專利名稱：生物大分子濃縮除鹽方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，特別是涉及一種對液體樣本中的生物大分子進 行濃縮除鹽的方法以及采用該方法的試劑盒。
背景技術：
膀胱癌是一種嚴重危害人類健康和生命的惡性腫瘤，占全球癌癥發病率的2. 3%。 在我國泌尿系統惡性腫瘤中，膀胱癌發病率和死亡率均占首位，復發率高達50 % -70 %，遠 端轉移占10% -20%。這種高死亡率在很大程度上是由于膀胱癌的檢測技術不夠靈敏所 致。目前，膀胱癌的診斷主要依靠膀胱鏡檢查，一般是在患者出現血尿后才引起注意；但是 在這種癥狀下，膀胱癌已發展至中晚期，伴隨嚴重的并發癥，很難找到有效的治療手段，而 且也無法避免高復發率。因此，膀胱癌的早期診斷具有極其重要的臨床應用價值，能夠極大 地提高膀胱癌的早期診斷水平和明顯地改善膀胱癌患者的生活質量。類似膀胱癌這種疾病的診斷是通過尿液的致癌標志物來檢測。尿液或其它體液具 有樣本體積很大、蛋白質濃度比較低的特點，如何富集蛋白質已成為尿液等體液的相關研 究和臨床中必須面臨與要解決的問題。現在用于蛋白質制備，樣品濃縮、除鹽的方法有超濾法、透析法、丙酮沉淀等方法。 相對來說，超濾法成本較高，且濾膜上會吸附部分蛋白質會造成蛋白損失，特別對于低分子 量和低豐度蛋白來說特別明顯，超濾管一般用了 1次就不建議重復使用；透析法時間特別 長，雖然能除鹽，但是不能富集蛋白；丙酮沉淀制備蛋白的方法具有使蛋白質變性的副作 用，并且不利于處理大體積的樣本，回收率也不高。如何找到一種成本低，濃縮、除鹽效率 高，使樣品保持活性，化學試劑污染小，能回收的方法或試劑處理大體積液體樣本將會給相 關研究與臨床帶來新的突破口。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種適合用于大體積液體樣本、濃縮 或除鹽效率高且不會造成生物大分子變性的對液體樣本中的生物大分子進行濃縮或除鹽 的方法。本發明的另一目的在于提供一種適合用于大體積液體樣本、濃縮和除鹽效率高且 不會造成生物大分子變性的對液體樣本中的生物大分子進行濃縮或除鹽的試劑盒。為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了一種對液體樣本中的生物大分子進行濃縮或除鹽的方法，所述方法 包括a、根據待濃縮或除鹽的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝膠，b、將凝固后的聚丙烯酰胺凝膠烘干；C、將烘干后的聚丙烯酰胺凝膠放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹；d、收集留在凝膠外部的生物大分子。
優選的，步驟b中，聚丙烯酰胺凝膠的烘干溫度為50 70°C。所述生物大分子為蛋白質或者核酸。優選的，所述液體樣本為尿液，所述生物大分 子為尿液蛋白。所述步驟a中配置聚丙烯酰胺凝膠的濃度優選為10 15%，更優選13%。步驟c中，液體樣本體積不超過烘干前聚丙烯酰胺凝膠體積的60%。且優選將步 驟c置于4°C _15°C更優選于4°C下進行。在本發明具體 的實施方式中，步驟d中，所述收集留在凝膠外部的生物大分子的 具體過程包括，用水或緩沖液沖洗凝膠外部，使留在凝膠外部的生物大分子溶解，然后將凝 膠轉入提前置于收集管中的網狀疏水性提籃，將提籃上提一定高度保證提籃中的凝膠高于 收集管內的液面，并與收集管固定后，于50 150g離心2 5min，收集沖洗及離心后的液 體，得到濃縮除鹽后的生物大分子。優選的，所述方法在步驟d后進一步包括，將聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈后回 收使用，所述聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈的方法包括純水充分浸泡或超聲洗滌。本發明進一步公開了一種用于對液體樣本中的生物大分子進行濃縮除鹽的試劑 盒，所述生物大分子為蛋白質或者核酸，所述試劑盒含有能夠配置得到聚丙烯酰胺凝膠的 配方成分，或者所述試劑盒含有于50 70°C進行烘干的聚丙烯酰胺干凝膠。優選的，所述液體樣本為尿液，所述生物大分子為尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯 酰胺凝膠的濃度為10 15%，優選13%，或者所述聚丙烯酰胺干凝膠在烘干前的濃度為 10 15%，優選 13%。由于采用了以上技術方案，使本發明具備的有益效果在于本發明提供的聚丙烯酰胺凝膠濃縮除鹽方法和試劑盒能有效地處理液體樣本，操 作流程簡易，并使蛋白質、核酸等生物大分子不變性、損失小，不僅濃縮和除鹽效率高，所用 聚丙烯酰胺凝膠還能回收、反復利用，化學試劑殘余幾乎為0，方便后期實驗的處理，是現有 的液體蛋白質、核酸樣品制備、樣本濃縮和除鹽方法的很好的替代品。特別低，本發明采用 溫和烘干的方式(于50 70°C優選65°C充分烘干使脫水完全)制備干凝膠，不會改變凝 膠分子的親水性及交聯度，屬自然無變性過程，烘干后吸脹速度快；避免了利用醇類或酮類 物質進行脫水會造成凝膠分子親水性和交聯度的改變，使凝膠孔徑變大，蛋白質等大分子 物質容易進入膠內而造成損失，且吸脹速度慢的缺點。本發明制備干凝膠的方法操作簡單 且無其他化學物質(如醇類和酮類)的殘留，避免對蛋白質等樣品的污染或變性和修飾等 不良影響。膠濃縮效率高，成本低(濃度為13%的聚丙烯酰胺凝膠即可濃縮得到分子量大 于IOKD的蛋白質)。
圖1為本發明一種聚丙烯酰胺凝膠法制備濃縮、除鹽樣品的操作流程圖；圖2為本發明實施例5的4個尿液樣本用不同方法處理后跑SDS膠的結果圖。
具體實施例方式本發明公開了一種適合用于大體積液體樣本、濃縮和除鹽效率高且不會造成生物 大分子變性的對液體樣本中的生物大分子進行濃縮除鹽的方法和試劑盒。下面的實施例僅 用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。
本發明是采用將一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠用溫和烘干(50-70°C優選65°C )等 方式脫水完全至變硬后加入適當體積的液體樣品，置于4°C -15°C優選4°C待凝膠自然吸脹 完全后，水分和一些鹽類等小分子會被吸進膠內，而大分子的蛋白質、核酸則被截留在膠表 面，再用適當體積的溶劑將蛋白或核酸沖洗并溶解，快速轉入新管。這樣便得到濃縮和除鹽 后的樣品。在本發明具體的實施方式中，本發明的目的可以通過以下操作流程來實現1)按下表所列的對應關系，根據提取或濃縮或除鹽生物大分子的最低分子量選擇 配置合適的聚丙烯酰胺凝膠的濃度。表1截留分子量范圍與凝膠濃度的關系
分子量范圍/Pa I 凝膠濃度/(%)— 蛋白質
_>5k__20_
>10k__\3_
>20k__8_
>30k__5_>50k3
核酸
_>lk__20_
_>5k__12_
>10k__8_
>20k__5_
>50k__2_在本發明中，配置聚丙烯酰胺凝膠的配方采用本領域常規使用的配方，通 常包括單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)、交聯劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(N， N-methylene-bisacylamide,簡稱 Bis)、加速劑 N，N, N, N-四甲基乙二胺(簡稱 TEMED)和 催化劑過硫酸銨(簡稱APS)或核黃素。2)待配置好的聚丙烯酰胺凝膠凝固后，將凝固后的凝膠于50 70°C優選65°C充 分烘干使脫水完全。65°C為常用烘干溫度，波動范圍50°C -70°C為宜，溫度過低所需烘干時 間長，溫度過高容易破壞分子結構，包括聚丙烯酰胺凝膠結構。3)將上述烘干脫水完全的干凝膠放置于液體樣品內，于4°C -15°C (常用溫度為 4°C，為冰箱常用溫度之一)條件下使凝膠充分吸脹。溫度在上述范圍內變化對濃縮結果影 響不大，但溫度過高樣品容易降解，溫度過低不利于凝膠吸收樣品液體。 在本發明的方法中，烘干脫水完全后的聚丙烯酰胺凝膠能吸脹的最大體積配置 聚丙烯酰胺凝膠的液體總體積=0.6 1，即脫水完全后的聚丙烯酰胺凝膠完全吸脹后最 多能吸收相當于配置聚丙烯酰胺凝膠液體總體積60%的液體。因此，為保證濃縮和除鹽效果，在該步驟中，應使液體樣本體積烘干前聚丙烯酰胺凝膠體積(即配置聚丙烯酰胺凝 膠的液體總體積)<0.6 1。同時為便于操作，也可在上述步驟1)中根據待濃縮的液體 樣本體積，直接換算并配制合適體積的聚丙烯酰胺凝膠。在本發明的方法中，聚丙烯酰胺凝 膠過量使用對樣品的濃縮除鹽效果無不良影響，但會造成成本浪費。 4)用適量的溶劑，如純水或者適當的緩沖液沖洗凝膠表面，溶解截留于吸脹后凝 膠外部的蛋白質或核酸，轉移入提前置于收集管中的網狀疏水性提籃，將提籃上提一定高 度，保證提籃中的凝膠高于收集管中液面，并使提籃與收集管固定后低速離心，比如可于 50 150g離心2 5min，甩出吸附在凝膠表面的樣品，收集沖洗及離心后的液體即為所得 濃縮除鹽后的生物大分子。離心速度過低則離心時間長，影響樣品的收集率和鹽分的有效 去除；速度過高容易使凝膠破爛。在上述范圍內，通常可根據所使用的聚丙烯酰胺凝膠濃度 不同而選擇不同轉速，濃度高的凝膠能承受的轉速大，所需離心時間短。5)凝膠經過回收處理(如純水下超聲3次洗出吸脹的物質)后脫水烘干，以備下 次使用。本發明的方法和試劑盒特別適合用于大體積液體樣品中，低含量生物大分子的富 集濃縮和除鹽，比如，特別適合用于尿液中尿蛋白的富集濃縮。本發明的有益效果在于(1)操作流程簡易本發明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒操作簡易(見圖1)，即使 是沒有實驗室背景的人員也能看說明直接識別、操作，并且所用的試劑、儀器比較簡單、常 見，一般的實驗室都會配有，很容易普及。(2)成本低、回收率高本發明所提供的聚丙烯酰胺試劑盒，只需花費制備聚丙烯 酰胺凝膠試劑的金額，花費小，并且經過處理后重復使用而不影響效果。(3)蛋白質損失小通過SDS跑出的圖可看出，本發明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑 盒能夠提取低分子量的蛋白質，并且凝膠表面殘余的蛋白可通過低速離心甩出。(4)可靈活選用不同濃度和體積的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的濃度不同， 能夠截留的分子量大小就不同，一般來說13%的聚丙烯酰胺凝膠能截留約IOKD的蛋白質， 根據需要制備的蛋白質可選用不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠。并且該試劑盒所濃縮的液體樣 品體積不受限制，可靈活選用，非常方便，非常適合于大體積液體的濃縮和除鹽。(5)蛋白質能保持活性。本發明提供的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒沒有變性劑等物質， 蛋白質不會變性。(6)蛋白質富集濃度高，除鹽率高。13%聚丙烯酰胺凝膠試劑盒處理50ml尿液樣 本能夠得到1. 069mg的蛋白質，并且通過看SDS圖，除鹽效果好。本發明的方法和試劑盒適用于對液體樣本中，將一定分子量大小以上的所有蛋白 質進行富集濃縮并除鹽，可大概歸結為1、將濃度較低的蛋白樣品進行濃縮。2、將鹽含量較高的蛋白樣品進行除鹽。3、從體積較大、蛋白含量較低的液體樣本中富集蛋白并除鹽，例如尿液蛋白的樣 品制備。本發明不僅適合少量樣品的濃縮和除鹽，還適合大量樣品的濃縮和除鹽，適用范 圍大，從幾微升到幾百毫升甚至更大體積的樣品都適用。
特別地，本發明采用溫和烘干的方式(于50 70°C優選65°C充分烘干使脫水完全)制備干凝膠，不會改變凝膠分子的親水性及交聯度，屬自然無變性過程，烘干后吸脹速 度快；避免了利用醇類或酮類物質進行脫水會造成凝膠分子親水性和交聯度的改變，使凝 膠孔徑變大，蛋白質等大分子物質容易進入膠內而造成損失，且吸脹速度慢的缺點。本發明 制備干凝膠的方法操作簡單且無其他化學物質(如醇類和酮類)的殘留，避免對蛋白質等 樣品的污染或變性和修飾等不良影響。膠濃縮效率高，成本低。本發明創造了凝膠重復使 用的方法50 70°C優選65°C烘干方式和純水浸泡并超聲處理的方法使凝膠的重復使用 成為可能，因為這些方式對凝膠都是非化學、無變性作用。在本發明的方法和試劑盒中，可以采用疏水性提籃與收集管配套使用，在低速離 心作用下充分回收樣品，減少了樣品損失，大大提高了樣品回收率。本發明的方法或者試劑 盒可單用于濃縮或單用于除鹽，適用范圍廣。下面通過具體實施方式
結合附圖對本發明作進一步詳細說明。實施例1聚丙烯酰胺凝膠的配制按下述配方配制濃度為13%的聚丙烯胺凝膠(13%濃度的聚丙烯酰胺凝膠能截 留IOKD以上的分子，通過調節聚丙烯酰胺凝膠的濃度，可以獲得需要截留的分子)，烘干后 聚丙烯胺凝膠的飽和吸收量為配置聚丙烯酰胺凝膠液體總體積的60%，按濃縮樣品的量配 制相應體積的聚丙烯酰胺凝膠。置于適當的模具中，待凝固后，用光滑薄刀片將其切成所需 形狀和體積，在65°C熱板或烘箱條件下使凝膠脫水完全至變硬。13%的聚丙烯胺凝膠的配方為(V V)水55.63%30%單體儲液(acr bis = 29 1) 43. 33%10 % APS (過硫酸銨)1 %TEMED0. 04%如配制IOml 13%的聚丙烯酰胺凝膠的配方如下水5. 56ml30%單體儲液(acr bis = 29 1) 4.34ml10 % APS (過硫酸銨)0. ImlTEMED0. 004ml實施例2樣品濃縮與除鹽干凝膠用網狀疏水性提籃套住后，選擇適當的離心管或容器，將干凝膠置于容器 中，倒入需要濃縮和/或除鹽的樣品(烘干后聚丙烯胺凝膠的飽和吸收量為配置聚丙烯酰 胺凝膠液體總體積的60% )，4°C -15°C (優選溫度4°C )條件下充分吸脹，待樣品溶液吸 收完全即可。樣品中的水、鹽分等小分子物質被凝膠完全吸收，蛋白質等大分子物質滯留在 凝膠外。如做尿液濃縮時，蛋白質被滯留在凝膠外。實施例3樣品的沖洗和轉移用一定量的純水(或其它buffer，如PBS、TBS、lysis buffer 等，lysis buffer :8M 尿素+4% CHAPS+40mM Tris-HCl+lmM PMSF+2mM EDTA+IOmM DTT)沖洗吸脹后的凝膠表面， 使蛋白質溶于溶劑，之后轉移入網狀疏水性提籃并置于收集管中。將提籃向上提Icm(上提 的距離由收集管中液體的高度決定，約比液體高度高一點點)，固定提籃后，50-150g離心2-5min,液體樣品被甩出網狀疏水性提籃，收集得到濃縮和除鹽后的樣品。當用于沖洗凝膠的純水(或其它合適的buffer)加入過多時，此時可通過冷凍抽 干的方法對樣品進行進一步的濃縮(樣品已經除鹽，所以冷凍抽干不會使樣品變質)。實施例4凝膠的回收從網狀疏水性提籃中拿出聚丙烯酰胺凝膠，經過處理后可重復使用。參考的處理方法為(也可用本實施例以外的方法處理)在超聲槽中加入5倍或 以上膠體積的純水，加入吸脹后的聚丙烯酰胺凝膠，超聲3次，每次換水。當超聲后的水沒 有氣泡，清澈，可將聚丙烯酰胺凝膠置于65°C熱板或烘箱條件下使凝膠脫水完全至變硬。將 脫水后的凝膠回收，干燥環境下保存，以備再次使用。除上述參考方法外，在本發明中，吸脹后的聚丙烯酰胺凝膠也可采用其它方法進 行回收處理，比如用純水直接浸泡使聚丙烯酰胺凝膠清洗干凈。實施例5尿液蛋白樣品的制備 將同一批正常人尿液樣本200ml分成4份，每份各50ml，分別標注為1、2、3、4號樣 本。分別從1-4號樣本中制備尿液蛋白。1號樣本用常規的超濾法制備，2、3、4號樣本分別 用本發明制備的濃度為15%、13%、10%的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒制備，具體方法參考上述 實施例1-4。4份樣本濃縮后的尿液蛋白質樣品分別跑SDS膠，上樣量都為20 μ g。SDS膠圖如 圖2所示。結果顯示，2號、3號樣品除鹽效果很好，并且蛋白質的種類、濃度都比1號、4號 樣品都高；并且看到2號、3號能截留IOKD的蛋白質，本發明試劑盒不會丟失小分子量的蛋 白質。由于鹽分影響，含鹽樣品的泳道往下變寬成梯形狀。在考慮成本的前提下，當用于尿液蛋白的制備時，13%的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒 濃縮和除鹽效果最好。實施例6 —種用于從尿液中富集尿液蛋白的試劑盒—種試劑盒，含有密封包裝的聚丙烯酰胺干凝膠，該干凝膠在烘干前濃度為13 %， 且是在50 70°C溫度條件下進行烘干脫水完全的。該試劑盒用于從尿液中富集尿液蛋白。實施例7另一種用于從尿液中富集尿液蛋白的試劑盒一種試劑盒，含有可配置得到聚丙烯酰胺凝膠的以下成分30%單體儲液 (acr bis = 29 1)、10% APS(過硫酸銨)和TEMED。該試劑盒還含有說明書。該試劑 盒可用于從尿液中富集尿液蛋白。實施例8聚丙烯酰胺凝膠試劑盒濃縮和除鹽樣品的蛋白質濃度測定利用上述實施例6的試劑盒，按照實施例2-4所述的方法，或者利用上述實施例7 的試劑盒，按照實施例1-4所述的方法(聚丙烯酰胺凝膠濃度為13% )，在相同條件下分別 對3組各50ml正常人尿液樣本進行濃縮和除鹽。濃縮和除鹽后的蛋白質樣品分別用酶標 儀測定蛋白濃度。結果見下表，可以看出，本發明試劑盒提取的總蛋白量很高，能滿足蛋白 質組等研究的需要。表213%聚丙烯酰胺凝膠試劑盒濃縮尿液后的蛋白質濃度測定
-
權利要求
1.一種對液體樣本中的生物大分子進行濃縮或除鹽的方法，所述方法包括a、根據待濃縮或除鹽的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝膠，b、將凝固后的聚丙烯酰胺凝膠烘干；C、將烘干后的聚丙烯酰胺凝膠放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹；d、收集留在凝膠外部的生物大分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中，聚丙烯酰胺凝膠的烘干溫度為 50 70 。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物大分子為蛋白質或者核酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述液體樣本為尿液，所述蛋白為尿液蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟a中配置聚丙烯酰胺凝膠的濃 度為10 15%，優選13%。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟c中，液體樣本體積不超過烘干 前聚丙烯酰胺凝膠體積的60%。
7.根據權利要求1、2、4、5中任意一項所述的方法，其特征在于步驟d中，所述收集留 在凝膠外部的生物大分子的具體過程包括，用水或緩沖液沖洗凝膠外部，使留在凝膠外部 的生物大分子溶解，然后將凝膠轉入提前置于收集管中的網狀疏水性提籃，使提籃中的凝 膠高于收集管中的液面，并固定于收集管，于50 150g離心2 5min，收集沖洗及離心后 的液體，得到濃縮除鹽后的生物大分子。
8.根據權利要求1、2、4、5中任意一項所述的方法，其特征在于所述方法在步驟d后 進一步包括，將聚丙烯酰胺凝膠充分清洗干凈后回收使用，所述聚丙烯酰胺凝膠充分清洗 干凈的方法包括純水充分浸泡或超聲洗滌。
9.一種用于對液體樣本中的生物大分子進行濃縮或除鹽的試劑盒，所述生物大分子為 蛋白質或者核酸，其特征在于所述試劑盒含有能夠配置得到聚丙烯酰胺凝膠的配方成分， 或者所述試劑盒含有于50 70°C進行烘干的聚丙烯酰胺干凝膠。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述液體樣本為尿液，所述生物大分 子為尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯酰胺凝膠的濃度為10 15%，優選13%，或者所述聚 丙烯酰胺干凝膠在烘干前的濃度為10 15%，優選13%。
全文摘要
本發明公開了一種對液體樣本中的生物大分子進行濃縮除鹽的方法和試劑盒，所述生物大分子為蛋白質或者核酸，本發明的方法包括配置聚丙烯酰胺凝膠并烘干，然后放置于液體樣本中使干凝膠充分吸脹，收集留在凝膠外部的生物大分子。本發明提供的聚丙烯酰胺凝膠濃縮除鹽方法和試劑盒能有效地處理液體樣本，操作流程簡易，并使蛋白質、核酸等生物大分子不變性、損失小，不僅濃縮和除鹽效率高，所用聚丙烯酰胺凝膠還能回收、反復利用，是現有的液體蛋白質、核酸樣品制備，樣本濃縮和除鹽方法的很好的替代品。
文檔編號G01N1/34GK102072836SQ201010542498
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月12日 優先權日2010年11月12日
發明者李啟沅, 林志龍, 林梁, 邱雪梅 申請人:深圳華大基因科技有限公司