專利名稱：一種葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素的免疫芯片檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種食品中葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素的免疫芯片檢測方法。
背景技術：
食品安全已成為全球關注的焦點，在我國存在著嚴峻和突出的問題。葡萄球菌腸毒素是引起食物中毒的重要生物毒素，也是較常用的生物戰劑；伏馬菌素對玉米及其制品的污染可能與人類食管癌的高發率有關，是國際上認為的一種具有重大衛生學意義的真菌毒素。目前，并沒有一種簡單可靠的方法對其進行檢測。常用的生物毒素檢測方法有HPLC、 GC-MS, ELISA和膠體金免疫層析法等。HPLC和GC-MS由于是實驗室確證方法，具有定量檢測準確、重復性好，靈敏度高的優點，但操作復雜，需要專業技術人員操作限制了其應用； ELISA和膠體金免疫層析法操作簡單快速，但只能適用于大規模篩查，對于定量檢測仍存在假陽性。免疫芯片又稱蛋白芯片(Protein Chip)，是指固定于支持介質上的蛋白質構成的微陣列。該技術與傳統的檢測方法與傳統的檢測方法相比，有著一定的優越性，因此，日益受到青睞。該研究是以伏馬毒素Bi、葡萄球菌腸毒素A、B為檢測對象，建立用于伏馬毒素 Bl、葡萄球菌腸毒素A、B檢測的免疫芯片的技術方法。本研究先將抗原或抗體固定在醛基化玻片表面，利用經戊二醛等試劑處理過的表面帶有醛基的玻璃片作為載體，通過載體表面的醛基與抗原或抗體的游離氨基的結合實現抗原或抗體的固定。在檢測伏馬毒素B1時采用抗體競爭法。檢測時將待測物伏馬毒素B1與一定量的 Cy3標記的伏馬毒素B1-牛血清白蛋白同時加到玻片上。待測物伏馬毒素B1與標記的伏馬毒素B1-牛血清白蛋白競爭結合玻璃片上固定的抗體。由于標記物是定量的，當待測物濃度越高則結合上的伏馬毒素B1越多，而結合上的標記物就越少，從而熒光信號強度就越弱。 反之，熒光信號就越強，從而實現了待測物的測定。最低檢測限為lPg/mL的伏馬毒素Bp在檢測葡萄球菌腸毒素A、B時采用雙抗體夾心法。對影響免疫芯片檢測結果的實驗條件進行了優化，檢測時將SEA、SEB加入反應池中，反應后清洗掉未結合的SE，再加入相應的標記抗體，形成固定抗體-待測物-標記抗體的夾心式結構。當待測物越多時，結合上的抗原就多，相應結合上的標記抗體也越多，產生的熒光信號也越強，熒光信號強度隨待測物濃度的增加而增加，當濃度高于一定值時，熒光信號強度趨于一定值。并實現了在同一張芯片上同時檢測葡萄球菌腸毒素A、B,按優化后的條件檢測SEA、SEB,最低檢測限均為 0.001 μ g/mLo本研究表明隨著實驗的深入及蛋白質芯片各項技術的進步與成熟，免疫芯片技術正成為食品安全快速檢測中主要發展方向和非常重要的檢測手段之一。可以預見這一高新技術將應用于更廣的領域
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素的免疫芯片檢測方法。本發明要解決的技術問題是克服現有生物毒素葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素檢測耗時長，步驟繁瑣的缺點，先將抗原或抗體固定在醛基化玻片表面，利用經戊二醛等試劑處理過的表面帶有醛基的玻璃片作為載體，通過載體表面的醛基與抗原或抗體的游離氨基的結合實現抗原或抗體的固定，將待測生物毒素與標記的毒素完全抗原競爭結合玻璃片上固定的抗體，并進行靈敏，快速的檢測。其特征包含以下步驟(1)醛基化玻片的活化(2)兔血清中抗體的提取及濃度測定(3)腸毒素抗體和FB1完全抗原的熒光染料Cy3標記(4)實驗條件優化(5)免疫芯片檢測所述的免疫芯片檢測對象為伏馬毒素Bi、葡萄球菌腸毒素A、B中的一種或多種； 所述的伏馬毒素Bi、葡萄球菌腸毒素A、B的最低檢出濃度達到最低檢測限為1 μ g/mL和 0.001 μ g/mLο所述步驟(1)中醛基化玻片的制備步驟如下采用硅烷作為表面活性劑使玻璃片表面氨基化，氨基可以和雙功能試劑戊二醛結合，戊二醛與抗體偶合，從而實現識別分子(抗體)的固定。活化步驟如圖1所示。所述步驟O)中兔血清中抗體的提取及濃度測定中，兔抗SEA抗體為2. 84mg/mL, 兔抗SEB抗體為3. 2%ig/mL，抗體于_20°C冰箱分裝保存。所述步驟(3)中完全抗原的標記及標記物的鑒定中，在實驗中用Cy3標記兔抗 SEA,SEB兩種抗體，用Cy3標記伏馬毒素&-BSA。Cy3染料是一種水溶性的單功能NHS-酯， 激發后可產生很強的熒光，用于標記帶有游離氨基的化合物，是目前在芯片中較多使用的一類染料。每管染料可以標記Img蛋白質。每管染料加50μ L的DMF搖勻，于4°C冰箱中避光保存。所述步驟中實驗條件優化中，PBS實驗條件的優化，選用pH7. 2的0. 01mol/L PBS ；封閉液選用25%胎牛血清為封閉液；抗體的固定時間選定為Ih ；封閉時間選擇為池； 抗原抗體反應時間選擇為池。本發明的優點提供了一種檢測生物毒素的免疫芯片，簡單、快速，應用范圍廣，穩定性高等優點，而且節約實驗成本，為快速檢測生物毒素葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素提供了一種簡單實用的新方法，為建立免疫芯片高通量的生物毒素檢測技術平臺奠定了基礎。
圖1為醛基化玻片的活化。圖2為對不同濃度SEA ( μ g/mL)檢測芯片圖。圖3對不同濃度SEB ( μ g/mL)檢測芯片圖。圖4對不同濃度FB1 ( μ g/mL)檢測芯片圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1 制備可同時檢測SEA和SEB的免疫蛋白芯片
實驗方法如下(1)按照圖1對醛基化玻片進行活化。(2) 2兔血清中抗SEA、SEB抗體的提取及濃度測定2. 1稱取400g分析純(AR)結晶硫酸銨，溶解于預熱到70_80°C的500ml蒸餾水中， 攪拌2小時左右，冷卻至室溫，底部便有結晶析出，此液即為飽和硫酸銨溶液。用氨水調PH至7.0。2. 2取上述飽和硫酸銨溶液10ml，調節PH值至5 6，過濾后取7ml，加入蒸餾水 :3ml，配置成飽和度為70%的硫酸銨溶液。2. 3在0. 5ml的家兔血清中不斷攪拌滴入0. 5ml的70%的硫酸銨溶液，然后將此混合液置于4°C下過夜沉淀。繼而在4°C下ISOOg離心30min，去上清。經傾析和棄去上清液，用蒸餾水在不斷攪拌下加至0. 5mL，再不斷攪拌滴入0. 5ml的70%的硫酸銨溶液，室溫下沉淀4小時，1800g離心30min，去上清。再加蒸餾水至0. 5ml，加70%的硫酸銨溶液 0. 5mL，4°C離心去上清。2. 4得到的蛋白溶液對反復更換的0. 145mol/L NaCl溶液(PH8. 0)進行透析，直到不含硫酸根為止。注對提取后抗體濃度依據下面的公式進行測定蛋白濃度C(mg/ml) = 1. 45XOD280-O. 74XOD260(OD260代表核酸在260nm處的光密度)(OD280代表蛋白質在^Onm處的光密度)2. 5經測定兔抗SEA抗體為2. 8%ig/mL，兔抗SEB抗體為3. 2%ig/mL，抗體于_20°C 冰箱分裝保存。(3) SEA、SEB腸毒素抗體和FB1-BSA的熒光染料Cy3的標記3. 1. 1將待標記的抗體和完全抗原溶于0. 01mol/L, pH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液中， 濃度為lmg/mL。 3.1.2將上述抗體和完全抗原取200 μ L，加入IOyL DMF混勻的Cy3染料混合好， 密封，通過輕輕搖晃或將帶蓋的試管放到旋渦混合器輕輕震蕩以達到充分的混合。在混勻的過程中要防止抗體溶液產生泡沫，將小瓶在室溫下放置30-40min，每IOmin搖勻一次。3. 1. 3準備好kphadex G-50凝膠過濾柱，用0. 01mol/L, pH7. 2的PBS緩沖液在 4°C層析柜進行柱的預平衡。3. 1.4將標記好的的抗體和完全抗原溶液加到凝膠過濾柱中進行過濾，分離用 Cy3標記兔抗SEA、SEB和FB1-BSA時，快速移動的紅色領頭部分即是標記有Cy3的抗體和完全抗原。3. 1. 5將標記好的抗體完全抗原分裝保存于4°C冰箱中。(4)三種毒素抗體在芯片上的固定4. 1用O.Olmol/L pH7. 2的PBS分別稀釋三種毒素抗體，然后用點樣儀將三種抗體點樣加于醛基化玻片的表面，每點約^iL,于37°C飽和濕度下放置0. 5h，然后用洗液沖洗5 次，每次10s，再用蒸餾水沖洗2 5次，晾干。4. 2在固定三種抗體的格中滴加封閉液，37°C飽和濕度下放置0. 5h，然后用蒸餾水沖洗2次，每次10s，晾干，4°C保存。
實施例2 葡萄球菌腸毒素的免疫芯片檢測方法(1)加入標準品在芯片的各檢測格中分別滴加20μ L不同濃度的SEA、SEB毒素溶液，37°C溫育池， 沖洗同上，然后再加入Cy3標記的兔抗SEA、SEB抗體，37°C溫育2h，按上法沖洗，掃描儀掃描。(2)信號的熒光檢測及數據處理抗原抗體反應或抗體競爭反應完畢后，用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000B檢測，熒光信號定量采用軟件GenePix Pro 4. 0進行分析。掃描結果如圖2和圖3所示。實施例3 對伏馬菌素FB1的免疫芯片檢測方法(1)將待測物FB1 (分別取不同濃度FB1 1，10，50，100，200 μ g/ml)，與一定量的 Cy3標記的FB1-BSA等量混勻，取22 μ 1的混合液滴加于固定有抗FB1抗體的玻璃片格中， 于37°C飽和濕度下放置濁，然后用PBS洗液沖洗5次，用蒸餾水沖洗3次，晾干。(2)信號的熒光檢測及數據處理抗原抗體反應或抗體競爭反應完畢后，用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000B檢測，熒光信號定量采用軟件GenePix Pro 4. 0進行分析。掃描結果如圖4所示。
權利要求
1.一種葡萄球菌腸毒素和伏馬菌素的免疫芯片檢測方法，所述的免疫芯片檢測對象為伏馬毒素Bi、葡萄球菌腸毒素A、B中的一種或多種；其特征是包括如下步驟(1)醛基化玻片的活化采用硅烷作為表面活性劑使玻璃片表面氨基化，氨基可以和雙功能試劑戊二醛結合， 戊二醛與抗體偶合，從而實現識別分子(抗體)的固定。(2)兔血清中抗體的提取及濃度測定·2.1稱取400g分析純(AR)結晶硫酸銨，溶解于預熱到70-80°C的500ml蒸餾水中，攪拌2小時左右，冷卻至室溫，底部便有結晶析出，此液即為飽和硫酸銨溶液。用氨水調 PH 至 7. 0。·2. 2取上述飽和硫酸銨溶液10ml，調節PH值至5 6，過濾后取7ml，加入蒸餾水:3ml， 配置成飽和度為70%的硫酸銨溶液。·2. 3在0. 5ml的家兔血清中不斷攪拌滴入0. 5ml的70%的硫酸銨溶液，然后將此混合液置于4°C下過夜沉淀。繼而在4°C下ISOOg離心30min，去上清。經傾析和棄去上清液，用蒸餾水在不斷攪拌下加至0. 5ml，再不斷攪拌滴入0. 5ml的70%的硫酸銨溶液，室溫下沉淀 4小時，1800g離心30min，去上清。再加蒸餾水至0. 5ml，加70%的硫酸銨溶液0. 5ml,4°C 離心去上清。·2. 4得到的蛋白溶液對反復更換的0. 145mol/L NaCl溶液(PH8. 0)進行透析，直到不含硫酸根為止注對提取后抗體濃度依據下面的公式進行測定蛋白濃度 C(mg/ml) = 1.45XOD280-O. 74XOD260(OD260代表核酸在^Onm處的光密度)(OD280代表蛋白質在280nm處的光密度)·2.5經測定兔抗SEA抗體為2. 8%ig/mL，兔抗SEB抗體為3. 2%ig/mL，抗體于_20°C冰箱分裝保存。(3)腸毒素抗體和FB1完全抗原的熒光染料Cy3標記·3.1. 1將待標記的抗體和完全抗原溶于0. 01mol/L, pH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液中，濃度為 lmg/mL0·3. 1. 2將上述抗體和完全抗原取200 μ L，加入10 μ L DMF混勻的Cy3染料混合好，密封， 通過輕輕搖晃或將帶蓋的試管放到旋渦混合器輕輕震蕩以達到充分的混合。在混勻的過程中要防止抗體溶液產生泡沫，將小瓶在室溫下放置30-40min，每IOmin搖勻一次。·3·. 1. 3準備好S印hadex G-50凝膠過濾柱，用0. 01mol/L，pH7. 2的PBS緩沖液在4°C層析進行柱的預平衡。·3. 1. 4將標記好的的抗體和完全抗原溶液加到凝膠過濾柱中進行過濾，分離用Cy3標記兔抗SEA、SEB和FB1-BSA時，快速移動的紅色領頭部分即是標記有Cy3的抗體和完全抗原。·3. 1. 5將標記好的抗體完全抗原分裝保存于4°C冰箱中。(4)實驗條件優化實驗條件優化中，PBS實驗條件的優化，選用pH7. 2的0. 01mol/L PBS ；封閉液選用25% 胎牛血清為封閉液；抗體的固定時間選定為Ih ；封閉時間選擇為池；抗原抗體反應時間選擇為池。(5)免疫芯片檢測 5. 1加入標準品在芯片的各檢測格中分別滴加20 μ L不同濃度的毒素溶液，37°C溫育池，沖洗同上，然后再加入Cy3標記的相對應的抗體，37°C溫育池，沖洗，掃描儀掃描。 (2)信號的熒光檢測及數據處理抗原抗體反應或抗體競爭反應完畢后，用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000B檢測，熒光信號定量采用軟件GenePix Pro 4. 0進行分析。
全文摘要
本發明涉及一種葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB)和伏馬菌素(AFB1)的免疫芯片檢測方法，實現了在同一張芯片上的同時檢測。檢測AFB1是在醛基化玻璃片表面固定其單抗，并與一定量的Cy3標記的完全抗原同時加到芯片上，采用競爭法進行免疫芯片的技術研究。在檢測SEA、SEB時采用雙抗體夾心法，并進行了實驗條件的優化，檢測時將SEA、SEB加入反應池中，反應后清洗掉未結合的SE，再加入相應的標記抗體，形成固定抗體-待測物-標記抗體的夾心式結構，熒光信號強度隨待測物濃度的增加而增加。該方法操作簡單，靈敏快速，成本低廉，結果獲得穩定可靠，整個檢測過程僅耗時1～2小時，為多種生物毒素的快速檢測提供了新方法。
文檔編號G01N33/552GK102455356SQ201010523848
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者劉楠, 左小霞, 高志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所