專利名稱：通過(guò)map2k4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒及其用途，尤其是一種通過(guò)MAP2K4基因 檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒及其用途，通過(guò)檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MAP2K4)的單核 苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)肺癌的易感性。屬于醫(yī)療研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡(jiǎn)稱肺癌，是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之 一。由于肺癌常伴早期轉(zhuǎn)移，70%的肺癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，其5年生存率目前的平均水 平只有16%，其病情發(fā)展速度與肺癌細(xì)胞的生物特性有關(guān)。肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康 和生命的疾病。2009年美國(guó)報(bào)告新發(fā)肺癌219440例，死亡159390例(死亡率53. 80/10 萬(wàn))。廣州死亡登記的數(shù)據(jù)標(biāo)明1970 1972年肺癌死亡率為11. 61/10萬(wàn)，1980 1982 年升為32. 67/10萬(wàn)，而2000 2002年更上升至48. 79/10萬(wàn)。上海及天津死亡登記的數(shù) 據(jù)也都顯示肺癌的死亡率在數(shù)十年間急劇上升。肺癌病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前一致認(rèn)為吸煙、空氣污染、放射線、肺結(jié) 核及鎳化合物等職業(yè)危害是肺癌的危險(xiǎn)因素。這些危險(xiǎn)因素對(duì)細(xì)胞而言都是刺激信息，可 激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路。 MAPK信號(hào)通路進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等過(guò)程，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。近年來(lái)研 究顯示很多MAPK基因在各種類型肺癌中均有基因表達(dá)的改變，而在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn) 了很多MAPK基因的突變。對(duì)MAPK基因深入的研究將為肺癌的基因預(yù)防和治療提供理論基 石出。SNP(Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，是人類基因組作圖 的第三代遺傳標(biāo)記，主要是指一類基于單堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn) 換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，已成為 研究基因組多態(tài)性和識(shí)別、定位疾病相關(guān)的一種工具。1996年成功研制了 SNP檢測(cè)的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，還實(shí)現(xiàn)了判斷結(jié)果的自動(dòng)性?？衫?熒光定量PCR技術(shù)研發(fā)檢測(cè)疾病易感性的試劑盒。MAP2K4基因位于第17號(hào)染色體17pll. 2位置，全長(zhǎng)> 120kb，mRNA全長(zhǎng)3826bp， 共11個(gè)外顯子，編碼399個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。MAP2K4基因編碼蛋白是MAPK信號(hào)通路中的 關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，它能激活JNK和p38信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等 過(guò)程。大量的研究顯示，腫瘤發(fā)生過(guò)程中常見(jiàn)MAP2K4基因的失活肺癌細(xì)胞系和胰腺癌細(xì) 胞系可見(jiàn)MAP2K4基因編碼區(qū)的純和性缺失，而在大約5%的人各種腫瘤組織中可檢測(cè)出導(dǎo) 致MAP2K4基因功能喪失的突變。并且MAP2K4基因的低表達(dá)與是胃癌、前列腺癌及卵巢癌 的預(yù)后相關(guān)。rs3826392是位于第17號(hào)染色體MAP2K4基因啟動(dòng)子區(qū)域的一個(gè)T > G多態(tài)。其 在世界人群的頻率分布，T占0.62，G占0.38左右。中國(guó)人群的分布T占0.45，G占0. 25 左右。分子生物學(xué)研究表明，T > G的替代可增加MAP2K4基因啟動(dòng)子與核蛋白的結(jié)合，增加MAP2K4基因的表達(dá)。通過(guò)大規(guī)模人群的肺癌病例對(duì)照研究，MAP2K4基因啟動(dòng)子區(qū)域的 T > G多態(tài)與肺癌發(fā)生相關(guān)，并且呈基因劑量_反應(yīng)關(guān)系。即使在調(diào)整年齡、性別、吸煙、腫 瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關(guān)性仍然存在。發(fā)明人的研究還顯示rs3826392與散 發(fā)性腸癌及鼻咽癌的發(fā)生相關(guān)，均表現(xiàn)為rs3826392基因型為G時(shí)腫瘤發(fā)生率降低。這個(gè) SNP的多態(tài)可用于評(píng)估個(gè)體肺癌的易感性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的，是為了提供一種通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑 盒，主要是通過(guò)MAP2K4基因上的rs3826392位點(diǎn)檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。本發(fā)明的第二個(gè)目的，是為了提供一種通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑 盒的用途，主要是通過(guò)MAP2K4基因上的rs3826392位點(diǎn)檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的用途。本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于1)該試劑盒的物質(zhì)包括檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性 引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反應(yīng) 緩沖液和去離子水；2)所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列包括 有義引物序列和反義引物序列；所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性 熒光探針對(duì)包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)所述的特異性引物，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào) SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)和DNA探針對(duì)。本發(fā)明的第一個(gè)目的還可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實(shí)施方案是試劑盒中供一人份使用的各成分的含量 為1)10 μ M特異性引物對(duì)兩條各0.225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針對(duì)兩條各0. 1μ 1 ；2) 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3) 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgC12 溶液 0· 5μ 1 ；5) 5Χ熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1 ；6)去離子水 4.1 μ 1。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實(shí)施方案是所述檢測(cè)ΜΑΡ2Κ4基因上的rs3826392 號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有義引物序列的Tm值為 60°C，反義引物序列的Tm值為58°C ；所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的 特異性熒光探針對(duì)的序列如序列表SEQ ID N2 :2所示，野生型探針序列的Tm值為66°C，突 變型探針序列的Tm值為67V。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實(shí)施方案是試劑盒的保存溫度為-20°C。本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)種通過(guò)MAP2K4基因上的rs3826392位點(diǎn)檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的用途，其特征 是用于檢測(cè)DNA的MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型。
本發(fā)明具有如下突出的有益效果由于本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)是針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn) 而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)； 所述的特異性熒光探針是針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò) 增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA探針對(duì)；因此，用于檢測(cè)DNA 的MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型，既適用于檢測(cè)個(gè)體肺癌的易感性，也 適用于對(duì)胃癌、前列腺癌及卵巢癌的預(yù)后檢測(cè)，更可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究，
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施例1 本實(shí)施例包括1)該試劑盒的物質(zhì)包括檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性 引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反應(yīng) 緩沖液和去離子水；2)所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列如序 列表SEQ ID N2 :1所示，有義引物序列的Tm值為60°C，反義引物序列的Tm值為58°C;所述 檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性熒光探針對(duì)的序列如序列表SEQ ID Na 2所示，野生型探針序列的Tm值為66°C，突變型探針序列的Tm值為67V ；3)所述的特異性引物，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào) SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)和DNA探針對(duì)。本實(shí)施例中，試劑盒供一人份使用的各物質(zhì)的含量為10 μ M特異性引物對(duì)兩條 各0. 225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA聚合酶0. 02 μ 1 ； 20mM dNTP混合液0. 1 μ 1 ；25mM MgCl2溶液0. 5 μ 1 ；5Χ熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1 ；去 離子水4. 1 μ 1。本實(shí)施所述試劑盒的保存溫度為-20°C。本試劑盒所述的特異性引物是針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè) 計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)。設(shè)計(jì) 這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能輕易完成的。優(yōu)選地，本試劑盒包括具有SEQ ID N0:1和2 所示序列的引物對(duì)。特異引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，本發(fā) 明的引物不限于這對(duì)引物。本試劑盒所述的特異性熒光探針是針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn) 而設(shè)計(jì)，能特異性檢測(cè)rs3826392這個(gè)肺癌一個(gè)基因型的DNA探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本 領(lǐng)域技術(shù)人員能輕易完成的。優(yōu)選地，本試劑盒包括具有SEQ ID NO :3和4所示序列的熒 光探針對(duì)。特異熒光引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，本發(fā)明的 引物不限于這對(duì)熒光探針。所有可用于熒光定量PCR檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào) SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本實(shí)施例的使用方法如下步驟1:DNA模板的提取用硅膠吸附法提取血液標(biāo)本的基因組DNA ；
步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用本發(fā)明的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其中包括下列引物對(duì)和熒光探針，均針 對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)有義引物1 :5，-CATTAAAGGCAAATTGAAGGTGAGA-3，(SEQ ID NO :l)Tm 值為 60°C反義引物1 :5，-GCCCATGGAGGAGAATTCTG-3，(SEQ ID NO :2)Tm 值為 58°C野生型探針5，-AGGTAGGTGTACTTAAG-3，(SEQID NO 3) Tm 值為 66°C突變型探針5，-AGGTAGGTGTACTTCAG-3，(SEQID NO :4)Tm 值為 67V熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為10 μ 1，包括DNA模板(20ng/ μ 1) 2 μ 1、10 μ M特 異性引物對(duì)(兩條)各0. 225 μ 1、5 μ M特異性引物對(duì)(兩條)各0. 1μ l、(5unit/l·! l)Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ l、20mM dNTP 混合液 0. 1 μ l、25mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1、5X 熒光定量 PCR 反應(yīng)緩沖液2 μ 1、去離子水4. 1 μ 1。步驟3 基因型分析在ABI 7900ΗΤ型熒光定量PCR儀是進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C 2min,95°C lOmin，再進(jìn)行40 55個(gè)PCR循環(huán)92°C 15s，60°C lmin。反應(yīng)結(jié)束后在ABI 7900HT型熒
光定量PCR儀讀取熒光量。步驟3 基因型分析及確定基因型采用ABI 7900HT 型熒光定量PCR儀自帶軟件 SDS (Sequence Detection Systems) V2. 3判讀基因型，自動(dòng)分析結(jié)果。被檢測(cè)DNA的MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)攜 帶有T時(shí)，為肺癌易感型。本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌步驟1 :DNA的提取對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問(wèn) 卷表。常規(guī)方法抽取被檢測(cè)者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標(biāo)本的基因組DNA。步驟2 基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者DNA的MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定該位點(diǎn)的基因型。步驟3 指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和對(duì)被檢測(cè)者個(gè)體化健康 指導(dǎo)報(bào)告。基因分型檢測(cè)報(bào)告詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者肺癌易感程度的高低以及患病概率大 小。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢測(cè)者的基因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問(wèn) 卷調(diào)查結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)這肺癌遺傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)制定出針對(duì)被檢測(cè)者的個(gè)性化 健康行動(dòng)方案，包括在飲食習(xí)慣、生活方式生活的改進(jìn)建議等，并為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌 的健康知識(shí)。
權(quán)利要求
通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于1)該試劑盒的物質(zhì)包括檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水；2)所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列包括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性熒光探針對(duì)包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)所述的特異性引物，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)和DNA探針對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性和判斷肺癌預(yù)后的試劑盒， 其特征在于試劑盒中供一人份使用的各成分的含量為1)10 μ M特異性引物對(duì)有義引物序列和反義引物序列各0. 225 μ 1，5 μ M特異性熒光探 針對(duì)野生型探針序列和突變型探針序列各0. 1 μ 1 ；2)5unit/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3)20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mMMgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5)5Χ熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2 μ 1 ；6)去離子水4.1μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)ΜΑΡ2Κ4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于所 述檢測(cè)ΜΑΡ2Κ4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列如序列表SEQID Na 1所示，有義引物序列的Tm值為60°C，反義引物序列的Tm值為58°C ；所述檢測(cè)MAP2K4基 因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性熒光探針對(duì)的序列如序列表SEQ ID Na 2所示，野 生型探針序列的Tm值為66 °C，突變型探針序列的Tm值為67 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于試 劑盒的保存溫度為-20°C。
5.通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的用途，其物征在于用于檢測(cè)DNA的 MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型。全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)通過(guò)MAP2K4基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒及其用途，1)該試劑盒的物質(zhì)包括檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水；2)檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的序列包括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性熒光探針對(duì)包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)特異性引物，能特異性擴(kuò)增出包含針對(duì)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA引物對(duì)和DNA探針對(duì)。本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)MAP2K4基因上的rs3826392號(hào)SNP位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)肺癌易感性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101974636SQ20101053885
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉斌, 呂嘉春 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院