專利名稱：一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法。
背景技術：
諾如病毒(Noroviruses, NoV)又稱諾瓦克樣病毒(Norwalk-likevirus, NLV s)，屬于杯狀病毒科，是引起病毒性胃腸炎暴發的重要病原之一。為單股正鏈小RNA病 毒，無包膜，具有20面體結構，直徑27-40nm。基因組長約為7. 5kb，由3個開放讀碼框架 (openreading frame,0RF)組成。諾如病毒感染性腹瀉具有發病急、傳播速度快、涉及范圍 廣等特點，對公共衛生有著重要影響。近年來歐美、澳大利亞、中國等國家相繼發生NoV感 染性腹瀉暴發疫情。生吃貝類或加熱未熟透的水產品食物，是導致諾如病毒胃腸炎暴發流 行的最常見原因之一 (Costantini V et al. Human and animal entericcaliciviruses in oysters from different coastal regions of theUnited States. Appl Environ Microbiol, 2006, 72 (3) :1800_1809.)。其中，水產品中牡蠣是NoV傳播的重要載體，是引起 胃腸炎暴發的最常見的食源。如美國20世紀90年代，因消費牡蠣而引起的胃腸炎中，至少 52%的病原為NoV。柳淑芳，等.牡蠣中諾如病毒的分子流行病學研究進展。海洋科學， 2008，32 (8) 82-86.研究表明，根據諾如病毒聚合酶和衣殼蛋白編碼區核苷酸和氨基酸序列特征，可 細分為5個遺傳組(I-V)，其中GG II是全球多數國家急性腸胃炎最主要的病原之一，我國 諾如病毒的感染基本上是遺傳組II型，遺傳組I型少見李靈輝，等.廣東省2005年諾瓦克 樣病毒感染暴發疫情.華南預防醫學，2006，32 (5) 11-14.。我國已報道多個地區(如北 京、長沙、廣東省、蘭州、濟南、江門、東莞市、廣西、佛山市南海區等)采用流行病學現場調 查和統計分析方法進行調查了解諾如病毒引起的感染性腹瀉暴發疫情的流行病學特點及 傳播途徑郭麗，等.諾如病毒分子生物學研究進展.傳染病信息，2009，22 (3) 174-178.]諾如病毒感染具有起病急、傳播快、消失早的特性，一旦出現暴發疫情，需要在短 時間內準確分析大量的樣品。國內則缺乏對此的系統監測和研究，一旦發生食物等來源 的感染暴發，缺少有效的現場檢測技術和方法徐友富，等.諾如病毒感染國內外研究概 況.中國衛生檢驗雜志，2008，18 (5) =949-951.。因此，迫切需要發展有效的諾如病毒的快 速檢測方法，并制定相關檢測標準。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，本發 明利用實時熒光PCR技術檢測水產品中諾如病毒的方法具有靈敏度高、檢測時間短和可定 量分析的特點，可用于水產品中諾如病毒的定性篩查和定量分析。為了達成上述目的，本發明的解決方案是一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，包括如下步驟1)設計合成用于檢測水產品諾如病毒的2組引物及探針；
2)水產品中諾如病毒的富集與回收；3)水產品中諾如病毒RNA的提取；4)實時熒光PCR檢測；所述的2組引物為諾如病毒I型和諾如病毒II型，其中諾如病毒I型的上游引物為 5’ -CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3‘；諾如病毒 I 型的下游引物為5’ -CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’ ； 諾如病毒II型的上游引物為5’ -ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3‘諾如病毒II型的下游引物為 5’ -ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’ ；且諾如病毒 I 型的探針為5’ -FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’ ；諾如病毒 II 型的探針為5’ -FAM-AGGGCGATCGCAATCT-TAMRA 3’。所述的諾如病毒的富集步驟為取5-6份水產品樣品，洗凈外表，解剖取下內臟組 織和腮5g，用剪刀仔細切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液 裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10, 000 X g條件下冷凍離心30min。取上清，
棄沉淀。所述的甘氨酸緩沖液為0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl，pH9. 5。所述的諾如病毒的回收步驟為移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000 溶液，顛倒5次混勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，OOOXg離心5min，棄去上清，保留沉淀， 加入2mL的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，000 X g離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。所述的水產品中諾如病毒RNA的提取試劑采用德國QIAGEN公司生產的QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒。所述的實時熒光PCR檢測中擴增反應條件為45°C逆轉錄20-40min，94°C預變性 5-15min ；93-95°C X 15_35sec，50_60°C X30_60sec，循環 35-45 次；檢測設立陽性對照、陰 性對照和空白對照；熒光通道檢測選擇FAM通道；反應結束后，利用熒光PCR儀器的分析軟 件，依據擴增動力學曲線和Ct值進行分析測定。本發明的有益效果為本發明利用實時熒光PCR技術檢測水產品中諾如病毒的方 法具有靈敏度高、檢測時間短和可定量分析的特點，可用于水產品中諾如病毒的定性篩查 和定量分析，及用于開發諾如病毒的實時熒光PCR檢測試劑盒。
圖1為本發明實施例中利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴增牡蠣RNA的動力學 曲線；圖2為本發明實施例中利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴增10倍梯度稀釋牡蠣 RNA的標準曲線；圖3為本發明實施例中花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的動力學曲線；圖4為本發明實施例中花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的熔解曲線；圖5為本發明實施例中對蝦樣品TaqMan探針法實時熒光PCR檢測的動力學曲線。
具體實施例方式實施例1本實施例水產品為牡蠣樣品，步驟為
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1、設計合成用于檢測水產品諾如病毒的2組引物及探針所述的引物為諾如病毒I型和II型，其中諾如病毒I型的上游引物為 5’ -CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3‘；諾如病毒 I 型的下游引物為5’ -CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’ ； 諾如病毒II型的上游引物為5’ -ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3‘諾如病毒II型的下游引物為 5’ -ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’ ；且諾如病毒 I 型的探針為5’ -FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’ ；諾如病毒 II 型的探針為5’ -FAM-AGGGCGATCGCAATCT-T AMRA 3’。2、牡蠣樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份水產品樣品，洗凈外表，解剖取下內臟組織(和腮)約5g，用 剪刀仔細切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液(0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5)，高速 勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，000 X g 條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混 勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽 水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，OOOXg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。 3、牡蠣樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產的QlAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取560 μ L緩沖液AVL-Carrier RNA (該試劑為德國QIAGEN公司生產的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 中的產品)至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心 Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復一次；5)移入500 μ L緩沖液AWl (該試劑為德國QIAGEN公司生產的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的產品)，6000g，離心lmin，更換新收集管；6)移入500 μ L緩沖液AW2，(該試劑為德國QIAGEN公司生產的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的產品)，20000g離心3min，更換新收集管；7) 20000g離心lmin，更換新收集管；8)移入40 μ L無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或-80°C保存。4、牡蠣樣品實時熒光PCR檢測按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴增反應體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、諾如病毒I型的上、下游引物、諾如病毒 II型的上、下游引物、OligodT、RNA模板、無RNA酶超純水、諾如病毒I、II型的探針。使用 ABI7500型熒光定量PCR儀進行檢測。擴增反應條件為45°C逆轉錄20-40min，94°C預變性 5-15min ;93-95°C X 15_35sec，50_60°C X30_60sec，循環 35-45 次。檢測設立陽性對照、陰 性對照和空白對照；熒光通道檢測選擇檢測選擇FAM通道。反應結束后，利用熒光PCR儀 器的分析軟件，依據擴增動力學曲線和Ct值進行分析。如圖1和圖2所示，圖1中，TaqMan 探針法熒光定量PCR擴增牡蠣樣品諾如病毒RNA的動力學曲線，2、4、5為牡蠣樣品，1為諾 如病毒II型陽性對照、3為諾如病毒I型陽性對照，6為陰性對照。圖2為利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴增10倍梯度稀釋牡蠣RNA的標準曲線。實施例2本實施例水產品為花蛤樣品，步驟為1、設計合成用于檢測水產品諾如病毒的1組II型引物及探針TO的弓丨物為諾如病毒II型，其中諾如病毒II型的上游弓丨物為:5，^iGrmKMmnoc-3， 諾如病毒π型的下游引物為:5’ -^χ κμ κ ιμ -3'；諾如病毒π型的探針為 5，H^fflmiOIMicr-Tm 3，。2、花蛤樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份水產品樣品，洗凈外表，解剖取下內臟組織(和腮)約5g，用 剪刀仔細切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液(0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5)，高速 勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，OOOXg 條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混 勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽 水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，OOOXg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。3、花蛤樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產的QIAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取 560 μ L 緩沖液 AVL-Carrier RNA 至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心
Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復一次；保存。
5)移入50(^1^緩沖液11，600(^，離心lmin，更換新收集管；
6)移入500μ L緩沖液Aff2, 20000g離心3min,更換新收集管；
7)20000g離心lmin，更換新收集管；
8)移入40μL無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或_80°C 4、采用兩步法，即逆轉錄和實時熒光PCR檢測。逆轉錄反應體系MgCl2, 25mM4μ L
反轉錄IOX緩沖液2μ L
dNTP混合物，IOmM2μ L
反轉錄酶0. 65 μ L
隨機引物1 μ L
RNA2. 5μ L
無核酸酶水7. 85 μ L
總體系20 μ 1以上物質為美國Promega公司生產的Reverse TranscriptionSystem逆轉錄試 劑。將反應體系于室溫孵育10-15分鐘，然后于42_45°C溫育10_15分鐘；將樣品于90-95°C加熱5分鐘，然后于4°C放置5分鐘，-20°C或-80°C保存。實時熒光定量PCR體系Taq Master Mix (德國 QIAGEN 公司)12. 5 μ L上游引物(5ymol/mL)2μ L下游引物(5ymol/mL)2μ LSYBR Green Ι(5-10Χ)(美國 Inv itrogen 公司)2yL模板(cDNA)2 μ L無核酸酶水4. 5 μ L總體系25 μ L按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴增反應體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、DNA聚合酶、諾如病毒II型的上游引物、諾如病毒II型的下游引物、模板、SYBR Green I、無RNA酶超純水。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀進行檢測。擴增反應條件為 94°C預變性 5-15min ；93-95°C X 15_35sec，50_60°C X 30_60sec，循環 35-45 次。融解曲線 950C 15-30sec,50-60°C X 30_60sec，95°C 15_30sec，升溫速度為 0. 1°C /sec。檢測設立陽 性對照、陰性對照和空白對照；收集SYBR熒光信號。反應結束后，利用熒光PCR儀器的分 析軟件，依據擴增動力學曲線和Ct值進行分析。如圖3和圖4所示，圖3為花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的動力學曲線，圖4為花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的 熔解曲線。結果顯示擴增動力學曲線呈典型的S型，擴增產物的熔解曲線圖譜顯示其Tm值 為84°C，且只有一個特異峰，表明無引物二聚體和非特異性擴增。實施例3 本實施例水產品為蝦樣品，步驟為1、設計合成用于檢測水產品諾如病毒的1組I型引物及探針臓的弓丨物為諾如病毒I型，其中諾如病毒I型的上游弓丨物為:5，"0GYTGGATGaMY0CATGA-3，； 諾如病毒I型的下游引物為:5’ "CMTTACTACTA00GQ\GATT0C-3’ ；且諾如病毒I型的探針為: 5，H^IGTGGAQVGGAGATOGC-TAMRA 3，。2、蝦樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份蝦樣品，洗凈外表，解剖取下內臟組織約5g，用剪刀仔細切 碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下 水浴振蕩30min，4°C，10，OOOXg條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收上清加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混勻；冰上放置至少Ih 后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病 毒，5，000 Xg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。3、蝦樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產的QIAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取 560 μ L 緩沖液 AVL-Carrier RNA 至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心 Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復一次；
5)移入50(^1^緩沖液々11，600(^，離心lmin，更換新收集管；6)移入500 μ L緩沖液AW2，20000g離心3min，更換新收集管；7) 20000g離心lmin，更換新收集管；8)移入40 μ L無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或-80°C保存。4、蝦樣品實時熒光PCR檢測按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴增反應體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、諾如病毒I型的上游引物、諾如病毒I型 的下游引物、Oligo dT、RNA模板、無RNA酶超純水、諾如病毒I型的探針。使用ABI7500型 熒光定量PCR儀進行檢測。擴增反應條件為45°C逆轉錄20-40min，94°C預變性5-15min ； 93-950C X15-35sec，50-60°C X 30_60sec，循環35-45次。檢測設立陽性對照、陰性對照和 空白對照；熒光通道檢測選擇檢測選擇FAM通道。反應結束后，利用熒光PCR儀器的分析 軟件，依據擴增動力學曲線和Ct值進行分析。如圖5所示，陽性樣品呈典型的S型，陰性對 照 Ct = Undet。
權利要求
一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于包括如下步驟1)設計合成用于檢測水產品諾如病毒的2組引物及探針；2)水產品中諾如病毒的富集與回收；3)水產品中諾如病毒RNA的提取；4)實時熒光PCR檢測；所述的2組引物為諾如病毒I型和諾如病毒II型，其中諾如病毒I型的上游引物為5’ CGYTGGATGCGNTYCCATGA 3’；諾如病毒I型的下游引物為5’ CATTTACTACTACCGCAGATTCC 3’；諾如病毒II型的上游引物為5’ ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC 3’諾如病毒II型的下游引物為5’ ACACTTACTTCTACCGCAGCT 3’；且諾如病毒I型的探針為5’ FAM TGTGGACAGGAGATCGC TAMRA 3’；諾如病毒II型的探針為5’ FAM AGGGCGATCGCAATCT TAMRA 3’。
2.如權利要求1所述的一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在 于所述的諾如病毒的富集步驟為取5-6份水產品樣品，洗凈外表，解剖取下內臟組織和腮 5g，用剪刀仔細切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入 50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，000 Xg條件下冷凍離心30min。取上清，棄沉 淀。
3.如權利要求1所述的一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的甘氨酸緩沖液為0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5。
4.如權利要求1所述的一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的諾如病毒的回收步驟為移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛 倒5次混勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL 的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，000 X g離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。
5.如權利要求1所述的一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的水產品中諾如病毒RNA的提取試劑采用QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取 試齊U盒。
6.如權利要求1所述的一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的實時熒光PCR檢測中擴增反應條件為45°C逆轉錄20-40min，94°C預變性5-15min ； 93-950C X15-35sec，50-60°C X30_60sec，循環35-45次；檢測設立陽性對照、陰性對照和 空白對照；熒光通道檢測選擇FAM通道；反應結束后，利用熒光PCR儀器的分析軟件，依據 擴增動力學曲線和Ct值進行分析測定。
全文摘要
本發明公開一種檢測水產品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，包括如下步驟1)設計合成用于檢測水產品諾如病毒的2組引物及探針；2)水產品中諾如病毒的富集與回收；3)水產品中諾如病毒RNA的提取；4)實時熒光PCR檢測。本發明利用實時熒光PCR技術檢測水產品中諾如病毒的方法具有靈敏度高、檢測時間短和可定量分析的特點，可用于水產品中諾如病毒的定性篩查和定量分析，及用于開發諾如病毒的實時熒光PCR檢測試劑盒。
文檔編號G01N21/64GK101948936SQ20101050106
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者周常義, 李莉, 蘇國成, 蘇文金, 鄭惠能, 黃建煒, 黃自成 申請人:集美大學