用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像方法及其系統的制作方法

專利名稱：用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像方法及其系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及用來實現高通量、高精度、無標記、實時傳感 蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-效應物、抗原-抗體、配體-受體、藥物-靶等生物 分子相互作用的方法及其蛋白質芯片檢測系統。
背景技術：
生命科學已經進入蛋白質組學研究時代。蛋白質組學是研究一種基因組所表達的 全套蛋白質，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。它必須在大規模水平上 才能研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾以及蛋白質與蛋白質的相 互作用等；同時，還注重研究參與特定生理或病理狀態的所有蛋白質種類及其與周圍環境 (分子)的關系。人體中，蛋白質不僅數量比基因多，而且具有時空特性比基因復雜，如何檢 測成千上萬種蛋白質間以及蛋白質與其它生物大分子間的相互作用是蛋白質組學所面臨 的挑戰。需要強調，蛋白質組的研究不僅能為透切理解生命活動規律提供理論和實驗，也能 為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理論根據和解決途徑。通過對正常個體及病理個體間 的蛋白質組比較分析，可以找到某些“疾病特異性的蛋白質分子”，成為新藥物設計的分子 靶點或為疾病的早期診斷提供分子標志。其實，那些世界范圍內銷路最好的藥物本身就是 蛋白質或其作用靶點也為某種蛋白質分子。正因為如此，基因組學的檢測技術還不能滿足 蛋白質組學的要求，蛋白質組學檢測技術應具備的特點一是高通量，一次可以檢測幾十、 幾百甚至成千種蛋白質；二是高靈敏度，人體中各種蛋白質的豐度即含量相差達幾億倍，必 須高靈敏度才能適應檢測低豐度蛋白質的要求；三是實時，有時蛋白質之間的相互作用可 能瞬時即逝，必須及時捕足。基于表面等離子體共振(surface ρlasmon resonance，簡稱SPR)的生物傳感是一 種具有高靈敏度、實時、無標記等特點的光學檢測方法，被認為是檢測生物分子相互作用的 較理想方法。SPR生物傳感的檢測方法主要有角度掃描、光強檢測和相位檢測等，其中相位 檢測的靈敏度較高。在相位檢測中，又有外差、馬赫-澤德干涉、空間調制與時域調制干涉 成像等方法，其中時域調制干涉成像法能實現的檢測通量更高。為此，本專利發明人已提出 了基于時域相位調制干涉的表面等離子體共振陣列生物傳感方法及系統(參見中國專利 號ZL200510086332. 7)，基本原理如圖1所示。光源101發出的平行光透過棱鏡102和折射 率匹配層103，入射到傳感芯片的玻璃基底104和鍍在其上的金膜105之間的界面上，金膜 的厚度為30-50nm，并從該界面反射。當入射光位于共振角上時，激發金膜表面的等離子體 共振，使得從玻璃基底104和金膜105之間的界面上反射的光的相位隨金膜表面介質折射 率的改變而劇烈變化。反射光透過折射率匹配層103、棱鏡102和一維擴束鏡106后，射入 電光晶體107。電光晶體107由高壓調制電源108控制，可以在其上施加5種不同的電壓。 隨之，當光通過電光晶體107后，反射光的P和S偏振分量之間就被附加上對應的5個不同 相位差。調制后的光在通過偏振棱鏡109時，P偏振光和S偏振光發生干涉，干涉圖像經成 像透鏡110后，成像在CXD 111上。CXD 111上圖像的采集與高壓調制電源108輸出的對4應電壓同步，高壓調制電源108輸出5種不同的電壓為1個周期，對應采集5幀圖像也為1 個周期。高壓調制電源108可以不斷循環輸出電壓，對應的干涉圖像也可以持續循環采集。 接著，利用Hariharan算法，對在同一個周期中所采集的相鄰的5幀干涉圖像進行解算，得 到即時反射光的相位變化。理論上，只需一個CCD的像素，利用這種方法就可檢測傳感芯片 上的一個傳感點，能實現很高通量的檢測。然而，當在電光晶體107上施加高電壓時，隨之 會出現逆壓電效應，造成電光晶體的結構發生微尺度的變化，引起光路微小偏移，即光斑位 置移動，直接產生測量誤差，難以達到高精度的要求。這是電光晶體固有的缺陷，無法彌補。 不僅如此，該方法是分時而不是同時采集5幀圖像，盡管間隔時間較短，然而也只能算“準 實時”，而不是真正意義上的實時。這樣，生物反應中的瞬時變化就很難捕捉到，這種變化卻 很可能是重要的生物信息。

發明內容
本發明的目的在于克服上述技術的不足，提供一種新的用于生物分子相互作用實 時檢測的干涉成像方法及系統，能夠高通量、高精度、實時、無標記檢測蛋白質芯片，獲取蛋 白質分子之間以及蛋白質與其它生物分子相互作用的信息。本發明提供了一種用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像方法，其特征在 于，該方法是基于表面等離子體共振陣列生物傳感原理，光源發出的光經準直再通過偏振 棱鏡，并經擴束后射到傳感單元中；從傳感單元反射的光經二分之一波片、成像鏡頭和偏振 分束棱鏡后，分成透射和反射2路光，該2路光的傳播方向正交，且同時分別干涉成像在2 臺CXD上，2路干涉圖像的相位差為180° ；計算機實時從2臺CXD上采集到相位差為180° 的2幀干涉圖像，通過解算該2幀干涉圖像，得到1張反映即時金膜表面的折射率分布信息 圖；不斷測量傳感單元中連續發生的反應，得到一系列折射率分布隨時間變化的實時信息 圖。本發明具體包括以下步驟1)半導體激光器發出的光經過光纖耦合和準直后，再通過偏振器，得到偏振方向 可調的線偏振準直光束；2)所述的線偏振準直光束通過擴束鏡后，入射到生物傳感單元中的傳感芯片的玻 璃基底與金膜之間的界面上，激發金膜上的表面等離子體共振，同時又從該界面反射；3)所述的反射光通過二分之一波片，該二分之一波片的快軸方向與S偏振方向成 22. 5°角，以便調整反射光的偏振狀態，接著通過成像鏡頭，由成像鏡頭將金膜表面成像；4)通過成像鏡頭的光又射入偏振分束棱鏡，經過偏振分束棱鏡后被分成傳播方向 為正交的2路偏振光，同時每路偏振光均產生干涉，2路偏振光所產生的干涉圖像的相位差 為180°，分別投射在2臺CXD上，即將干涉圖像成像CXD上，2路偏振光的干涉圖像都包含 同一金膜表面的折射率分布信息；5)計算機實時采集成像在2臺CXD上的干涉圖像，即相位差為180°的2幀圖像， 并進行存儲與處理；6)計算機利用采集到相位差為180°的2幀干涉圖像，根據公式
計算出這2幀干涉圖像所反映的金膜表面折射率分布，即得到折射率分布信息 圖；式中，I0為其中一幀干涉圖像的灰度，I180為另一幀干涉圖像的灰度；7)生物反應不斷進行，計算機持續采集干涉圖像，實時解算所采集到的干涉圖像， 便得到一系列反映生物分子相互作用所對應的折射率變化信息圖。基于上述的折射率變化信息圖，可從中解析出所檢測生物分子的特異性、親和力 以及動力學常數等，提供給生物醫學專家用于疾病診斷或發現新藥靶與開發新藥。本發明還提供了一種基于上述方法的用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成 像系統，其特征在于包括產生準直光的入射臂，接收準直光并激發表面等離子體共振的 生物傳感單元，將從生物傳感單元射出的光分成正交的2路偏振光且分別干涉成像的反射 臂，以及包含獲取干涉圖像的2臺CCD和計算機的信號采集處理單元；所述入射臂中的偏振激光準直部分包括半導體激光器、依次設置在半導體激光 器出射光路中的單模光纖、激光準直器、偏振棱鏡和擴束鏡；所述半導體激光器的波長為600-900nm;所述入射臂中的擴束鏡的擴束倍數為 2-8 倍。所述生物傳感單元利用表面等離子體共振的原理，包括接收從入射臂射出的光的 直角或梯形棱鏡，置于直角或梯形棱鏡底面的折射率匹配層，置于折射率匹配層下的傳感 芯片以及位于傳感芯片下面的流體池；該傳感芯片由玻璃基底以及鍍在該玻璃基底的下表 面上的30-50nm厚的金膜，其中棱鏡、折射率匹配層和傳感芯片玻璃基底的折射率相同；所 述的折射率匹配層為與棱鏡及傳感芯片玻璃基底折射率相同的折射率油膜。所述反射臂中包括設置在生物傳感單元出射光路中的二分之一波片、成像鏡頭和 偏振分束棱鏡，其中二分之一波片的快軸方向與S偏振方向成22. 5°角(以便于調整反射 光的偏振狀態；成像鏡頭將金膜表面成像，偏振分束棱鏡使從成像鏡頭射入的光分成傳播 方向正交且偏振方向正交的2路且產生干涉，同時還分別投射在2臺CXD上，即將金膜表面 的干涉圖像成像在C⑶上，2幀干涉圖像的相位差為180° )；所述信息采集處理單元包括2臺C⑶或CMOS以及與之相連的計算機；2臺CXD分 別正對著從偏振分束棱鏡正交射出的2路干涉偏振光，且CXD正好位于成像透鏡的焦面上 (即干涉圖像同時成像在2臺C⑶上；計算機從2臺CXD中實時采集到相位差為180°的 2幀干涉圖像，利用這2幀圖像計算出即時金膜表面的折射率分布，即為即時的金膜表面的 折射率分布信息圖)。本發明的特點及有益效果本發明采集到的2幀干涉圖像是金膜表面同一時刻的實像，沒有任何時間差，實 現了真正意義上的實時獲取圖像，優于任何移相調制干涉成像法。信號處理的優點是得到 的折射率變化的信息圖與初始的光強分布無關，避免了光強分布的不均勻性帶來的誤差， 同時還抑制光強漂移造成的測量誤差。生物分子相互作用不斷進行，干涉圖像連續采集，折 射率變化分布圖實時得到，從而可以實時檢測或監控生物分子相互作用。在整個系統中，無論是入射臂，還是反射臂，既沒有電光調制器件，更沒有運動元 件或部件，且在偏振分束棱鏡前都是共光路，穩定可靠，有利于提高檢測靈敏度和可靠性， 這是本發明的最大特點。本發明提供的方法以及利用該方法實現的系統，可以高通量、高精度、實時和無標記檢測，獲取生物分子相互作用的信息，提供給生物醫學和藥物研究人員，進行蛋白組學研 究、疾病診斷、藥物發現與開發等。


圖1為已有的一種SPR時域調制相位檢測原理示意圖。圖2為本發明實施的用于生物分子相互作用實時檢測的表面等離子體共振干涉 成像系統的示意圖。圖3為本發明實施的C⑶結構的示意圖。圖4為本發明實施的檢測及信號處理過程的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例，對本發明的方法以及利用該方法實現的系統進行詳細說 明。本發明的系統實施例結構如圖2所示，由生物傳感單元、入射臂、反射臂和信號采 集處理單元等四大部分組成。本發明所述的生物傳感單元為表面等離子體共振生物傳感 器，包括直角棱鏡206、傳感芯片208和置于傳感芯片與棱鏡之間的折射率匹配層207、傳感 芯片208的玻璃基底的下表面鍍有40nm厚的金膜209，以及位于傳感芯片208下面的流體 池210，傳感芯片208與流體池210緊貼且密封。本發明所述的入射臂位于生物傳感單元的一側，依次包括控溫半導體激光器201、 單模光纖202、激光準直器203、偏振棱鏡204和擴束鏡205，擴束鏡與直角棱鏡206的入射 面平行。本發明所述的反射臂位于與入射臂相對應的生物傳感單元的另一側，依次包含二 分之一波片211、成像鏡頭212和偏振分束棱鏡213，二分之一波片211與直角棱鏡206的 出射面平行。本發明所述的信號采集處理單元包含CXD 214和CXD 215，以及用于圖像采集和 數據處理的計算機，CXD 214和CXD 215分別接收經偏振分束棱鏡213分成的兩束光，圖像 采集和數據處理的計算機分別與CXD 214和CXD 215的輸出端相連。本實施例的各部件的具體實現及工作原理在本發明所述的入射臂中，控溫半導體激光器201為DL-3148-025或其它型號，其 波長和功率分別為600-900nm和0. 5_10mW，在恒流電源的驅動下，發出光強穩定的激光，光 經格林透鏡耦合到單模光纖202中，并在單模光纖202中傳輸一段距離再進入準直器203， 通過其后即成為光斑為3-10mm的準直光束。接著，又透過偏振棱鏡204，成為線偏振光，其 偏振方向可調。最后，線偏振光通過擴束鏡205，被擴束成直徑為10-50mm的準直光束，直接 射到生物傳感單元中。在本發明所述的生物傳感單元中，棱鏡206與傳感芯片208的玻璃基底使用相同 的K9或ZF5玻璃，厚度為0. 8-3mm ；折射率匹配層207的折射率與棱鏡206和傳感芯片208 的玻璃基片折射率相同，折射率匹配層207為折射率油膜。傳感芯片208的玻璃基片的一 面鍍有30-50nm的金膜209，金膜209表面使用化學方法組裝一層親水的膜，用于偶聯探針 分子。流體池210與金膜209緊貼且密封，金膜209的表面成為流體池的一面壁。當被檢7測的生物分子溶液從流體池中流過時，溶液中被分析的生物分子與固定在金膜表面的探針 分子耦聯即相互作用，引起金膜表面結構改變，隨之對應的折射率發生變化。準直光束透過 棱鏡206、折射率匹配層207和傳感芯片208的玻璃基底，在玻璃基底和金膜209的界面發 生全反射。當入射角為共振角時，入射光的能量由倏逝波耦合到金膜209中，激發金膜表面 等離子體共振。由生物傳感單元反射的光，通過反射臂上的二分之一波片211時，反射光的偏振 態得到調整，又經成像鏡頭212后將金膜表面成像，再經偏振分束棱鏡213，光被分成傳播 方向正交的2路，同時還分別產生干涉，2路干涉圖像的相位差為180°，成像在所對應的 CXD 214或CXD 215的上，2臺C⑶上的干涉圖像為同一時刻金膜表面的實像。在本發明實施的信號采集處理單元中，計算機同時從CXD 214和CXD 215上采集 到相位差為180°的2幀干涉圖像后，根據公式(1)進行實時處理，得到即時金膜表面上生 物分子相互作用時所對應的折射率分布信息圖。本發明實施例的CXD工作過程如圖3所示，包括圖像傳感器CXD芯片1和CXD芯 片2分別將投射在其上的干涉圖像同時轉換為電信號，再經A/D轉換成數字信號。接著，這 2路數字信號先經FPGA，再通過接口芯片，傳輸到計算機中，進行處理或存盤。計算機可通 過接口芯片，將曝光時間、A/D芯片寄存器配置等參數傳送給FPGA芯片，前者控制CXD芯片 的曝光信號的產生，后者配置A/D芯片。FPGA芯片可產生C⑶水平和垂直時鐘，以及曝光和 幀同步信號，這些信號控制CCD驅動電路進行電壓變換和功率放大，而后驅動CCD芯片。同 時，FPGA芯片不僅要產生A/D采樣時鐘來控制A/D模數轉換，而且還要產生幀同步和像素 時鐘信號，傳送到接口芯片，控制同步采集過程。本實施例的檢測及信號處理過程如圖4所示。測量開始，由計算機同時讀入CCD 芯片1和C⑶芯片2傳感的相位差為180°的2幀干涉圖像。緊接著，根據公式[1]，計算 機對2幀干涉圖像進行處理，計算得到1張反映金膜表面即時折射率分布信息圖。同時，也 可以根據需要選擇金膜表面上感興趣的傳感點，確定該點的即時折射率，繪制對應的測量 曲線，便完成了一個操作周期。重復該過程，又可以得到1張新的反映金膜表面即時折射率 分布信息圖，這張信息圖相對前一張是變化了的，即與前一張的折射率分布不同。計算這2 張信息圖之間的差異，便可得到該傳感點上發生分子相互作用時引起的折射率變化。不斷 重復進行，就可以實時檢測生物分子相互作用的全過程，并繪出或打印出該傳感點的折射 率隨時間變化的曲線，提供給生物醫學研究人員進行相關解析，以便為臨床診斷、藥物發現 及開發服務。
權利要求
1.一種用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像方法，其特征在于，該方法是基于 表面等離子體共振陣列生物傳感原理，將光源發出的光經準直再通過偏振棱鏡，并經擴束 后射到傳感單元中；從傳感單元反射的光經二分之一波片、成像鏡頭和偏振分束棱鏡后，分 成透射和反射2路光，該2路光的傳播方向正交，且同時分別干涉成像在2臺CXD上，2路 干涉圖像的相位差為180° ；計算機實時從2臺C⑶上采集到相位差為180°的2幀干涉圖 像，通過解算該2幀干涉圖像，得到1張反映即時金膜表面的折射率分布信息圖；不斷測量 傳感單元中連續發生的反應，得到一系列折射率分布隨時間變化的實時信息圖。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟1)半導體激光器發出的光經過光纖耦合和準直后，再通過偏振器，得到偏振方向可調 的線偏振準直光束；2)所述的線偏振準直光束通過擴束鏡后，入射到生物傳感單元中的傳感芯片的玻璃基 底與金膜之間的界面上，激發金膜上的表面等離子體共振，同時又從該界面反射；3)所述的反射光通過二分之一波片，該二分之一波片的快軸方向與S偏振方向成 22. 5°角，以便調整反射光的偏振狀態，接著通過成像鏡頭，由成像鏡頭將金膜表面成像；4)通過成像鏡頭的光又射入偏振分束棱鏡，經過偏振分束棱鏡后被分成傳播方向為 正交的2路偏振光，同時每路偏振光均產生干涉，2路偏振光所產生的干涉圖像的相位差為 180°，分別投射在2臺CXD上，即將干涉圖像成像CXD上，2路偏振光的干涉圖像都包含同 一金膜表面的折射率分布信息；5)計算機實時采集成像在2臺CCD上的干涉圖像，即相位差為180°的2幀圖像，并進 行存儲與處理；6)計算機利用采集到相位差為180°的2幀干涉圖像，根據公式[1]A=ioil8G_ [！]I0+I180計算出這2幀干涉圖像所反映的金膜表面折射率分布，即得到折射率分布信息圖；式 中，Io為其中一幀干涉圖像的灰度，I180為另一幀干涉圖像的灰度；7)生物反應不斷進行，計算機持續采集干涉圖像，實時解算所采集到的干涉圖像，便得 到一系列反映生物分子相互作用所對應的折射率變化信息圖。
3.一種基于上述方法的用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像系統，其特征在 于包括產生準直光的入射臂，接收準直光并激發表面等離子體共振的生物傳感單元，將從 生物傳感單元射出的光分成正交的2路偏振光且分別干涉成像的反射臂，以及包含獲取干 涉圖像的2臺CCD和計算機的信號采集處理單元；所述入射臂中的偏振激光準直部分包括半導體激光器、依次設置在半導體激光器出 射光路中的單模光纖、激光準直器、偏振棱鏡和擴束鏡；所述生物傳感單元包括接收從入射臂射出的光的直角或梯形棱鏡，置于直角或梯形 棱鏡底面的折射率匹配層，置于折射率匹配層下的傳感芯片以及位于傳感芯片下面的流體 池；該傳感芯片由玻璃基底以及鍍在該玻璃基底的下表面上的30-50nm厚的金膜，所述棱 鏡、折射率匹配層和傳感芯片玻璃基底的折射率相同；所述反射臂中包括設置在生物傳感 單元出射光路中的二分之一波片、成像鏡頭和偏振分束棱鏡，該二分之一波片的快軸方向 與S偏振方向成22. 5°角；所述信息采集處理單元包括2臺CCD或CMOS以及與之相連的計算機；2臺CCD的接收 面分別與從偏振分束棱鏡正交射出的2路干涉偏振光垂直，且CCD位于成像透鏡的焦面上。
4.如權利要求3所述的系統，其特征在于，所述半導體激光器的波長為600-900nm；所 述入射臂中的擴束鏡的擴束倍數為2-8倍。
5.如權利要求3所述的系統，其特征在于，所述的折射率匹配層為與棱鏡及傳感芯片 玻璃基底折射率相同的折射率油膜。
全文摘要
本發明涉及用于生物分子相互作用實時檢測的干涉成像方法及其系統，屬于生物技術領域；該方法包括光源發出的光經準直、偏振，并經擴束后射到傳感單元中；從傳感單元反射的光經二分之一波片、成像鏡頭和偏振分束棱鏡后，分成傳播方向正交的透射和反射2路光，且成像在2臺CCD上；計算機實時采集2幀干涉圖像，通過解算，得到1張折射率分布信息圖；不斷測量傳感單元，得到一系列折射率分布隨時間變化的實時信息圖。該系統包括產生準直光的入射臂，接收準直光并激發表面等離子體共振的生物傳感單元，以及采集處理單元；本發明能夠高通量、高精度、實時、無標記檢測蛋白質芯片，獲取蛋白質分子之間以及蛋白質與其它生物分子相互作用的信息。
文檔編號G01N21/45GK102042972SQ20101052378
公開日2011年5月4日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者余興龍, 張瑋, 王大千, 羅昭鋒, 鄧焱 申請人:清華大學