專利名稱：Y-str基因座熒光標記復合擴增體系及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測人體基因組中具有多態性的遺傳標記，特別是涉及Y染色體STR 基因座熒光標記復合擴增體系及應用。
背景技術：
DNA多態性分析技術自1985年被應用于法庭科學生物物證的個體識別和親子鑒定中以來，極大地推動了法醫物證鑒定技術的發展，帶動刑事技術產生了劃時代的突破。十幾年來，新的DNA多態性分析方法不斷涌現，開發了許多新的多態性理想的遺傳標記，誕生了一系列的現代化DNA檢驗技術。尤其是1992年開始出現的STR基因座檢驗技術，因其多態性好、識別能力強、靈敏度高、易于自動化等特點，迅速成為法醫DNA鑒定中的主流技術， 得到了廣泛的應用，取得了令人矚目的成果。但傳統的STR基因座檢驗主要是以常染色體 STR基因座作為檢測目標，達到認定罪犯的目的。而目前DNA鑒定已不再僅僅被應用來直接認定犯罪嫌疑人，更依靠它為整個的偵查工作提供方向和指導。現實中很多案件在偵查過程中根據諸多線索可以判斷，罪犯就應該是生活在一定范圍的村民或常住人員，在案發現場也找到了有價值的生物物證，但由于沒有明確的排查線索，只得對本地區大批量的可疑人員應用DNA技術進行排查，經常有案件送檢當地嫌疑人動則幾百人，排查工作量大、費用高，更主要的是要花費很長的時間，真正的犯罪嫌疑人可能在這樣的威懾下很快逃跑，不能充分發揮利用現代化技術手段指導偵查工作的時效性，喪失破獲案件、抓捕罪犯的最好時機。隨著分子生物學、遺傳學的發展，尤其是伴隨著人類基因組計劃的完成，國內外法庭科學工作者在人類Y染色體上發現同樣具有很多多態性理想的STR基因座，由于Y染色體為男性特有，而且Y染色體上的異染色質區在減數分裂過程中不發生重組，而以單倍型在父系親屬中垂直傳遞，因而在許多案件中應用具有獨特使用價值，成為法醫DNA領域新的研究和應用熱點。現有技術存在的問題1、目前國內針對Y-STR研究報道主要集中于新基因座的開發、群體遺傳學調查及部分方法研究，但主要是采用單基因座檢驗、銀染色的檢測方法，還沒有一種熒光標記的多基因座復合檢驗的成品試劑盒。2、國外相關研究起步較早，研究相對深入，目前已經推出Y-STR熒光標記復合擴增試劑盒，但是國外試劑盒所采用的Y-STR基因座是根據歐美人群的遺傳數據選擇的，在實際應用中發現有部分基因座并不適合中國人群，而且價格昂貴。為此自主開發適合中國人群的Y-STR熒光標記復合擴增試劑盒，提高個體識別能力，降低檢驗鑒定費用，充分發揮Y-STR檢驗在實際案件生物物證鑒定中作用是當務之急。
發明內容
本發明針對中國人Y-STR基因座的特點，利用聚合酶鏈反應在一個反應中同時擴增多個短串聯重復基因座。本發明還涉及將該擴增體系應用于個人識別和親子鑒定中，其靈敏感度高，分型結果準確，完全能夠滿足實際案件檢驗的需要。Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，該復合擴增體系同時擴增Y染色體上的10 個基因座DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439 和 DYA7. 2。上述擴增體系中還包括一個性別鑒定基因座Amelogenin，該性別基因座作為該試劑盒進行檢測的內對照。所述基因座分成三組，分別由三種不同顏色的熒光素標記，三組組合分另Ij 為:Amelogenin+DYS19+DYS389-l+DYS389-2 ；DYS390+DYS391+DYS392+DYS393 ； DYS438+DYS439+DYA7. 2。所述Amelogenin+DYS19+DYS389-l+DYS389-2 組為綠色 JOE 熒光素標記，所述 DYS390+DYS391+DYS392+DYS393 組為藍色 FAM 熒光素標記；所述 DYS438+DYS439+DYA7. 2 組為黑色TAMRA熒光素標記。所述基因座由一對引物擴增，其中一個引物的5’末端帶有熒光標記。所述引物對分別為Amelogenin 弓I物引物 1 :AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG，引物 2 ATGGCATGTAGTGAGGACA ；DYS19 引物;引物 1 :ATGGCATGTAGTGAGGACA，引物 2 CTACTGAGTTTCTGTTATAGT ；DYS389-1/2 引物:引物 1 :TCTTATCTCCACCCAGA，引物 2 CCAACTCTCATCTGTATTATCTAT ；DYS390 引物引物 1 TGACAGTAAAATGAACACATTGC，引物 2 TATATTTTACACATTTTTGGGCC ；DYS391 引物引物 1 GATTCTTTGTGGTGGGTCTG，引物 2 CTATTCATTCAATCATACACCCA ；DYS392 引物引物 1 :AGACCCAGTTGATGCAATGT，引物 2 TCATTAATCTAGCTTTTAAAAACAA ；DYS393 引物 引物 1 :AACTCAAGTCCAAAAAATGAGG，引物 2 GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC ；DYS438 引物引物 1 GTGGCAGACGCCTATAATCC，引物 2 TGGGGAATAGTTGAACGGTAA ；DYS439 引物
引物 1 :GCCTGGCTTGGAATTCTTTT，引物 2 ACATAGGTGGAGACAGATAGATGATDYA7.2 引物引物 1 TTCAGGTAAATCTGTCCAGTAGTGA，
引物 2 AGGCAGAGGATAGATGATATGGAT。一種試劑盒，包括上述引物對混合物，所述引物對中一個引物的5’端進行熒光素標記。還包括上述基因座等位基因標準物。上述試劑盒在檢測分析人體DNA樣品中的應用。所述DNA樣品來源于血液、唾液或毛發、精斑。根據對中國男性人群具有高度遺傳多態性和良好的等位基因頻率分布分析，選擇 DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYA7. 2 共 10 個Y-STR基因座及性別鑒定基因座Amelogenin作為本發明擴增體的的Y-STR基因座。通過分析，特別是DYA7. 2基因座在中國人群中遺傳多態性遠高于其他Y-STR試劑盒所選擇的基因座，提高了整個試劑盒的個體識別能力，非常適合在中國人群的個體識別鑒定中應用。在實際的檢測中上述基因座同時還加上鑒別人性別的Amelogenin基因座作為檢測的內對照，一起構成同時檢測的11個基因座的復合擴增系統。不僅可以對男性樣品進行 Y-STR基因型檢測，而且由于性別基因座的存在，還能夠對Y-STR檢驗失敗原因給出初步的分析結論。本發明將11個基因座分為三組，分別采用不同的熒光素標記，即Amelogenin+DYS 19+DYS389-1+DYS389-2 組為綠色 JOE 熒光素標記，DYS390+DYS391+DYS392+DYS393 組為藍色FAM熒光素標記；DYS438+DYS439+DYA7. 2組為黑色TAMRA熒光素標記，擴增上述基因座的引物、濃度和上述熒光標記顏色、位置，見表1、2所示。本發明通過上述基因座的特異性引物的設計及其濃度選用，以及獨特的基因座組合熒光標記方式，使得本發明復合擴增體系中，僅采用三種標記就可以在同一個復合擴增體系中同時擴增本發明的11個基因座，且其擴增產物均控制在100-400bp之間，靈敏度非常高。發明創造的效果和優點1、與國內相關技術比較本試劑盒選擇DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、 DYS438、DYS439、DYA7. 2共10個Y-STR基因座及性別鑒定基因座Amelogenin作為檢測的目的基因，根據各基因基因座擴增片段的長度的范圍，將上述引物分為三組，每組中不同基因座的擴增片段長度彼此不交叉，三組引物分別采用三種不同顏色的熒光標記。擴增產物通過毛細管電泳分離后，可以清楚地將各基因基因座的等位基因擴增片段分離，達到通過一次擴增和電泳檢測即可以對十個Y-STR基因座及性別鑒定基因座Amelogenin進行檢測的目的。本試劑盒操作簡單、快速、靈敏度高、高效、節約模板、個體識別能力強。在檢測時， 其DNA樣品的模板量僅需50pg就可以檢出全部11個基因座。目前國內還沒有成型的熒光標記Y-STR復合擴增技術。本試劑盒屬于國內首創。2、與國外試劑盒比較本試劑盒選擇DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYA7. 2共10個Y-STR基因座及性別鑒定基因座Amelogenin作為檢測的目的基因，與目前已經成型的技術方法相同比較，本試劑盒有兩個基因座不同。對上述基因座在中國人群中的分布頻率進行調查分析，特別是DYA7. 2基因座在中國人群中遺傳多態性遠高于其他Y-STR試劑盒所選擇的基因座，其個體識別能力高于國外試劑盒相同數目基因座的個體識別能力，更適合中國人群個體識別檢驗鑒定。另外，本試劑盒包含有性別鑒定基因座，而目前國外相關技術中還沒有將性別位點納入Y-STR復合擴增試劑盒中的報道。當 Y-STR復合擴增試劑盒檢測失敗時，無法確定失敗的原因，而由于本試劑盒采用性別鑒定基因座Amelogenin作為內對照，可以直接鑒別失敗的原因是由于檢材中不含有男性DNA還是檢材質量問題，及時糾正檢驗鑒定方向，節省時間。本試劑盒在PCR擴增操作、檢驗靈敏度、 結果的自動化分析和標準化判讀等其他方面都達到國外同類商品化試劑盒的水平。
圖1對無關個體DNA樣品的檢測結果，圖2本發明中基因座等位基因分型標準物，圖3刑事案件鑒定的結果實施例1本試劑盒包括10個Y-STR基因座及性別鑒定基因座Amelogenin的引物混合液、 PCR反應緩沖液、Taq Gold DNA聚合酶及各基因座等位基因標準物。1、Y-STR基因座的選擇及引物的設計與合成根據中國人群遺傳數據的報道，選擇DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、 DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYA7. 2 共 10 個 Y-STR 基因座及性別鑒定基因座 Amelogenin，設計合成PCR擴增引物，在每對引物中的一條引物的5’端標記熒光，各基因基因座的引物序列及標記熒光見表1 表1 各基因座引物及熒光染料標記
權利要求
1.Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，該復合擴增體系同時擴增Y染色體上的10個基因座和性別位點基因座DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、 DYS438、DYS439、DYA7. 2 和 Amelogenin。
2.根據權利要求1所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，所述基因座分成三組， 分別由三種不同顏色的熒光素標記，三組組合分別為Amelogenin+DYS19+DYS389-l+DYS38 9-2 ；DYS390+DYS391+DYS392+DYS393 ；DYS438+DYS439+DYA7. 2。
3.根據權利要求2所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，所述Amelogenin+DYS 19+DYS389-1+DYS389-2 組為綠色 JOE 熒光素標記，所述 DYS390+DYS391+DYS392+DYS393 組為藍色FAM熒光素標記；所述DYS438+DYS439+DYA7. 2組為黑色TAMRA熒光素標記。
4.根據權利要求3所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，所述基因座由一對引物擴增，其中一個引物的5’末端帶有熒光素標記。
5.根據權利要求4所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系，所述引物分別為 Amelogenin 弓丨物引物 1 :AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG， 引物 2 :ATGGCATGTAGTGAGGACA ； DYS19引物引物 1 :ATGGCATGTAGTGAGGACA，引物 2 CTACTGAGTTTCTGTTATAGT ；DYS389-1/2 引物引物 1 :TCTTATCTCCACCCAGA，引物 2 CCAACTCTCATCTGTATTATCTAT ；DYS390 引物引物 1 :TGACAGTAAAATGAACACATTGC， 引物 2 :TATATTTTACACATTTTTGGGCC ； DYS391 引物引物 1 GATTCTTTGTGGTGGGTCTG, 引物 2 CTATTCATTCAATCATACACCCA ； DYS392 引物引物 1 :AGACCCAGTTGATGCAATGT， 引物 2 TCATTAATCTAGCTTTTAAAAACAA ； DYS393 引物引物 1 :AACTCAAGTCCAAAAAATGAGG， 引物 2 GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC ； DYS438 引物引物 1 :GTGGCAGACGCCTATAATCC， 引物 2 TGGGGAATAGTTGAACGGTAA ； DYS439 引物引物 1 GCCTGGCTTGGAATTCTTTT, 引物 2 :ACATAGGTGGAGACAGATAGATGAT ；DYA7. 2 引物:引物 1 :TTCAGGTAAATCTGTCCAGTAGTGA， 引物 2 :AGGCAGAGGATAGATGATATGGAT。
6.一種試劑盒，包括權利要求5所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系中的引物混合物記。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其中還包括權利要求5所述的Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系中基因座等位基因標準物。
8.權利要求6或7所述試劑盒在檢測分析人體DNA樣品中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，所述DNA樣品來源于血液，唾液、毛發、精斑。
全文摘要
本發明涉及“Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系及應用”，屬于檢測人體基因組中具有多態性遺傳標記領域。該復合擴增體系能同時擴增基因座DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYA7.2和Amelogenin。同時本發明通過的特異性引物的設計，以及獨特的基因座組合熒光標記方式，使得僅采用三種標記就可以同時擴增上述基因座，且其擴增產物均控制在100-400bp之間，靈敏度非常高。根據該擴增體系設計的試劑盒操作簡單、快速、靈敏度高、高效、節約模板、個體識別能力強，達到國外同類商品化試劑盒的水平。
文檔編號G01N21/64GK102433374SQ20101029510
公開日2012年5月2日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者于蛟, 劉鋒, 姜先華, 李軍, 邵武, 陳初光 申請人:基點認知技術(北京)有限公司, 遼寧省刑事科學技術研究所