滲濾卡片，丙肝病毒陽性和陰性對照血清，20nm膠體金標記的羊抗人IgG抗體，以 及PBS沖洗液。操作過程同實施例5.對20例丙肝血清和20例正常對照檢測結果顯示本 發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為85%和45% ； 特異性均為100%。實施例7檢測艾滋病毒(HIV)抗體(間接抗體法)試劑盒內容包括重組HIV1+2抗原包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，HIV陽性和陰性 對照血清，20nm膠體金標記的羊抗人IgG抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。對 20例HIV血清和20例正常對照檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳 統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為95%和40% ；特異性均為100%。實施例8檢測梅毒螺旋體抗體(間接抗體法)試劑盒內容包括重組梅毒螺旋體抗原包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，梅毒陽性和 陰性對照血清，20nm膠體金標記的羊抗人IgG抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例 5。對20例梅毒血清和20例正常對照檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法 和傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為95%和20% ；特異性均為100%。實施例9檢測流行性出血熱病毒(Hantan virus)抗體試劑盒內容包括重組流行性出血熱病毒包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，流行性出 血熱病毒陽性和陰性對照血清，20nm膠體金標記的羊抗人IgG+IgM抗體，以及PBS沖洗液。 操作過程同實施例5。對20例流行性出血熱病毒血清和20例正常對照檢測結果顯示本 發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金滲濾的靈敏度分別為90%和15% ；特 異性均為100%。實施例10檢測自身免疫性抗體試劑盒內容包括雙鏈DNA、組蛋白、心磷脂、核仁抗原、著絲粒抗原、髓過氧化酶、蛋白 激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲狀腺球蛋白、線粒 體抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、腎小球基底膜抗原、膠原ι-ιν、髓磷脂基本蛋白、蛋白脂質 蛋白、髓磷脂鞘神經膠質細胞糖蛋白、以及類風濕因子和環瓜氨酸多肽(CCP)分別包被的斑 點免疫金定向滲濾卡片，相關自身免疫性疾病對照血清和正常對照血清，20nm膠體金標記 的羊抗人IgG抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。其中，對20例類風濕性關節炎 血清和20例正常對照的抗CCP抗體檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和 傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為95%和30% ；特異性均為100%。實施例11使用斑點免疫金定向滲濾卡片檢測腫瘤標志物試劑盒內容包括癌抗原27. 29 (CA27. 29)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原19. 9(CA19. 9)、甲 胎球蛋白(AFP)、絨毛膜促性腺激(b-hCG)、癌抗原125(CA12Q、前列腺癌特異性抗原(PSA) 特異性抗體分別包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，相關腫瘤陽性和陰性對照血清，20nm膠 體金標記的相關腫瘤標志物抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。其中，對20例 PSA血清和20例正常對照檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點 免疫金滲濾法的靈敏度分別為65%和10% ；特異性均為100%。實施例12使用斑點免疫金定向滲濾卡片檢測心腦血管疾病生物標志物 試劑盒內容包括肌紅蛋白、肌鈣蛋白I、超敏-C反應蛋白、磷酸肌酸激酶MB和新型脂肪酸結合蛋白特異性抗體分別包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，陽性和陰性對照血清， 20nm膠體金標記的相關心腦血管疾病生物標志物抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施 例5。其中，對20例患者血清和20例正常對照的超敏-C反應蛋白檢測結果顯示本發明 所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為70%和15% ；特異 性均為100%。實施例13檢測食品中殘留化學物質-三聚氰胺試劑盒內容包括兔抗三聚氰胺抗體包被的斑點免疫金定向滲濾卡片，陽性和陰性對 照品，20nm膠體金標記的羊抗三聚氰胺抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。其中， 對20陽性樣品和20例正常樣品的檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和 傳統斑點免疫金滲濾法的靈敏度分別為100%和35% ；特異性均為100%。實施例14檢測家禽感染性疾病試劑盒內容包括滅活雞禽流感病毒和雞新城疫病毒抗原包被的斑點免疫金定向滲濾 卡片，雞禽流感血清、雞新城疫血清和正常雞血清對照品，20nm膠體金標記的羊抗雞IgM和 IgG抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。其中，對20雞禽流感血清和20例正常 血清樣品的檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金滲濾法 的靈敏度分別為90%和25% ；特異性均為100%。
實施例15檢測家畜感染性疾病試劑盒內容包括滅活豬細小病毒、豬圓環病毒、豬口蹄疫、豬藍耳病病毒抗原包被的 斑點免疫金定向滲濾卡片，感染血清和正常血清對照品，20nm膠體金標記的羊抗豬IgM和 IgG抗體，以及PBS沖洗液。操作過程同實施例5。其中，對20豬細小病毒感染血清和20 例正常血清樣品的檢測結果顯示本發明所述的斑點免疫金定向滲濾法和傳統斑點免疫金 滲濾法的靈敏度分別為90%和20% ；特異性均為100%。
權利要求
1.一種斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，包括斑點免疫金滲濾卡片，納米膠體金或 乳膠微球標記的檢測探針，陰性和陽性標準品以及沖洗液，其特征在于該斑點免疫金滲濾 卡片為斑點免疫金定向滲濾卡片，其能夠使待測樣本和膠體金標探針依次沿著包被探針覆 蓋的區域滲濾。
2.根據權利要求1所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述的斑 點免疫金定向滲濾卡片從上到下由表層、微孔膜、滲濾限制層和吸水墊4層組成，表層為非 吸水材料，中央有一開孔；微孔膜為一種與蛋白分子有親和力的微孔膜，其上至少包被一種 探針；滲濾限制層為非吸水材料，中央有一開孔，開孔與包被的探針相對應，形狀匹配。
3.根據權利要求2所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述的斑 點免疫金定向滲濾卡片滲濾限制層為PVC、ΡΕ、PP、PS、ABS塑料、雙面膠或防水涂料制成。
4.根據權利要求1所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述的斑 點免疫金定向滲濾卡片從上到下由表層、微孔膜和吸水墊3層組成，表層為非吸水材料，中 央有一開孔；微孔膜為一種與蛋白分子有親和力的微孔膜，微孔膜上至少包被一種探針； 吸水墊中央設置有凹槽，凹槽的中心設置有與包被探針形狀大小相匹配的突起，探針包被 區域與吸水墊突起部分緊密接觸，微孔膜其余部分與吸水墊非接觸。
5.根據權利要求2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于使用 微量噴涂技術，將捕獲探針固定在微孔膜中央成直徑為2 3mm的圓斑或2X IOmm2的條形。
6.根據權利要求2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述 的斑點免疫金定向滲濾卡片表層開孔為圓形或橢圓形，開孔直徑8 12mm。
7.根據權利要求6所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述的斑 點免疫金定向滲濾法卡片表層為PVC、PE、PP、PS、ABS塑料材料。
8.根據權利要求2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述 的斑點免疫金定向滲濾卡片的微孔膜為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或PVDF膜，孔徑為 0. 2-5微米。
9.根據權利要求2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述 的吸水墊為2-3mm厚的吸水紙板、吸水纖維板、吸水棉墊、吸水性樹脂或復合吸水材料。
10.根據權利要求1、2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所述 的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒還包括有與卡片表層開孔適配的漏斗狀過濾膜，該過 濾膜為孔徑為0. 2-0. 45微米濾紙制成，吸附有抗凝劑，濾除樣本中的有形成分。
11.根據權利要求1、2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所 述的納米膠體金或乳膠微球標記的檢測探針是用10-40nm膠體金或乳膠微球連接的檢測 探針，探針包括抗原、半抗原、抗體、蛋白分子、多肽、核酸，這些標記探針在滲濾過程中與配 體結合后聚集，呈現肉眼可見的顏色。
12.根據權利要求1、2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒，其特征在于所 述的沖洗液為磷酸緩沖液，Tris-緩沖液，或含有Tween 20的緩沖液。
13.權利要求1、2或4所述的斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒在科研、食品安全和疾 病診斷中的應用。
14.根據權利要求13所述用途，其特征在于可檢測抗原、半抗原、抗體、蛋白分子、多 肽、核酸；可檢測食品中的藥物殘留和化學物質殘留；可檢測多種疾病標志物感染性疾病包括單純泡疹病毒1/2、水痘病毒、EB病毒、巨細胞病毒、人類泡疹病 毒-6/8 ；流感病毒A/B、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、非典病毒、肝炎、 脊髓灰質炎病毒、流行性乙腦病毒、出血熱病毒、多價禽流感病毒、艾滋病毒1/2、狂犬病毒； 腦膜炎球菌、布魯氏菌、破傷風桿菌、梅毒、肺炎支原體、兔弓形體、百日咳桿菌、多價肺炎球 菌、多價大腸桿菌、多價白喉桿菌、結核桿菌、傷寒桿菌、幽門螺旋體、血吸蟲；自身免疫性疾病包括雙鏈DNA、組蛋白、心磷脂、核仁抗原、著絲粒抗原、髓過氧化酶、 蛋白激酶3、核蛋白、‘史密斯’抗原、Jo-I抗原、Scl-70抗原、SS-A/B抗原、甲狀腺球蛋白、 線粒體抗原、心肌抗原、平滑肌抗原、腎小球基底膜抗原、膠原ι-ιν、髓磷脂基本蛋白、蛋白 脂質蛋白、髓磷脂神經膠質細胞糖蛋白、以及類風濕因子和環瓜氨酸多肽；腫瘤標志物包括癌抗原27.四、癌胚抗原、癌抗原19. 9、甲胎球蛋白、絨毛膜促性腺 激、癌抗原125、抗-癌抗原27.四、前列腺癌特異性抗原；心腦血管疾病包括肌紅蛋白、肌鈣蛋白I、超敏-C反應蛋白、磷酸肌酸激酶MB、新型脂 肪酸結合蛋白；家禽家畜疾病包括雞禽流感病毒、雞新城疫病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒、豬口蹄 疫、豬藍耳病病毒、偽狂犬病毒、犬細小病毒；寄生蟲病包括豬蛔蟲病、旋毛蟲病、姜片吸蟲病、囊尾蟲病、肉孢子蟲病、弓形蟲病、棘 頭蟲病；豬肺線蟲病、豬鞭蟲病、豬類圓線蟲病、豬結節蟲病、豬腎蟲病、豬胃蟲圓線蟲病、牛 焦蟲病、牛球蟲病、牛住肉孢子蟲病、牛弓形蟲病、牛胎毛滴蟲病、牛囊尾蚴病、牛棘球蚴病、 牛肝片形吸蟲病、牛血吸蟲病、羊肝片吸蟲病、羊血吸蟲病、羊前后盤吸蟲病、羊雙腔吸蟲 病、羊腦多頭蚴病、羊棘球蚴病、羊細頸囊尾蚴病、羊胃腸線蟲病、羊肺線蟲病、羊絳蟲病、羊 血孢子蟲病、羊球蟲病、羊泰勒蟲病；疫苗效價測定包括牛痘疫苗、脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、腺病毒疫苗、黃熱病疫苗、 風疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗、水痘疫苗、輪狀病毒疫苗、乙型腦炎疫苗、 狂犬病疫苗、流行性出血熱疫苗、卡介苗、傷寒疫苗、斑疹傷寒疫苗、霍亂疫苗、布氏菌疫苗、 炭疽疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎鏈球菌疫苗、沙門Vi多糖疫苗、腦膜炎球 菌A/C疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、鼠疫疫苗、肺炎鏈球菌疫苗、沙門Vi多糖疫苗、腦膜炎 球菌A/C疫苗、流感嗜血桿菌疫苗、白喉疫苗，SARS疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種斑點免疫金定向滲濾檢測法試劑盒及其應用。本試劑盒包括斑點免疫金滲濾卡片，納米膠體金或乳膠微球標記的檢測探針，陰性和陽性標準品以及沖洗液，技術特征在于該斑點免疫金滲濾卡片為斑點免疫金定向滲濾卡片，其能夠使待測樣本和膠體金標探針依次沿著包被探針覆蓋的區域滲濾。本發明制作簡單，試劑消耗量少，檢測范圍廣，可操作性好，與傳統斑點免疫金滲濾法相比，顯著提高了檢測靈敏度。
文檔編號G01N33/543GK102053153SQ20101055931
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月25日 優先權日2010年11月25日
發明者廖幫琳, 林遠 申請人:西安微通生物技術有限公司