病毒解裂劑及解裂病毒抗原抗體復合物并檢測hcv抗原的方法

專利名稱：病毒解裂劑及解裂病毒抗原抗體復合物并檢測hcv抗原的方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒解裂劑，以及用該裂解劑裂解病毒抗原抗體復合物的方法， 以快速、準確檢測丙型肝炎病毒HCV抗原，屬于生物技術領域。
背景技術：
丙型肝炎病毒HCV為嗜肝性慢性病毒。丙型肝炎病毒HCV感染者除部分(大約 10% -20% )可以自愈外，絕大多數都將轉為慢性感染，自然病程長達20-30年，其中約有 20 %的慢性感染者會發展為肝硬化，又有20 %的感染者會發展為肝細胞癌，慢性化發生率 明顯高于乙型肝炎，死亡率較高。因此，丙型肝炎病毒HCV的檢測對丙型肝炎病毒感染的早 期診斷和指導臨床治療具有重大的意義。現有的檢測技術包含HCV抗體檢測、HCV核酸檢 測、HCV核心抗原檢測三種方法HCV抗體檢測由于HCV抗體試劑盒增加了 HCV基因組Nss區表達的蛋白作為抗 原，進一步提高了試劑的敏感性，所以抗HCV抗體檢測已廣泛應用于丙型肝炎病毒HCV感染 的診斷及大規模血液篩查。但由于丙型肝炎病毒HCV感染窗口期較長，平均70天，有的患 者窗口期可延長至6-9月或更長，故存在“窗口期”漏檢的問題。還有約1-3%的患者因抗 HCV抗體的持續陰性以及某些耐受人群未發生血清轉化等等，使抗HCV抗體檢測不能準確 反映患者體內HCV的感染狀態。再有，由于各廠家試劑間的靈敏度和特異性存在著一定差 異，從而導致抗HCV抗體檢測結果不一致，易產生假陽性或漏檢等情況。目前公認的HCV感染診斷的金標準是HCV核酸HCV-RNA的檢測。HCV基因組的復 制出現得很早，在感染后數天即可出現病毒血癥。外周血中檢測出HCV-RNA是病毒復制的 直接標志，提示血液中有HCV存在。HCV-RNA的檢測可以縮短感染后抗體陽轉前的檢測窗 口期，以實現HCV感染的早期診斷。由于HCV-RNA檢測靈敏度高、特異性強，具有早期診斷 的意義。但是PCR法檢測HCV-RNA的影響因素較多，在樣本收集、儲存和檢測方面都有嚴 格的要求=HCV-RNA易被血細胞中的RNA酶降解，因此如果被檢標本保存不當(例如反復凍 融)將出現假陰性而影響檢測結果；HCV-RNA還會受進食的影響，即所進食物會與血中脂質 及脂蛋白結合而降低檢出率；另外，RT-PCR操作復雜，所需設備昂貴，需要專門認證的實驗 室和操作人員才能完成，因此RT-PCR方法難以在基層實驗室普遍應用。HCV核心抗原包括多種蛋白(核心蛋白C、膜蛋白、非結構蛋白NS2、NS3、NS4及 NS5)，核心蛋白及NS3在肝細胞胞漿中表達，可游離存在于血清中，其保守性相對較高，目 前已用于血清學診斷。與抗HCV抗體檢測相比，HCV核心抗原檢測可使窗口期縮短49天，減 少HCV感染者在窗口區獻血的風險。對于某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者，和某些 不產生抗體的攜帶者，HCV核心抗原的檢測還有利于HCV感染患者的早期發現。與RT-PCR 方法相比，HCV核心抗原檢測具有操作簡便、時間短、對環境要求低的特點，在臨床上可用于 早期丙型肝炎診斷、抗HCV抗體陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒 血癥追蹤分析。在實際應用中，由于血清中游離的核心抗原非常微量，且核心抗原被包膜蛋白包裹，同時血清中可能含有一種或多種不同的抗原，有的抗原也因含量太低而不易測出， 因而影響了抗原的檢測，是導致現有的抗原檢測法檢出率低，陽性率較低的重要原因。

發明內容
為將病毒抗原抗體復合物解裂成游離組分，或將包膜病毒核心抗原得以充分暴 露，以便能快速、準確檢測病毒抗原，本發明提供一種病毒裂解劑。本發明的第二個目的在于用所述病毒裂解劑裂解血樣中病毒抗原抗體復合物的 方法。本發明的第三個目的在于提供一種用上述病毒裂解劑裂解丙型肝炎病毒HCV抗 原抗體復合物，并高效、快速檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法。
本發明提供的是這樣一種病毒裂解劑，其特征在于每IOOml裂解劑中含有
去垢劑 蛋白變性劑 還原劑 脂溶劑 基礎液
0. 1 Iml 0 20g 0. 01 Iml 0. 1 Iml
余里ο
所述基礎液采用酸性緩沖液，優選PH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的常規甘氨酸鹽酸

緩沖液。所述去垢劑為常規陰離子去垢劑SDS，或常規兩性離子去垢劑CHAPS，或常規中性 去垢劑中的Tritonn-XlOO或NP40，優選CHAPS或NP40。所述蛋白變性劑為常規的尿素、鹽酸胍中的一種，優選尿素。所述還原劑優選常規的二巰基乙醇。所述脂溶劑采用常規的乙醚、氯仿、丙酮、氟碳化合物、正丁醇中的一種，優選氯 仿、丙酮。本發明提供的用上述病毒裂解劑裂解病毒抗原抗體復合物的方法是將病毒裂解 劑與血樣，按1 1的體積比混合后，于37°c溫度下反應20-40min，將血樣中的病毒抗原抗 體復合物裂解成游離組分，其中，所述病毒裂解劑是每IOOml裂解劑中含有去垢劑0. 1 Iml蛋白變性劑0 20g還原劑0. 01 Iml脂溶劑0. 1 ImlpH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的基礎液 余量。本發明的第三個目的通過下列技術方案完成一種用病毒裂解劑裂解丙型肝炎病 毒HCV抗原抗體復合物并高效、快速檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于經過下 列步驟A、在空白微孔板中加入病毒裂解劑150ul/孔，再等體積加入待檢樣品150ul/孔， 充分混勻，用封片封板后，于37°C溫度下反應20 40min，將待檢血樣中的丙型肝炎病毒 HCV抗原抗體復合物裂解成游離組分，其中，所述病毒裂解劑是每IOOml裂解劑中含有去垢劑0. 1 Iml
蛋白變性劑還原劑脂溶劑
0 20g 0. 01 Iml 0. 1 ImlpH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的基礎液 余量；B、在HCV抗原檢測板的孔中，先加入樣品緩沖液100 μ 1/孔，再分別加入經A步驟 裂解的待檢樣品100μ 1/孔，抗原陽性、陰性對照各2孔，設空白調零孔1孔，之后放入濕盒 中，37°C保溫1-2小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；C、在B步驟的檢測板的孔中先加入生物素標記的HCV抗體使用液200 μ 1/孔，放 入濕盒中，37°C保溫0. 5-1小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；再在檢測板的孔中加入常 規辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素使用液200 μ 1/孔，放入濕盒中，37°C保溫0. 5-1小時， 用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；或者Cl、在B步驟的檢測板的孔中加入辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液200 μ 1/ 孔，放入濕盒中，37°C保溫0. 5-1小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；D、在C或Cl的檢測板的孔中加入TMB顯色液A、B液各100 μ 1/孔，混勻，放入濕 盒中，37°C保溫10分鐘，之后加入終止液，50 μ 1/孔；Ε、用波長為450nm的酶標儀對空白孔調零后，測吸光度㈧值；F、結果判定陽性對照平均A值-陰性對照平均A值彡0. 4時，表明檢測成立，反之重試；Cutoff 值=陰性對照的平均A值X2. 1，其中，陰性對照的平均A值大于0. 05，按實際值算；陰性對 照的平均A值小于0. 05按0. 05算；樣品A值彡Cutoff值，該樣品判定為HCV抗原陽性樣 品，樣品A值< Cutoff值，為陰性，該樣品判定為HCV抗原陰性樣品。所述B步驟的HCV抗原檢測板經過下列方法制得將純化的抗HCV多克隆抗體按 常規稀釋至20 μ g/ml，按200 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4°C過夜，洗板；再在 聚苯乙烯板的孔中，按200 μ 1/孔的量加入常規牛血清白蛋白封閉檢測板，4°C過夜，洗板， 晾干，4°C保存，即得HCV抗原檢測板；其中，所述純化的抗HCV多克隆抗體經過下列方法制 得A、抗HCV血清的制備Al、取濃度為512-1024Eu/ml的四個高度保守區基因表達的重組HCV抗原NS3、NS4、 NS5、C的等量混合液10ml，對猴、兔或其它適宜動物進行免疫注射；A2、分別在2、3、4周采血，用常規丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒進行HCV抗體效價 檢測，效價未達1 4000時，須進行加強免疫注射；A3、當抗HCV血清效價大于1 8000時，通過頸動脈采血，按常規方法制備血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗體的純化Bi、取蛋白A或蛋白A/G親和層析柱，室溫平衡30分鐘，用5個柱體積的常規平衡 液進行平衡；B2、將上述A3所得抗HCV血清與常規平衡液進行等體積混合后上樣至Bl的蛋白 A或蛋白A/G親和層析柱上，用10個柱體積的常規平衡液洗脫雜蛋白；再用10個柱體積的磷酸鹽緩沖液PBS將目的蛋白從親和層析柱上洗脫下來，收集洗脫峰，用磷酸鹽緩沖液PBS 透析過夜，收集透析液，即得純化的抗HCV多克隆抗體。所述C步驟的生物素標記的HCV抗體使用液經過下列方法獲得將常規長臂生物 素用注射用水按常規溶解后，與常規HCV單克隆抗體或多克隆抗體按1 10克分子比的比 例混合；室溫下放置30分鐘，或4°C冰箱放置2小時后，用磷酸鹽緩沖液PBS按常規透析過 夜，加等量甘油，-20°C以下保存備用，得生物素標記的HCV抗體；用磷酸鹽緩沖液PBS+2% 體積比的牛血清白蛋白酶結液稀釋生物素標記的HCV抗體至1 500 1 5000的體積 濃度，得生物素標記的HCV抗體使用液。所述Cl步驟的辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液經過下列方法獲得按照常 規方法將常規單克隆HCV抗體或多克隆HCV抗體與常規辣根過氧化物酶標記結合成辣根過 氧化物酶標記的HCV抗體原液；用磷酸鹽緩沖液PBS+2%體積比的牛血清白蛋白酶結液稀 釋辣根過氧化物酶標記的HCV抗體原液至1 1000 1 20000的體積濃度，得辣根過氧 化物酶標記的HCV抗體使用液。本發明與現有技術相比具有下列優點和效果用本發明提供的裂解劑對待檢血樣 或抗血清與病毒抗原經中和反應后得到的抗原抗體復合物進行裂解處理，可以將病毒抗原 抗體復合物解裂成游離組分，或將病毒核心抗原得以充分暴露，并保留其抗原反應性，不僅 使靈敏度較現有的HCV核心抗原檢測法明顯提高，而且由于抗原檢測窗口期比抗HCV抗體 窗口期平均縮短49天，在HCV-RNA出現后的1 2d內出現，可有效縮短血清轉換前的窗口 期，對于提高窗口期感染者的檢出率、提高輸血和血制品的安全性具有重要意義。本發明具 有操作簡便、快速，不需要特殊的儀器、費用低廉、適應性強、易于推廣使用的特點。本發明提供的病毒裂解劑適用于包括丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV) 在內的常見病毒抗原抗體復合物的解裂。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述。實施例1每IOOml裂解劑中含有:NP40 0. Iml, 二巰基乙醇0. Olml,氯仿0. lml, pH為 2. 8、濃度為0. 1M/L的甘氨酸鹽酸緩沖液99. 79ml。實施例2每IOOml裂解劑中含有CHAPS 0. 5ml，尿素20g，二巰基乙醇0. 5ml,氯仿 0. 5ml, pH為2. 8、濃度為0. 1M/L的甘氨酸鹽酸緩沖液88. 5ml。實施例3每IOOml裂解劑中含有:NP40 :1ml，尿素:10g，二巰基乙醇:1ml，丙酮:1ml，pH為 2. 8、濃度為0. 5M/L的甘氨酸鹽酸緩沖液92ml。實施例4 HCV抗原檢測板的獲得A、抗HCV血清的制備Al、取濃度為512Eu/ml的四個高度保守區基因表達的重組HCV抗原NS3、NS4、NS5、 C的等量混合液2ml，對猴、兔或其它適宜動物進行免疫注射；
A2、分別在2、3、4周采血，用常規丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒進行HCV抗體效價 檢測，效價未達1 4000時，須進行加強免疫注射；A3、當抗HCV血清效價大于1 8000時，通過頸動脈采血，按常規方法制備血清， 得到抗HCV血清，-600C以下保存待用；B、抗HCV抗體的純化Bi、取蛋白A或蛋白A/G親和層析柱，室溫平衡30分鐘，用5個柱體積的常規平衡 液進行平衡；B2、將上述A3所得抗HCV血清與常規平衡液進行等體積混合后上樣至Bl的蛋白 A或蛋白A/G親和層析柱上，用10個柱體積的常規平衡液洗脫雜蛋白；再用10個柱體積的 磷酸鹽緩沖液PBS將目的蛋白從親和層析柱上洗脫下來，收集洗脫峰，用磷酸鹽緩沖液PBS 透析過夜，收集透析液，即得純化的抗HCV多克隆抗體；B3、將B2所得純化的抗HCV多克隆抗體用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度檢測，同 時用HCV分片段抗體試劑盒進行特異性檢測，結果表明該純化的抗HCV多克隆抗體能與 HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特異性結合；B4、用Iowrry法測定純化的抗HCV多克隆抗體蛋白含量為6. 15mg/ml，能夠滿足酶 聯免疫(ELISA)檢測試劑盒包被及酶標記的需要，將純化的抗HCV多克隆抗體于-20°C以下 保存備用；B5、經純化的IgG，效價為1 8 000-1 16 000，與純化前基本一致，表明所選擇 的純化方法對抗體活性損傷較小；B6、條件試驗篩選使用濃度在5-50 μ g/ml間；C、HCV抗原檢測板包被Cl、將B2所得純化的抗HCV多克隆抗體用常規碳酸鹽緩沖液稀釋至20 μ g/ml，按 200 μ 1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4°C過夜，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；C2、在Cl的聚苯乙烯板的孔中，按150μ 1/孔的量加入常規牛血清白蛋白，以對檢 測板進行封閉，4°C過夜，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次，晾干，4°C保存備用，即得HCV抗原 檢測板。實施例5生物素標記的HCV抗體使用液的的制備將常規長臂生物素用注射用水按常規溶 解后，與常規HCV單克隆抗體按1 10克分子比的比例混合；室溫下放置30分鐘，或4°C冰 箱放置2小時后，用磷酸鹽緩沖液PBS按常規透析過夜，加等量甘油，-200C以下保存備用， 得生物素標記HCV抗體；用磷酸鹽緩沖液PBS+2%體積比的牛血清白蛋白所構成的酶結合 物稀釋液，稀釋生物素標記的HCV抗體至1 500 1 2000的體積濃度，得生物素標記 的HCV抗體使用液，4°C保存備用。實施例6辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液的的制備所述辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液經過下列方法獲得按照常規的方法 將多克隆HCV抗體與辣根過氧化物酶標記結合成辣根過氧化物酶標記的HCV抗體原液；用 磷酸鹽緩沖液PBS+2 %體積比的牛血清白蛋白所構成的酶結合物稀釋液，稀釋辣根過氧化 物酶標記HCV抗體原液至1 5000的體積濃度，得辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液，
94°C保存備用。實施例7用實施例1提供的裂解劑對丙型肝炎病毒重組HCV抗原抗體復合物進行裂解，并 高效、快速檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，經過下列步驟本實施例7所用的待檢樣品為A、將純化的重組HCV抗原0. 5ml與抗HCV血清0. 5ml等體積混勻，37°C，60分鐘中 和反應，得HCV抗原抗體復合物待檢樣品。B、30份健康人血清，30份HCV-RNA陽性血清。1.將待檢樣品A、B與實施例4的HCV抗原檢測板及實施例5、實施例6及其它配 套試劑從冰箱取出，室溫平衡30分鐘；2、在空白微孔板中加入實施例1的病毒裂解劑150ul/孔，再分別等體積加入待檢 樣品A、B, 150ul/孔，充分混勻，用封片封板后，于37°C溫度下反應30min，從而將待檢樣品 中的丙型肝炎病毒HCV抗原抗體復合物裂解成游離組分；3、先在實施例4的HCV抗原檢測板的孔中，加入樣品緩沖液100 μ 1/孔，在其中的 27個孔中加入經2步驟裂解的待檢樣品100 μ 1/孔、2個孔中加入抗原陽性對照、2個孔中 加入陰性對照，1個孔作為空白調零孔，另外的27個孔中加入待檢樣品Α(100 μ 1/孔)作 為未裂解樣品A對照，余下的27個孔中加入待檢樣品B (100 μ 1/孔)作為未裂解樣品B對 照，之后放入濕盒中，37°C保溫1. 5小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；4.在上述3步驟的HCV抗原檢測板的各個孔中，加入實施例5的生物素標記的HCV 抗體使用液，200 μ 1/孔，放入濕盒中，37°C保溫0. 5小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；5.在上述4步驟的HCV抗原檢測板的各個孔中加入市購的常規辣根過氧化物酶標 記鏈霉親和素使用液200 μ 1/孔，放入濕盒中，37°C保溫0. 5小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗 板5次；6.在上述5步驟的HCV抗原檢測板的各個孔中加入TMB顯色液A液、B液各 100 μ 1/孔，混勻，放入濕盒中，37°C保溫10分鐘；7.在上述6步驟的HCV抗原檢測板的各個孔中加入終止液，50 μ 1/孔；8.用波長為450nm的酶標儀對空白孔調零后，測吸光度㈧值，結果見表1、表2、
表3o9、結果判定陽性對照平均A值(1. 927)-陰性對照平均A值(0. 053)彡0. 4，本次試驗成立。 Cutoff值=陰性對照的平均A值(0. 053) X 2. 1 = 0. 111，(陰性對照的平均A值大于0. 05， 按實際值算，陰性對照的平均A值小于0. 05按0. 05算)。樣品A值> Cutoff值，該樣品判 定為HCV陽性樣品，樣品々值< Cutoff值，為陰性，該樣品判定為HCV陰性樣品。表1重組HCV抗原抗體復合物裂解反應比較
10
權利要求
一種病毒裂解劑，其特征在于每100ml裂解劑中含有去垢劑0.1～1ml蛋白變性劑0～20g還原劑0.01～1ml脂溶劑0.1～1ml基礎液余量。
2.如權利要求1所述的病毒裂解劑，其特征在于所述基礎液采用酸性緩沖液，優選PH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的常規甘氨酸鹽酸緩沖液。
3.如權利要求1所述的病毒裂解劑，其特征在于所述去垢劑為常規陰離子去垢劑SDS， 或常規兩性離子去垢劑CHAPS，或常規中性去垢劑中的Tritorm-XlOO或NP40，優選CHAPS 或NP40 ；所述蛋白變性劑為常規的尿素、鹽酸胍中的一種，優選尿素；所述還原劑優選常規 的二巰基乙醇；所述脂溶劑采用常規的乙醚、氯仿、丙酮、氟碳化合物、正丁醇中的一種，優 選氯仿、丙酮。
4.一種用權利要求1所述病毒裂解劑裂解病毒抗原抗體復合物的方法，其特征是將 病毒裂解劑與血樣，按1 1的體積比混合后，于37°C溫度下反應20-40min，即將血樣中的 病毒抗原抗體復合物裂解成游離組分，其中，所述病毒裂解劑是每IOOml裂解劑中含有.0.1 Iml 0 20g 0. 01 Iml 0. 1 Iml余里ο^ HCV抗原抗體復合物并高效、快速檢測丙型肝孔，充分 毒HCV抗去垢劑 蛋白變性劑 還原劑 脂溶劑pH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的基礎液
5. 一種用病毒裂解劑裂解丙型肝炎病 炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于經過下列步驟A、在空白微孔板中加入病毒裂解劑150ul/孔，再等體積加入待檢樣品150ul/ 混勻，用封片封板后，于37°C溫度下反應20 40min，將待檢血樣中的丙型肝炎病 原抗體復合物裂解成游離組分，其中，所述病毒裂解劑是每IOOml裂解劑中含有去垢劑0. 1 Iml蛋白變性劑0 20g還原劑0. 01 Iml脂溶劑0. 1 ImlPH 2. 8、濃度0. 1 0. 5M/L的基礎液 余量；B、在HCV抗原檢測板的孔中，先加入樣品緩沖液100μ 1/孔，再分別加入經A步驟裂解 的待檢樣品100 μ 1/孔，抗原陽性、陰性對照各2孔，設空白調零孔1孔，之后放入濕盒中， 37°C保溫1-2小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；C、在B步驟的檢測板的孔中先加入生物素標記的HCV抗體使用液200μ 1/孔，放入濕 盒中，37°C保溫0. 5-1小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；再在檢測板的孔中加入常規辣 根過氧化物酶標記鏈霉親和素使用液200 μ 1/孔，放入濕盒中，37°C保溫0. 5-1小時，用磷 酸鹽緩沖液PBS洗板5次；或者Cl、在B步驟的檢測板的孔中加入辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液200 μ 1/孔， 放入濕盒中，37°C保溫0. 5-1小時，用磷酸鹽緩沖液PBS洗板5次；D、在C或Cl的檢測板的孔中加入TMB顯色液A、B液各100 μ 1/孔，混勻，放入濕盒中， 37°C保溫10分鐘，之后加入終止液，50 μ 1/孔;Ε、用波長為450nm的酶標儀對空白孔調零后，測吸光度(A)值；F、結果判定陽性對照平均A值-陰性對照平均A值彡0. 4時，表明檢測成立，反之重試；Cutoff值 =陰性對照的平均A值X2. 1，其中，陰性對照的平均A值大于0. 05，按實際值算；陰性對照 的平均A值小于0. 05按0. 05算；樣品A值彡Cutoff值，該樣品判定為HCV抗原陽性樣品， 樣品A值< Cutoff值，為陰性，該樣品判定為HCV抗原陰性樣品。
6.如權利要求5所述的檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述B步驟 的HCV抗原檢測板經過下列方法制得將純化的抗HCV多克隆抗體按常規稀釋至20 μ g/ ml，按200μ1/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4°C過夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中， 按200 μ 1/孔的量加入常規牛血清白蛋白封閉檢測板，4°C過夜，洗板，晾干，4°C保存，即得 HCV抗原檢測板；其中，所述純化的抗HCV多克隆抗體經過下列方法制得A、抗HCV血清的制備Al、取濃度為512-1024Eu/ml的四個高度保守區基因表達的重組HCV抗原NS3、NS4、NS5、 C的等量混合液10ml，對猴、兔或其它適宜動物進行免疫注射；A2、分別在2、3、4周采血，用常規丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒進行HCV抗體效價檢 測，效價未達1 4000時，須進行加強免疫注射；A3、當抗HCV血清效價大于1 8000時，通過頸動脈采血，按常規方法制備血清，得到 抗HCV血清，-60 0C以下保存待用；B、抗HCV抗體的純化Bi、取蛋白A或蛋白A/G親和層析柱，室溫平衡30分鐘，用5個柱體積的常規平衡液進 行平衡；B2、將上述A3所得抗HCV血清與常規平衡液進行等體積混合后上樣至Bl的蛋白A或 蛋白A/G親和層析柱上，用10個柱體積的常規平衡液洗脫雜蛋白；再用10個柱體積的磷酸 鹽緩沖液PBS將目的蛋白從親和層析柱上洗脫下來，收集洗脫峰，用磷酸鹽緩沖液PBS透析 過夜，收集透析液，即得純化的抗HCV多克隆抗體。
7.如權利要求5所述的檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述C步驟的 生物素標記的HCV抗體使用液經過下列方法獲得將常規長臂生物素用注射用水按常規溶 解后，與常規HCV單克隆抗體或多克隆抗體按1 10克分子比的比例混合；室溫下放置30 分鐘，或4°C冰箱放置2小時后，用磷酸鹽緩沖液PBS按常規透析過夜，加等量甘油，-20°C以 下保存備用，得生物素標記的HCV抗體；用磷酸鹽緩沖液PBS+2 %體積比的牛血清白蛋白酶 結液稀釋生物素標記的HCV抗體至1 500 1 5000的體積濃度，得生物素標記的HCV 抗體使用液。
8.如權利要求5所述的檢測丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述Cl步驟 的辣根過氧化物酶標記的HCV抗體使用液經過下列方法獲得按照常規方法將常規單克隆 HCV抗體或多克隆HCV抗體與常規辣根過氧化物酶標記結合成辣根過氧化物酶標記的HCV抗體原液；用磷酸鹽緩沖液PBS+2 %體積比的牛血清白蛋白酶結液稀釋辣根過氧化物酶標 記的HCV抗體原液至1 1000 1 20000的體積濃度，得辣根過氧化物酶標記的HCV抗 體使用液。
全文摘要
本發明提供一種病毒解裂劑及解裂病毒抗原抗體復合物并檢測HCV抗原的方法，其特征在于每100ml裂解劑中含有去垢劑0.1～1ml，蛋白變性劑0～20g，還原劑0.01～1ml，脂溶劑0.1～1ml，基礎液余量。以對待檢血樣或抗血清與病毒抗原經中和反應后得到的抗原抗體復合物進行裂解處理成游離組分，或將病毒核心抗原得以充分暴露，并保留其抗原反應性，不僅使靈敏度較現有的HCV核心抗原檢測法明顯提高，而且由于抗原檢測窗口期比抗HCV抗體窗口期平均縮短49天，在HCV-RNA出現后的1～2d內出現，可有效縮短血清轉換前的窗口期，對于提高窗口期感染者的檢出率、提高輸血和血制品的安全性具有重要意義。本發明提供的病毒裂解劑適用于包括丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)在內的常見病毒抗原抗體復合物的解裂。
文檔編號G01N33/569GK101975857SQ20101029546
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者崔萍芳, 李華, 楊蓉, 白惠珠, 董麗娟, 蔣蕊鞠, 謝忠平, 龍潤鄉 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所