專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的制作方法
氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑
合 Sl
技術領域：
本發明涉及醫學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。擴散法是標本堿化后，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8% 13% ’離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發生變化進行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發現比較理想的血氨測定方法。
發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。本發明氨(氨離子)測定方法的的技術原理是根據下述谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶的系列催化反應完成氨+過氧化氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+氰化氫+2還原型輔酶氰化氫合成酶甘氨酸+2輔酶本發明的方法利用谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase ；EC 1. 4. 3. 7、EC 1. 4. 3. 11)酶(偶)聯氨甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase ；EC 6. 3. 5. 5)、 氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1. 4. 99. 5)酶促反應比色終點法。谷氨酸氧化酶酶解氨反應產生谷氨酸，再通過(偶)聯合氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，
6從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下A、樣品準備A.1標準樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
氨的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)
氨(氨離子)含量=-:-χ標準濃度(μπιοΙ/L)
ΔΑ(標準)-ΔΑ(空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。根據本發明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的緩沖液應該理解是能夠使其測定介質的PH基本保持穩定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果該ρΗ高于9.0或ρΗ低于6. 0，則該測定方法使用的酶的活性達不到預期的活性效果，因此需要添加更多的介質與酶，才有可能達到預期的活性效果。在本發明中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或 “PBS”緩沖液的緩沖液。優選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據本發明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的穩定劑應該理解是一種能保護試劑中的介質(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質，進而失去活性的物質，它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩定齊U，則試劑的活性在溶液中只能維持數十小時，頂多數天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發明中，所述的穩定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩定劑使用量不夠，則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩定劑使用量過高，則會增加成本。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩定劑。在本發明中，所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶根據一種本發明的優選實施方式，本發明使用全自動生化分析儀測定氨(氨離子)時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下(參數)自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應時間10 分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(氨離子)樣品與試劑的體積比例為 1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑溶液配制成如下雙劑試劑由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫組成的試劑1 ；由所述的緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶與氰化氫合成酶組成的試劑2 ；其中還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、 2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、氰化氫在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑配制成如下三劑試劑由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫組成的試劑1 ；
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由所述的緩沖液、穩定劑、氨甲酰磷酸合成酶與氰化氫合成酶組成的試劑2 ；由所述的緩沖液、穩定劑與谷氨酸氧化酶組成的試劑3 ；其中還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、 2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、氰化氫在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。在本發明氨(氨離子)測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。本發明還涉及氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。該氨(氨離子)診斷/測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度范圍的可直接使用的液體試劑緩沖液20_500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. ;35mmol/L谷氨酸氧化酶1000-80000U/L氨甲酰磷酸合成酶 1000-80000U/L氰化氫合成酶1000-80000U/L過氧化氫I-IOOmmo 1/L2-酮戊二酸l-100mmol/L腺苷二磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L氨甲酰磷酸l-100mmol/L氰化氫I-IOOmmo 1/L。根據一種本發明的優選實施方式，本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒有試劑1 緩沖液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L還原型輔酶0. 25mmol/L過氧化氫IOmmol/L2-酮戊二酸10mmol/L腺苷二磷酸5mmol/L單價磷酸鹽IOmmol/L氨甲酰磷酸IOmmol/L氰化氫10mmol/L;組成如下的試劑2 緩沖液IOOmmol/L
穩定劑500mmol/L谷氨酸氧化酶16000U/L氨甲酰磷酸合成酶 18000U/L氰化氫合成酶12000U/L。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒有試劑1 緩沖液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L還原型輔酶0. 25mmol/L過氧化氫IOmmol/L2-酮戊二酸 10mmol/L腺苷二磷酸5mmol/L單價磷酸鹽 IOmmol/L氨甲酰磷酸 10mmol/L氰化氫IOmmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L氨甲酰磷酸合成酶 18000U/L氰化氫合成酶12000U/L;組成如下的試劑3:緩沖液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L谷氨酸氧化酶 16000U/L。根據另一種本發明的優選實施方式，在本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液。優選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油、雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩定劑。在本發明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發明測定氨(氨離子)的方法中，所述的還原型輔酶可以是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。使用本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。在采用本發明方法測定氨(氨離子)時，根據實驗要求進行多次試驗，然后將得到的這些試驗結果按照下式計算出精密度(CV)
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術原理是根據下述谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶的系列催化反應完成氨+過氧化氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+氰化氫+2還原型輔酶氰化氫合成酶甘氨酸+2輔酶
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、 氰化氫合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫， 然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到氨的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間0 分鐘，檢測時間5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于 5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、氰化氫、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶與氰化氫合成酶組成的； 5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶與氰化氫合成酶組成的；其中還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、氰化氫在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與氰化氫組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩定劑、氨甲酰磷酸合成酶與氰化氫合成酶組成的； 試劑3，它是由所述的緩沖液、穩定劑與谷氨酸氧化酶組成的； 其中還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、氰化氫在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度范圍的可直接使用的液體試劑緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L谷氨酸氧化酶1000-80000U/L氨甲酰磷酸合成酶 1000-80000U/L 氰化氫合成酶1000-80000U/L過氧化氫 I-IOOmmo 1/L 2-酮戊二酸 l-100mmol/L 腺苷二磷酸 I-IOOmmo 1/L 單價磷酸鹽 I-IOOmmo 1/L 氨甲酰磷酸 I-IOOmmo 1/L 氰化氫I-IOOmmo 1/L。·6. 2根據權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L過氧化氫I-IOOmmo 1/L2-酮戊二酸l-100mmol/L腺苷二磷酸I-IOOmmo 1/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L氨甲酰磷酸I-IOOmmo 1/L氰化氫I-IOOmmo 1/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L谷氨酸氧化酶1000-80000U/L氨甲酰磷酸合成酶 1000-80000U/L氰化氫合成酶1000-80000U/L。·6. 3根據權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L過氧化氫 I-IOOmmo 1/L2-酮戊二酸 l-100mmol/L腺苷二磷酸 l-100mmol/L單價磷酸鹽 I-IOOmmo 1/L氨甲酰磷酸 I-IOOmmo 1/L氰化氫I-IOOmmo 1/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L氨甲酰磷酸合成酶 1000-80000U/L氰化氫合成酶1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L谷氨酸氧化酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發明涉及利用酶比色法及酶聯法技術的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據谷氨酸氧化酶、氨甲酰磷酸合成酶、氰化氫合成酶的系列催化反應完成，本發明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于臨床醫學/食品檢驗。
文檔編號G01N21/31GK102466720SQ20101053767
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月10日 優先權日2010年11月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司