結合人TNFα的人抗體的制作方法

專利名稱：結合人TNFα的人抗體的制作方法
結合人TNF α的人抗體本申請是申請日為1997年2月10號，申請號為97193635. 8的發明名稱為“結合 人TNFa的人抗體”的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
腫瘤壞死因子α (TNFa)是由許多細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞)產生 的細胞因子，其原始鑒定是基于其誘導某些小鼠腫瘤壞死的能力(參見例如Old，L(1985) Science 230 =630-632) 0隨后，一個與惡病質相關的名稱為惡病質素的因子表明是與 TNFa相同的分子。據信TNF α參與介導休克(參見例如Beutler，B.和Cerami，Α. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57 :505-518 ；Beutler, B.禾口 Cerami, Α. (1988)Annu. Rev. Immumo 1. 7 625-65 。另外，據信TNFa參與各種各樣的其它人類疾病和紊亂的病理生理學，包括膿毒 癥、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(參見例如Moeller，Α.等(1990) Cytokine 2 :162-169 ；Moeller 等的美國專利 5，231，024 號；Moeller, A.等的歐洲專利 公開洸0 610 Bl 號，Vasilli，P. (1992)Annu. Rev. Immunol. 10 :411-452 ；Tracey, K. J.和 Cerami, Α. (1994) Annu. Rev. Med. 45 :491-503)。由于人TNFa (hTNF α )在各種各樣的人體紊亂中的有害作用，已設計治療策略 以抑制或抵消hTNFa的活性。特別是，已尋找與hTNFa結合或中和hTNFa的抗體做為 抑制hTNFa活性的手段。一些最早的這種抗體是由用hTNFa免疫的小鼠的淋巴細胞 制備的雜交瘤分泌的小鼠單克隆抗體(mAbs)(參見例如Hahn T ；等，(1985)ft~OC Natl Acad SciUSA 82 :3814-3818 ；Liang, C-M.等(1986)Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 847-854 ；Hirai, M.等(1987)J. Immunol. Methods 96 :57-62 ；Fendly, B .Μ.等(1987) Hybridoma 6 :359-370 ；Moeller, Α.等(1990) Cytokine 2 :162-169 ；授予 Moeller 等的美 國專禾Ij 5，231，024號；ffallach, D.的歐洲專利公開186 833 Bl號；Old等的歐洲專利申 請公開218 868A1號；Moeller，Α.等的歐洲專利公開沈0 610 Bl號)。雖然這些小鼠抗 hTNF α抗體經常展示與hTNF α的高親和力(例如Kd彡I(T9M)并能夠中和hTNF α活性， 但它們的體內使用受與給與人類小鼠抗體相關的問題所限制，所述問題例如為血清半衰期 短、不能觸發某些人體效應物的功能和引出不想要的人體內抗該小鼠抗體的免疫應答(“人 抗鼠抗體”(HAMA)反應)。為試圖克服與在人體內使用全鼠抗體相關的問題，已對鼠抗hTNFa抗體進行遺 傳工程使其更“人類化”。例如，已制備嵌合抗體，其中抗體鏈的可變區為鼠源，而抗體鏈的 恒定區為人源(Knight，D. M 等(1993)Mol. Immunol. 30 1443-1453 ；Daddona, P. E.等的 PCT 公開W092/16553號)。另外，也已制備人化抗體，其中所述抗體可變區的超變域為鼠源，但 所述可變區的其余部分和所述抗體恒定區為人源(Adair，J.R.等的PCT公開WO 92/11383 號)。然而，因為這些嵌合抗體和人化抗體仍然保留一些鼠序列，因此它們仍然可能引出 不想要的免疫反應，即人抗嵌合抗體(HACA)反應，特別是當長期給藥時，例如用于慢性適 應癥，例如類風濕性關節炎(參見例如Elliott，M.J.等(1994)Lancet344 :1125-1127 ； Elliot, Μ.J.等(1994)Lancet 344 :1105-1110)。優于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗體或人化抗體)的hTNF α抑制劑可以是完全人類抗hTNFa抗體，因為這種藥劑甚至在長期給與時也不會引起該HAMA反應。已使用人 類雜交瘤技術制備了抗hTNFa人單克隆自身抗體(Boyle，P.等(1993) Cell. Immunol. @ 556-568 ；Boyle, P.等(1993)Cell. Immunol. 152 :569-581 ；Boyle 等的歐洲專利申請公開 614 984 A2號)。然而，據報道這些雜交瘤來源的單克隆自身抗體對hTNFa的親和性太低， 以致于不能用常規方法計算，不能結合可溶性hTNFa并且不能中和hTNFa誘導的細胞毒 性(參見Boyle等；見上述)。另外，人雜交瘤技術的成功取決于產生hTNFa特異性自身抗 體的淋巴細胞在人外周血中的自然存在。某些研究已在人類對象中檢測到抗hTNFa血清 自身抗體(Fomsgaard,A.等(1989) Scand. J. Immunol. 30 :219-223 ；Bendtzen,K.等(1990) Prog. Leukocyte Biol. IOB :447-452)，而其它的研究未檢測到(Leusch，H-G.等(1991) J. Immunol. Methods 139 145-147)。除自然發生的人抗hTNFa抗體之外的另一選擇是重組hTNF α抗體。已描述了 以相對低親和性(即Kd I(T7M)和快解離速率(即Koff 10_2秒-1)結合hTNF α的重組 人抗體(Griffiths，A.D.等(1993)EMBO J. 12 =725-734) 0然而，由于它們的相對快速解 離的動力學，這些抗體可能不適于治療用途。另外，已描述了一種重組人抗hTNF α，它不中 和hTNF α活性，卻增強hTNF α與細胞表面的結合并增強hTNF α內在化(Lidbury，Α.等 (1994) Biotechnol. Ther. 5 :27-45 ；Aston, R.等的 PCT 公開 W 92/03145 號)。因此，仍然需要以高親和性和慢解離動力學地結合可溶性hTNF α并具有中和 hTNFa活性包括hTNF α誘導的細胞毒性(體外和體內)和hTNF α誘導的細胞激活的能力 的人抗體，諸如重組人抗體。
發明概要本發明提供特異性與人TNF α結合的人抗體，最好是重組人抗體。本發明抗體的 特征為高親和性和慢解離動力學地與hTNF α結合和中和hTNF α的活性，包括hTNF α誘導 的細胞毒性(體外和體內)和hTNF α誘導的細胞激活。本發明抗體的其它特征為與hTNF a 而非hTNF β (淋巴細胞毒素)結合并具有與除人TNF α之外的其它靈長類TNF α和非靈長 類TNF α結合的能力。本發明的抗體可以是全長的(例如IgGl或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結合部 分(例如i^b、F(ab，)2或scFv片段)。本發明最優選的重組抗體D2E7稱為D2E7，有一包 含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的輕鏈⑶R3域和一包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈 ⑶R3域。該D2E7抗體最好具有包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)和 包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。在一個實施方案中，本發明提供分離的人抗體或其抗原結合部分，它以不高于 1 X IO-8M的Kd和不高于1 X IO-3S-1的K。ff速率常數(均由表面等離子體激元共振測定)與 人TNF α解離，并在標準體外檢測中以不高于IX IO-7M的IC5tl中和人TNF α細胞毒性。 該分離的人抗體或其抗原結合部分更優選地以不高于5 X ΙΟΛΓ1、甚至更優選地以不高于 1 X ΙΟ、—1的K。ff與人TNF α解離。更優選的是，在標準體外檢測中以不高于1 X 10_%、 甚至更優選地以不高于1X10_9M、甚至再更優選地以不高于5X10_1(IM的IC5tl中和人TNF a 細胞毒性。在另一實施例中，本發明提供具有以下特征的人抗體或其抗原結合部分
a)以不高于IX ΙΟ、—1的K。ff(由表面等離子體激元共振測定)與人TNF α解離；b)具有一輕鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通過于位置1、4、 5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1_5個保守氨基酸置換從 SEQ ID ID NO 3修飾的氨基酸序列；c)具有一重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過于位置2、3、 4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1-5
個保守氨基酸置換從SEQ ID NO :4修飾的氨基酸序列。更優選的是，該抗體或其抗原結合部分以不高于5Χ10ΛΓ1的K。ff與人TNFa解 離。再更優選的是，該抗體或其抗原結合部分以不高于IX IO-4S-1的K。ff與人TNF α解離。在再一實施方案中，本發明提供人抗體或其抗原結合部分，其LCVR具有的CDR3域 包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO: 3修飾的氨基酸序列，其HCVR具有的⑶R3域包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列、或通過于 位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO :4修飾的氨基酸序列。更優選 地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的⑶R2域，并且該HCVR另外具有包 含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的⑶R2域。再更優選地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的⑶Rl域，并且該HCVR具有包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的⑶Rl域。在再一實施方案中，本發明提供具有包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的LCVR和包 含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的HCVR的分離人抗體或其抗原結合部分。在某些實施方案 中，該抗體具有一 IgGl重鏈恒定區或一 IgG4重鏈恒定區。在其它實施方案中，該抗體是一 Fab片段、一 F(ab，)2片段或一單鏈Fv片段。在另一些實施方案中，本發明提供抗體或其抗原結合部分，其LCVR具有選自以下 氨基酸序列的一個 CDR3 域SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25, SEQ ID NO J6或其HCVR具有選自以下氨基酸序列的一個CDR3域SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO 27,SEQ ID NO28,SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID NO :35。在再一實施方案中，本發明提供中和人TNF α而非人TNF β (淋巴細胞毒素)活性 的分離人抗體或其抗原結合部分。在一最佳實施方案中，該人抗體或其抗原結合部分中和 人TNF α、黑猩猩TNF α和選自以下的至少一種其它的靈長類TNF α的活性狒狒TNF α、狨 TNF α、獼猴TNF α和恒河猴TNF α。最好是，該抗體亦中和至少一種非靈長類TNF α的活 性。例如，在一分實施方案(subembodiment)中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和犬 TNFa的活性。在另一分實施方案中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和豬TNFa的活 性。在再一分實施方案中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和小鼠TNFa的活性。本發明的另一方面涉及編碼本發明抗體或其抗原結合部分的核酸分子。本發明優 選的核酸分子編碼D2E7LCVR，具有圖7和SEQ IDNO :36所示的核苷酸序列。本發明的另一 優選核酸分子編碼D2E7HCVR，具有圖8和SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列。本發明亦包 含攜帶本發明抗體編碼核酸的重組表達載體、導入這種載體的宿主細胞，也包括通過培養 本發明的宿主細胞制備本發明的抗體的方法。
本發明的再一方面涉及使用本發明的抗體或其抗原結合部分抑制人TNFa活性 的方法。在一個實施方案中，該方法包括用本發明的抗體或其抗原結合部分接觸人TNFa， 使得抑制人TNFa活性。在另一實施方案中，該方法包括將本發明的抗體或其抗原結合部 分給與患病(其中TNFa活性是有害的)的人類受治療者，使得抑制該人類受治療者中的 ATNFa活性。該疾病可以是例如膿毒癥、自身免疫疾病(例如類風濕性關節炎，變態反應， 多發性硬化，自身免疫性糖尿病，自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥)、傳染性疾病、惡性 腫瘤、移植物排斥或移植物抗宿主病、肺功能紊亂、骨疾病、腸功能紊亂或心臟功能紊亂。附圖簡述圖IA和IB展示了下述的氨基酸序列D2E7的輕鏈可變區(D2E7 VL ；亦示于SEQ ID NO :1)、D2E7 VL 的丙氨酸掃描突變體(LD2E7*. Al、LD2E7*. A3、LD2E7*. A4、LD2E7*. A5、 LD2E7*. A7 和 LD2E7*. A8)、D2E7 相關抗體 2SD4 的輕鏈可變區 QSD4VL ；亦示于 SEQ ID NO 9)和其它 D2E7 相關輕鏈可變區(EP B12、VL10E4、VL100A9、VL100D2、VL10F4、L0E5、VLL0F9、 VLL0F10、VLL0G7、VLL0G9、VLLOHl、VLL0H10、VL1B7、VLlCl、VL1C7、VLO. 1F4、VL0. 1H8、L0E7、 L0E7. A 和 L0E7. T)。圖 IA 展示所述 FR1、CDR1、FR2 和 CDR2 域。圖 IB 展示所述 FR3、CDR3 和 FR4 域。所述輕鏈 CDRl ( "CDR L1”)、CDR2( "CDR L2”)和 CDR3 ( "CDR L3”)域位于框 內。圖2A和2B展示了下述的氨基酸序列D2E7的重鏈可變區(D2E7 VH ；亦示于SEQ ID N0:2)、D2E7 VH 的丙氨酸掃描突變體(HD2E7*. Al、HD2E7*. A2、HD2E7*. A3、HD2E7*. A4、 HD2E7*A5、HD2E7*. A6、HD2E7*. A7、HD2E7*. A8 和 HD2E7*. A9)、D2E7 相關抗體 2SD4 的重鏈 可變區QSD4 VH;亦示于SEQ ID NO :10)和其它D2E7相關重鏈可變區(VH1B11、VH1D8、 VHlAl 1、VH1B12、VH1-D2、VH1E4、VH1F6、VHlGl、3C_H2、VH1-D2. N 和 VH1-D2. Y)。圖 2A 展示 所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。圖2B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述重鏈CDRl ("CDR H1”)、CDR2( "CDR H2”)和 CDR3 ( "CDR H3”)域位于框內。圖3是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFa抗體MAK 195相比，由人抗hTNF α抗體D2E7 對TNF α誘導的細胞毒性的抑制。圖4是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFa抗體MAK 195相比，由人抗hTNF α抗體D2E7 對rh TNF α與U-937上的hTNF α受體結合的抑制。圖5是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFa抗體MAK 195相比，由人抗hTNF α抗體D2E7 對TNF α誘導的ELAM-I在HUVEC上表達的抑制。圖6是一柱狀圖表，描述與鼠抗hTNF α抗體MAK 195(空心柱)相比，通過給與人 抗hTNFa抗體D2E7(實心柱)保護D-半乳糖胺致敏小鼠免受TNF α誘導的致死性。圖7展示D2E7的輕鏈可變區的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預期的氨基酸序 列。在所述CDR Li、CDR L2和CDR L3區下劃線。圖8展示D2E7的重鏈可變區的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預期的氨基酸序 列。在所述CDR HI、CDR H2和CDR H3區下劃線。圖9是一曲線圖，描述D2E7抗體治療對做為多關節炎模型的Tgl97轉基因小鼠平 均關節尺寸的影響。發明詳述本發明涉及以高親和性、低解離速率和高中和能力地與人TNFa結合的分離人抗體或其抗原結合部分。本發明的各個方面涉及抗體和抗體片段以及其藥用組合物、以及制 備這種抗體和片段的核酸、重組表達載體和宿主細胞。本發明亦包括用本發明的抗體檢測 人TNF α或在體外或體內抑制人TNF α活性。為更易理解本發明，首先定義某些術語。本文所用的術語“人TNF α ”(本文縮寫為hTNFa或簡單地寫為hTNF)是指以17kD 分泌形式和^kD膜結合形式存在的人細胞因子，其生物學活性形式由非共價鍵連接的 17kD分子的三聚體組成。hTNF α的結構另外描述于例如Pennica，D.等(1984) Nature 312 724-729 ；Davis, J. Μ.等(1987)Biochemistry 巡1322-1326 ；和 Jones，Ε. Y.等(1989) Nature 2巡225-2 。術語人TNF α包括重組人TNF α (rhTNF α )，它可以通過標準重組表 達方法制備或購買得到(R&D Systems,目錄號210-TA，Minneapolis, MN)。本文所用的術語“抗體”是指免疫球蛋白分子，它們由四條多肽鏈組成，即由二硫 鍵相互連接的二條重鏈(H)和二條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文簡寫為HCVR或 VH)和重鏈恒定區組成。該重鏈恒定區由CH1、CH2和CH3三個結構域組成。每條輕鏈由輕 鏈可變區(本文簡寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。該輕鏈恒定區由一個結構域即CL 組成。VH和VL區可以進一步劃分為超變區，稱為互補性決定區(CDR)，其間散布著更為保 守的稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它從氨基末端至 羧基末端的排布順序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用的抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)指保留與抗原(例如 hTNF α)特異性結合能力的抗體的一個或多個片段。已發現可以由全長抗體的片段行使抗 體的抗原結合功能。在抗體的“抗原結合部分”術語中包括的結合片段的例子包括(i) 一 個Fab片段，由VL、VH、CL和CHl域組成的單價片段；(ii) 一個F(ab，)2片段，包含在鉸鏈 區由二硫橋連接的二個Fab片段的二價片段；(iii) 一個Fd片段，由VH和CHl域組成；(iv) 一個Fv片段，由抗體單臂的VL和VH域組成；(ν) 一個dAb片段(Ward等，(1989)Nature Mi =544-546)，由一個VH域組成；和(vi) —個分離的互補性決定區(⑶R)。另外，盡管該 Fv片段的二個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但可以采用重組方法用能使它們成為 單蛋白鏈的合成接頭將它們連接，在該單蛋白鏈中所述VL和VH區配對形成單價分子(已 知為單鏈 Fv(scFv)；參見例如 Bird 等(1988)kience 242 :423-426 和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。這種單鏈抗體亦包含于術語抗體的“抗原結合 部分”之中。亦包括其它形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙抗體是二價的雙特異性抗體，其 中VH和VL域表達于一個多肽單鏈上，但所用的接頭太短使得同一鏈上的這二個結構域不 能配對，因此迫使這些結構域與另一鏈的互補結構域配對而創造出二個抗原結合位點(參 見例如 Holliger，P.等(1993)Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :6444-6448 ；Poljak, R. J.等 (1994)Structure 2 :1121-1123) 另外，抗體或其抗原結合部分可以是一個較大的免疫粘附分子的一部分，該分子 由該抗體或抗體部分與一個或多個其它蛋白或肽通過共價或非共價結合而形成。這種 免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白鏈菌素核心區制備四聚體scFv分子(Kipriyanov， S. Μ.等(1995) HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸殘基、標記 肽和C末端多組氨酸標記制備二價生物素化scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等(1994)Mol. Immunol. 31 :1047-1058).可以采用常規技術例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體，從完整抗體制備諸如Fab和F(ab’)2片段的抗體部分。另外，可以按照本文描述的標 準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。本文使用的術語“人抗體”包括具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區 的抗體。本發明的人抗體例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人種系免疫球蛋白序列 編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變導入的突變)。 然而，本文使用的術語“人抗體”不包括其中CDR序列得自其它哺乳動物種(例如小鼠)并 已被移植至人框架序列的抗體。本文使用的術語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、創造或分離的所有 人抗體，例如用轉染至宿主細胞的重組表達載體表達的抗體(在以下第II節進一步描述)、 從重組、聯合人抗體文庫中分離的抗體(在以下第III節進一步描述)、從用人免疫球蛋白 基因轉基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor，L.D.等(1992) Nucl. Acids Res. 20 =6287-6295)或通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方 法制備、表達、創造或分離的抗體。這種重組人抗體具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變 區和恒定區。然而，在某些實施方案中，對這種重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序 列轉基因動物時為體內體細胞誘變)，因此所述重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列是那些 雖然得自人種系VH和VL序列并與之相關、但在體內的人抗體種系的所有組成部分中都不 天然存在+的序列。本文使用的“分離抗體”是指大致不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體 (例如特異性結合hTNFa的分離抗體大致不含有與hTNF α之外的抗原特異性結合的抗 體)。然而，與hTNFa特異性結合的分離抗體具有對其它抗原(例如來自其它種的hTNFa) 的交叉反應性(在以下詳細討論)。另外，分離抗體可以大致不含其它細胞物質和/或化學 物質。本文使用的“中和抗體”(或“中和hTNF α活性的抗體”)是指與hTNF α結合導 致hTNFa的生物學活性被抑制的抗體。這種對hTNF α生物學活性的抑制可以通過測定 hTNF α生物學活性的一個或多個指標進行評價，所述指標例如hTNF α誘導的細胞毒性(或 者體外或者體內)、hTNF α誘導的細胞激活和hTNF α與hTNF α受體的結合。可以通過本 領域已知的一種或多種標準體外或體內檢測評價這些hTNF α生物學活性指標(參見實施 例4)。最好是，通過抑制hTNF α誘導的細胞的細胞毒性評價抗體中和hTNF α活性 的能力。做為另一個或者二者擇一的hTNF α活性指標，可以評價抗體抑制hTNF α誘導的 ELAM-I在HUVEC上的表達的能力，做為hTNF α誘導的細胞激活的量度。本文使用的術語“表面等離子體激元共振”是指一光學現象，它允許通過例如使 用 BIAcore 系統(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala，Sweden 禾口 Piscataway，NJ)檢狽Ij在 生物傳感器基質中蛋白質濃度的改變進行實時生物特異性相互作用分析。有關進一步的 描述，參見實施例 1 和 J nsson, U.等(1993) Ann. Biol. Clin.墜19-26 ； Jonsson, U.等 (1991)Biotechniques 11:620-627 Johnsson, B.等(1995)J. Mol. Recognit. § 125-131 ； 和 Johnson，B.等(1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。本文使用的術語“K。ff”是指抗體從所述抗體/抗原復合物解離的解離速率常數。本文使用的術語“K/’是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數。本文使用的術語“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA。本文使用的與編碼結合hTNF α的抗體或抗體部分(例如VH、VL、⑶R3)的核酸有 關的術語“分離核酸分子”是指下述核酸分子，其中編碼該抗體或抗體部分的核苷酸序列不 含其它編碼與hTNFa之外的抗原結合的抗體或抗體部分的核苷酸序列，所述其它序列可 能在人基因組DNA中天然位于該核酸的側翼。因此，例如編碼抗TNF α抗體的VH區的本發 明的分離核酸分子不含任何其它編碼與TNFa之外的抗原結合的其它VH區的序列。本文使用的術語“載體”是指有能力運送與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的 一種類型是“質粒”，是指其中可以連接其它DNA片段的環狀雙鏈DNA環。載體的另一類型 是病毒載體，其中在病毒基因組中可以連接其它DNA片段。某些載體能夠在其導入的宿主 細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體 (例如非附加體哺乳動物載體)可以在導入該宿主細胞時被整合入該宿主細胞的基因組， 由此可以與該宿主基因組一起復制。另外，某些載體能夠指導它們可操作地連接的基因的 表達。這種載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。一般而言，在重 組DNA技術中使用的表達載體的常見形式為質粒。在本說明書中，可以將“質粒”和“載體” 互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明包括具有相同的功能的其它形式的 表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。本文使用的術語“重組宿主細胞”是指導入了重組表達載體的細胞。應理解這種 術語不僅指特定的對象細胞，而且指這種細胞的后代。因為在后續世代中由于或者突變或 者環境影響可能發生某些修飾，事實上這種后代可以與親本細胞不同，但卻仍然包含于本 文使用的術語“宿主細胞”的范圍之內。 在下面的小節中更詳細地描述本發明的各種方面。I.與人TNF α結合的人抗體本發明提供以高親和性、低解離速率和高中和能力與人TNFa結合的分離人抗體 或其抗原結合部分。本發明的人抗體優選地是重組的、中和人抗TNFa抗體。最優選的本 發明重組中和抗體在本文中稱為D2E7并具有

圖1A、1B和圖2A、2B分別展示的VL和VH序 列(D2E7 VL區的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO 1 ；D2E7 VH區的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO :2)。以下概述了與表現出高親和性和低解離動力學的鼠抗hTNF α MAK 195mAb和另一個 與D2E7、2SD4有關的人抗hTNF α抗體相比的D2E7的結合特性
權利要求
1.分離的人抗體或其抗原結合部分，其以通過表面等離子體激元共振測定不高于 1 X IO-8M的Kd和不高于1 X ΙΟ、—1的K。ff速率常數與人TNF α解離、并在標準體外檢 測中以不高于1 X IO-7M的IC50中和人TNF α細胞毒性。
2.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它以不高于5Χ10ΛΓ1的K。ff速率 常數與人TNF α解離。
3.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它以不高于1X IO-4S-1的K。ff速率 常數與人TNF α解離。
4.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它在標準體外檢測中以不高于 1 X KT8M的IC50中和人TNF α細胞毒性。
5.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它在標準體外檢測中以不高于 1 X IO-9M的IC50中和人TNF α細胞毒性。
6.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它在標準體外檢測中以不高于 5 X IO-10M的IC50中和人TNF α細胞毒性。
7.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它是重組抗體或其抗原結合部分。
8.權利要求1的分離的人抗體或其抗原結合部分，它抑制人TNFα誘導的ELAM-I在人 臍靜脈內皮細胞上的表達。
9.具有以下特征的分離的人抗體或其抗原結合部分a)以不高于1X ΙΟ—、—1的K。ff速率常數(由表面等離子體激元共振測定)與人TNF α 解離；b)具有輕鏈⑶R3域，該域包含SEQID NO :3的氨基酸序列，或通過于位置1、4、5、7或 8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個保守氨基酸置換從SEQ ID NO 3修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈⑶R3域，該域包含SEQID N0:4的氨基酸序列，或通過于位置2、3、4、5、6、 8,9,10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個保 守氨基酸置換從SEQ ID NO :4修飾的氨基酸序列。
10.權利要求1-9中任一項的人抗體或其抗原結合部分，其具有一IgGl重鏈恒定區。
11.權利要求1-9中任一項的人抗體或其抗原結合部分，其具有一IgG4重鏈恒定區。
12.權利要求1-9中任一項的人抗體或其抗原結合部分，它是一Fab片段。
13.權利要求1-9中任一項的人抗體或其抗原結合部分，它是一單鏈Fv片段。
14.包含權利要求1-9中任一項的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體的藥 用組合物。
15.權利要求14的藥用組合物，它還包含至少一種用于治療TNFα活性有害的紊亂的 其它治療劑。
16.一種抑制人TNFa活性的方法，包括用權利要求1-9中任一項的抗體或其抗原結合 部分體外接觸人TNF α使得人TNF α活性被抑制。
17.權利要求1-9中任一項的抗體或其抗原結合部分用于制造治療其中TNFa活性是 有害的紊亂的藥物的用途。
18.權利要求17的用途，其中該紊亂是膿毒癥。
19.權利要求18的用途，其中所述藥物還含有細胞因子白介素_6。
20.權利要求17的用途，其中該紊亂是自身免疫疾病。
21.權利要求20的用途，其中該自身免疫疾病選自類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、 骨關節炎、痛風性關節炎、變態反應、多發性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素 層炎和腎病綜合癥。
22.權利要求17的用途，其中該紊亂是傳染病。
23.權利要求22的用途，其中傳染病選自惡病質、AIDS、細菌性腦膜炎。
24.權利要求17的用途，其中該紊亂是移植排斥或移植物抗宿主病。
25.權利要求17的用途，其中該紊亂是惡性腫瘤。
26.權利要求17的用途，其中該紊亂是肺功能紊亂。
27.權利要求沈的用途，其中肺功能紊亂選自成人呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺炎 性疾病、肺結節病、肺纖維化和硅肺。
28.權利要求17的用途，其中該紊亂是腸功能紊亂。
29.權利要求觀的用途，其中腸功能紊亂是局限性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
30.權利要求17的用途，其中該紊亂是心臟功能紊亂。
31.權利要求30的用途，其中心臟功能紊亂是心臟局部缺血或心臟功能不全。
32.權利要求17的用途，其中該紊亂選自炎癥性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒 性肝炎、暴發性肝炎、凝結紊亂、燒傷、再灌注損傷、瘢痕組織形成、發熱、牙周病、肥胖、膿毒 癥性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥、毒性休克綜合征、腦型瘧、AIDS相關復合征 ARC和放射毒性。
33.權利要求17的用途，其中該紊亂選自移植繼發的巨細胞病毒感染、因感染引起的 發燒和肌痛、感染繼發的惡病質和同種移植排斥。
34.權利要求17的用途，其中該紊亂是腫瘤生長或腫瘤轉移。
35.權利要求17的用途，其中所述藥物包含至少一種選自非類固醇抗炎藥、細胞因子 抑制抗炎藥、皮質類固醇、生長因子、抗生素、組織因子通道抑制劑、植物脂、抗氧化劑、氨水 楊酸、鐵螯合劑、鐵螯合物的其它治療劑。
36.權利要求17的用途，其中所述藥物包含至少一種其它治療劑，該其它治療劑選 自 CDP-571/BAY-10-3356、cA2、75kdTNFR-IgG、55kdTNFR_IgG、IDEC-CE9. 1/SB210396、DAB 486-IL-2、DAB 389-IL-2、抗 Tac、IL-4、IL-10、IL-4 激動劑、IL-10 激動劑、TNF-bp/s-TNFR、 R973401、MK-966、Iloprost、氨甲蝶呤、酞胺哌啶酮、Ieflunomide、凝血酸、T-614、前列腺 素El、Tenidap、萘普生、Meloxicam、吡羅昔康、雙氯芬酸、消炎痛、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、 ICE抑制劑、zap-70抑制劑、Ick抑制劑、VEGF抑制劑、VEGF-R抑制劑、TNF-轉化酶抑制劑、 抗IL-12抗體、白介素-11、白介素-13、白介素-17抑制劑、青霉胺、氯喹、羥氯喹、苯丁酸氮 芥、環磷酰胺、環孢菌素、抗胸腺細胞球蛋白、抗CD4抗體、CD-5毒素、膠原蛋白、Iobenzarit disodium、細胞因子調節劑和HP466、ICAM-1反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸、強的松、 奧古蛋白、葡糖胺聚糖多硫酸鹽、二甲胺四環素、抗IL2R抗體、金諾芬、保泰松、甲氯芬那 酸、氟芬那酸、靜注用免疫球蛋白、Zileuton、霉酚酸、tacrolimus、sirolimus、amiprilose、 cladribine、阿扎立平、budenoside、表皮生長因子、氨基水楊酸鹽、6-巰基嘌呤、甲硝唑、脂 氧合酶抑制劑、奧沙拉秦、balsalazide、凝血噁烷抑制劑、IL-I受體拮抗劑、彈性蛋白酶抑 制劑、吡啶基咪唑化合物、強的松龍的葡糖苷酸結合前體藥物、地塞米松的葡糖苷酸結合前體藥物或budesonide的葡糖苷酸結合前體藥物、強的松龍的葡聚糖結合前體藥物、地塞米 松的葡聚糖結合前體藥物或布地奈德的葡聚糖結合前體藥物、可溶性補體受體1、緩釋氨水 楊酸、血小板激活因子PAF拮抗劑、環丙沙星、利多卡因、強的松龍、甲基強的松龍、4-氨基 口比口定、tizanidine、干擾素-β la、干擾素-β lb、Cop-l> clabribine、carbapenems、細胞因 子 TNF α、IL-1 β、IL_6 和 / 或 IL-8 的拮抗劑、SK&F107647、四價脒基腙 CNI_1493、PHP、五 乙酸二乙三胺-鐵(III)絡合物、lis0fylline、PGG-葡聚糖、用脂類重構的載脂蛋白A-1、 手性異羥肟酸、抗內毒素抗體、E5531、rBPI21、合成抗內毒素肽。
37.權利要求觀的用途，其中所述腸功能紊亂是特發性炎癥性腸病。
38.權利要求17的用途，其中所述紊亂是瘢痕疙瘩形成。
全文摘要
公開了特異性與人腫瘤壞死因子α(hTNFα)結合的人抗體，最好為重組人抗體。這些抗體對hTNFα具有高親和性(例如，Kd不高于1x10-8M)和低解離速率(例如，Koff不高于1x10-3s-1)并在體外和體內中和hTNFα活性。本發明的抗體可以是全長抗體或是其抗原結合部分。本發明的抗體或抗體部分可以用于檢測hTNFα并例如在患有其中hTNFα活性是有害的紊亂的人類受治療者中抑制hTNFα活性。本發明亦包括表達本發明重組人抗體的核酸、載體和宿主細胞、以及合成所述重組人抗體的方法。
文檔編號G01N33/576GK102070715SQ201010552509
公開日2011年5月25日 申請日期1997年2月10日 優先權日1996年2月9日
發明者A·J·維爾頓, A·J·羅伯茨, B·T·麥圭內斯, B·拉布科夫斯基, D·J·阿倫, D·舍恩豪特, H·R·J·M·霍根布姆, J·A·曼克維, J·G·薩菲爾德, M·懷特, P·薩克拉法斯, T·J·沃漢, Z·凱馬克卡蘭 申請人:艾博特生物技術有限公司