專利名稱：一種超高分辨率的光學顯微成像方法及裝置的制作方法
一種超高分辨率的光學顯微成像方法及裝置技術領域
本發明屬于光學顯微技術領域，特別地涉及一種超高分辨率的光學顯微成像方法 及裝置。
背景技術：
隨著微納米技術的蓬勃發展，人們對能在細胞、納米乃至原子水平上對物質進行 觀察和研究的儀器的要求越來越高。盡管近幾十年發展起來的掃描電子顯微鏡(SEM)、掃描 隧道顯微鏡(STM)、原子力顯微鏡(AFM)和近場光學顯微鏡(SNOM)的分辨率可以達到微納 米級，但也存在設備龐大、價格昂貴、操作復雜等缺點，同時，它們所獲得的樣品圖像是經過 掃描并重建的，無法實現光學顯微鏡那樣對樣品進行實時而直接的觀察成像。因此許多科 學研究和工業領域應用較多的仍是一般的光學顯微鏡。
不過，傳統的光學顯微鏡其分辨率受到光學衍射的限制。根據瑞利判據，兩個被照 明的物體，只有它們之間的距離d大于0.61λ/(Ν.Α.)時才能被區分開，其中λ表示入射 光波長，N. Α.表示數值孔徑，即為物方折射率η與物鏡在樣品一側的半孔徑角正弦sine的 乘積。因此提高光學顯微鏡分辨率的途徑主要有兩個，一是縮短入射光的波長λ，二是提高 顯微鏡的數值孔徑N. Α.，包括通過設計復合透鏡加大顯微物鏡的孔徑角θ和采用油浸物 鏡增大物鏡與樣品之間的折射率η。單純增大孔徑角只能使N. Α.增大到0.95，即使采用油 浸物鏡，N. Α.最大也只能到1.5。而且使用上述方法在原來的基礎上再進一步提高光學顯 微鏡的分辨率必然會使設備的技術難度和成本都急劇的上漲。本發明提出和發展了一種超 高分辨率的光學顯微成像方法，建立超高分辨率的光學顯微成像裝置。采用窄帶濾光、環形 孔徑及暗視場照明相結合的特種照明及顯微成像方法，實現對微納米尺寸物質的超高分辨 率和高對比度的顯微成像，滿足在工業、農業、國防和科學技術等國民經濟與社會發展各領 域的需求。發明內容
本發明的目的是克服現有光學顯微技術的不足，提供一種超高分辨率的光學顯微 成像方法及裝置。
超高分辨率的光學顯微成像方法是在透射式遠場光學顯微鏡聚光鏡前引入窄帶 濾光片和環形孔徑，LED強光源發出的平行照明光，通過窄帶濾光片獲得短波長的準單色 光，然后用擋光板遮擋準單色光的光束中心部分，僅讓周邊部分透過環形透光孔，環形孔徑 相當于孔徑濾波器，讓高頻細節成分通過光學系統，而將低頻彌散成分有效地抑制，從而實 現高分辨率的顯微成像；這一環形光束被聚光鏡聚焦，產生高傾斜的空心圓錐狀光束，照亮 并透過樣品后，又以倒立的空心圓錐光束方式照射到一遮光圓片，只讓大數值孔徑那部分 光線通過顯微物鏡參與成像，而將中心部分遮擋，從而包含樣品特征信息的透射和散射光 線進入物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的基礎上，進一步實現高分辨顯微成像。
超高分辨率的光學顯微成像裝置包括環形孔徑照明及顯微成像裝置、CXD圖像傳3感器、圖像采集卡、計算機、電源、粗調焦旋鈕、細調焦旋鈕、光源亮度調節旋鈕和支架；支架 上設有環形孔徑照明及顯微成像裝置、粗調焦旋鈕、細調焦旋鈕和光源亮度調節旋鈕；環 形孔徑照明及顯微成像裝置、CXD圖像傳感器、圖像采集卡、計算機和電源順次相連；環形 孔徑照明及顯微成像裝置包括LED強光源、窄帶濾光片、擋光板、環形透光孔、聚光鏡、樣品 臺、遮光圓片、顯微物鏡、目鏡和轉接透鏡；在同一光軸上依次設有LED強光源、窄帶濾光 片、擋光板、環形透光孔、聚光鏡、樣品臺、遮光圓片、顯微物鏡、目鏡、轉接透鏡。
本發明既保持常規光學顯微鏡的實時、直接、無掃描的成像觀測方式，同時提供更 高的分辨率和更好的圖像對比度，結構簡潔，成本低，技術條件易于實現。采用窄帶濾光、環 形孔徑及暗視場照明相結合的特種照明及顯微成像方法，同時設計了不同數值孔徑、透過 率和濾色特性的環形透光孔徑，使顯微鏡分辨率突破了瑞利衍射極限分辨率，而且獲得的 顯微圖像對比度好，可望在微納米檢測、生物醫學研究、醫學診斷、以及材料學等領域得到 廣泛應用。
圖1為超高分辨率光學顯微成像裝置結構示意圖及系統框圖2為超高分辨率光學顯微成像光路圖3為實施例1擋光板及環形透光孔徑系列圖4為實施例2擋光板及環形透光孔徑系列圖中環形孔徑照明及顯微成像裝置1、LED強光源2、窄帶濾光片3、擋光板4、環 形透光孔5、聚光鏡6、樣品臺7、遮光圓片8、顯微物鏡9、目鏡10、轉接透鏡11、CXD圖像傳 感器12、圖像采集卡13、計算機14、電源15、粗調焦旋鈕16、細調焦旋鈕17、光源亮度調節 旋鈕18、支架19。
具體實施方式
本發明是以透射式遠場光學顯微鏡為主體，在聚光鏡前引入窄帶濾光片(如中心 波長約為430nm，帶寬lOnm)和環形孔徑。LED強光源發出的平行照明光，通過窄帶濾光片 獲得短波長(如波長430nm左右)的入射光，可以有效提高顯微系統的分辨率；環形孔徑相 當于孔徑濾波器，讓樣品高頻細節成分通過光學系統，而將低頻彌散成分有效地抑制，從而 實現高分辨率的顯微成像；而且由環形孔徑產生的斜入射光照明樣品后，又以倒立的空心 圓錐光束方式進入一遮光圓片，只讓大數值孔徑那部分光線通過顯微物鏡(如采用IOOX 油浸物鏡，數值孔徑N. A.約為1.2 參與成像，而將中心部分遮擋，從而包含樣品特征信息 的透射和散射光線進入物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的基礎上，進一步實現 高分辨顯微成像。
如圖1、2所示，超高分辨率的光學顯微成像裝置包括環形孔徑照明及顯微成像裝 置1、(XD圖像傳感器12、圖像采集卡13、計算機14、電源15、粗調焦旋鈕16、細調焦旋鈕17、 光源亮度調節旋鈕18和支架19 ；支架19上設有環形孔徑照明及顯微成像裝置1、粗調焦旋 鈕16、細調焦旋鈕17和光源亮度調節旋鈕18 ；環形孔徑照明及顯微成像裝置1、CXD圖像 傳感器12、圖像采集卡13、計算機14和電源15順次相連；環形孔徑照明及顯微成像裝置1 包括LED強光源2、窄帶濾光片3、擋光板4、環形透光孔5、聚光鏡6、樣品臺7、遮光圓片8、顯微物鏡9、目鏡10和轉接透鏡11 ；在同一光軸上依次設有LED強光源2、窄帶濾光片3、擋 光板4、環形透光孔5、聚光鏡6、樣品臺7、遮光圓片8、顯微物鏡9、目鏡10和轉接透鏡11。
如圖3所示，實施案例一設計了不同大小的環形孔徑，在擋光板上制作一系列環 形透光孔，采用環形孔徑照明可以有效提高顯微系統分辨率。
如圖4所示，實施例二在實施例一的基礎上，將中央擋光圓設計成具有不同的透 過率，采用此種環形孔徑可以克服實施例一種環形孔徑帶來的衍射旁瓣的影響。
另外也可以不使用窄帶濾光片，而是將中央擋光圓與環形透光孔設計成具有不同 的濾色特性，相當于對圖像進行彩色編碼，增強圖像對比度。
超高分辨率的光學顯微成像方法是在透射式遠場光學顯微鏡聚光鏡前引入窄帶 濾光片和環形孔徑，LED強光源發出的平行照明光，通過窄帶濾光片獲得短波長的準單色 光，然后用擋光板遮擋準單色光的光束中心部分，僅讓周邊部分透過環形透光孔，環形孔徑 相當于孔徑濾波器，讓高頻細節成分通過光學系統，而將低頻彌散成分有效地抑制，從而實 現高分辨率的顯微成像；這一環形光束被聚光鏡聚焦，產生高傾斜的空心圓錐狀光束，照亮 并透過樣品后，又以倒立的空心圓錐光束方式進入一遮光圓片，只讓大數值孔徑那部分光 線通過顯微物鏡參與成像，而將中心部分遮擋，從而包含樣品特征信息的透射和散射光線 進入物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的基礎上，進一步實現高分辨顯微成像。
本發明的工作過程如下
接通電源15，通過光源亮度調節旋鈕18調節LED強光源2的照明光亮度，照明光 線通過窄帶濾光片3獲得短波長的準單色光；濾光后的照明光束中心部分被擋光板4遮擋， 僅讓周邊部分透過環形透光孔5 ；這一環形光束被聚光鏡6聚焦，產生高傾斜的空心圓錐光 束，斜入射光照明樣品臺7上樣品后，通過一遮光圓片8，只讓大數值孔徑那部分光線通過 顯微物鏡9參與成像，而將中心部分遮擋，從而包含樣品特征信息的透射和散射光線進入 物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的基礎上，進一步實現高分辨顯微成像。在顯微 物鏡9后得到的樣品像，通過目鏡10接收放大，再經轉接透鏡11在CXD圖像傳感器12上 成像，視頻信號在圖像采集卡13中經A/D轉換、比例縮放等處理后，送往計算機14經顯示 器實時顯示。通過粗調焦旋鈕16和細調焦旋鈕17調節顯微物鏡相對于樣品的距離，直至 顯示器上的顯微圖像最清晰、最符合要求時再凍結圖像。可以根據需要采用不同數值孔徑、 透過率和濾色特性的環形透光孔徑，來有效提高顯微系統分辨率、減小衍射旁瓣的影響或 對圖像進行彩色編碼，增強圖像對比度。
本發明采用窄帶濾光、環形孔徑及暗視場照明相結合的特種照明及顯微成像方 法，在聚光鏡前引入窄帶濾光片獲得短波長的入射光，可以有效提高顯微系統的分辨率；在 照明光路中設置環形孔徑，產生高傾斜的空心圓錐狀光束，該光束斜入射照明樣品后照射 到一遮光圓片，只讓大數值孔徑那部分光線通過顯微物鏡參與成像，而將中心部分遮擋，從 而包含樣品特征信息的透射和散射光線進入物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的 基礎上，進一步實現高分辨顯微成像。樣品邊緣及一些細節得到增強，實現對微納米尺寸物 質的超高分辨率和高對比度的顯微成像。滿足在微納米檢測、生物醫學研究、醫學診斷、以 及材料學等領域的廣泛需求。
權利要求
1.一種超高分辨率的光學顯微成像方法，其特征在于在透射式遠場光學顯微鏡聚光鏡 前引入窄帶濾光片和環形孔徑，LED強光源發出的平行照明光，通過窄帶濾光片獲得短波長 的準單色光，然后用擋光板遮擋準單色光的光束中心部分，僅讓周邊部分透過環形透光孔， 環形孔徑相當于孔徑濾波器，讓高頻細節成分通過光學系統，而將低頻彌散成分有效地抑 制，從而實現高分辨率的顯微成像；這一環形光束被聚光鏡聚焦，產生高傾斜的空心圓錐狀 光束，照亮并透過樣品后，又以倒立的空心圓錐光束方式進入一遮光圓片，只讓大數值孔徑 那部分光線通過顯微物鏡參與成像，而將中心部分遮擋，從而包含樣品特征信息的透射和 散射光線進入物鏡，在暗背景中得到亮的高對比度樣品像的基礎上，進一步實現高分辨顯 微成像。
2.一種超高分辨率的光學顯微成像裝置，其特征在于包括環形孔徑照明及顯微成像裝 置(I)XCD圖像傳感器(12)、圖像采集卡(I3)、計算機(14)、電源(15)、粗調焦旋鈕(16)、 細調焦旋鈕(17)、光源亮度調節旋鈕(18)和支架(19)；支架(19)上設有環形孔徑照明及 顯微成像裝置(1)、粗調焦旋鈕(16)、細調焦旋鈕(17)和光源亮度調節旋鈕(18)；環形孔 徑照明及顯微成像裝置(1)、CXD圖像傳感器(12)、圖像采集卡(13)、計算機(14)和電源 (15)順次相連；環形孔徑照明及顯微成像裝置(1)包括LED強光源( 、窄帶濾光片(3)、擋 光板(4)、環形透光孔(5)、聚光鏡(6)、樣品臺(7)、遮光圓片(8)、顯微物鏡(9)、目鏡(10) 和轉接透鏡(11)；在同一光軸上依次設有LED強光源O)、窄帶濾光片(3)、擋光板、環 形透光孔(5)、聚光鏡(6)、樣品臺(7)、遮光圓片(8)、顯微物鏡(9)、目鏡(10)、轉接透鏡 (11)。
全文摘要
本發明公開了一種超高分辨率的光學顯微成像方法及裝置。采用窄帶濾光、環形孔徑及暗視場照明相結合的特種照明及顯微成像方法，同時設計了不同數值孔徑、透過率和濾色特性的環形透光孔徑，實現對微納米尺寸物質的超高分辨率和高對比度的顯微成像。它具有LED照明光源、擋光板、環形透光孔、聚光鏡、樣品臺、遮光圓片及顯微物鏡組成的高分辨率光學顯微系統和CCD圖像傳感器、圖像采集卡及計算機組成的顯微圖像采集、處理系統。本發明的優點是既保持常規光學顯微鏡的實時、直接、無掃描的成像觀測方式，同時具有出色的分辨率和圖像對比度。
文檔編號G01N21/59GK102033308SQ20101051654
公開日2011年4月27日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年10月22日
發明者張冬仙, 支紹韜, 章海軍 申請人:浙江大學