一種用于診斷或檢測白血病的試劑盒的制作方法

專利名稱：一種用于診斷或檢測白血病的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，尤其涉及一種用于診斷或檢 測白血病的試劑盒。
背景技術：
白血病是造血干細胞克隆性疾病，是一組高度異質性的惡性血液病。白血病的發 生與環境污染、壓力增大等因素有關，但根本原因還是基因的異常表達。基因診斷在白血病 的診斷、療效觀察、預后判斷等方面發揮重要的作用，用于白血病基因診斷的方法主要有熒 光原位雜交(FISH)技術和常規RT-PCR技術，但是這兩種方法都不夠靈敏，定量不準確。白 血病需要盡早發現，及時治療，且在白血病的治療過程中，許多完全緩解后的白血病最終會 復發，原因是患者體內仍然存在不能用常規方法檢測出來的低水平的腫瘤細胞，稱為微小 殘留病(MRD)。臨床治療需要檢測MRD的方法的靈敏度達到IO5 IO6個細胞的水平，并且 能夠定量、快速、價廉、易于標準化，更重要的是在不同實驗室的檢測結果能重復。實時熒光 定量PCR在全封閉的試管中進行，可以快速準確地定量基因表達，使患者在不同病期、不同 實驗室進行檢測的結果有了可比性，為白血病的基因診斷提供了技術保障，具有常規技術 無法比擬的優越性。Wnt5a是Wnt蛋白家族19個成員之一，其基因定位于染色體3p21 pl4，它主要激 活非經典Wnt通路，在發育的組織、骨髓基質細胞和造血細胞中有表達，可促進造血干/祖 細胞分化發育。近來Wnt5a與腫瘤研究逐見報道，不同腫瘤中，Wnt5a表達失調不一致。如 在人類胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、牙源性瘤中過表達，在體外促進腫瘤細胞增殖和遷移， 表現出癌基因的活性。而在甲狀腺癌、乳腺癌、子宮癌、結腸癌、前列腺癌和急性白血病中， Wnt5a表達下調或缺失，表現出抑癌基因的活性，在治療緩解后表達恢復。Wnt5a與白血病發生的研究報道不多，發明人課題組曾以RT-PCR方法檢測發現， Wnt5ai88.9% (24/27)的正常人骨髓中陽性表達，在100% (10/10)的CD34+細胞中表達， 在白血病細胞株中表達缺失，在髓細胞白血病患者骨髓標本中僅有13. 2% (9/68)陽性表 達，淋巴細胞白血病患者骨髓標本中為7. 7% (1/13)而在完全緩解的髓細胞白血病患者骨 髓標本中陽性表達率升高到65. 7% (23/35)，緩解的淋巴細胞白血病病例升高到71. 4%, 是白血病患者的5倍，提示Wnt5a表達缺失可能與白血病的發生及預后有關。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于診斷或檢測白血病的試劑盒，其主要包含淋巴 細胞分離液、總RNA提取液、逆轉錄緩沖液、M-MLV逆轉錄酶、逆轉錄引物Oligo (dT) 18、RNA 酶抑制劑、DEPC水、定量PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因標準品、內對 照GAPDH基因標準品、檢測Wnt5a基因的引物和熒光探針、檢測內對照GAPDH基因的引物和 熒光探針。所述試劑盒包含的各組分的濃度為5X逆轉錄緩沖液、200U/ μ L M-MLV逆轉錄酶、500ng/y L逆轉錄引物01igo(dT)18、40U/y L RNA酶抑制劑、DEPC水、IOX定量PCR緩 沖液、IOU/ μ L Taq DNA聚合酶、IOmM dNTPs溶液、IO8拷貝/ μ Lffnt5a基因標準品、IO8拷貝 / μ L內對照GAPDH基因標準品。所述Wnt5a基因標準品為含有Wnt5a部分編碼序列的重組pMD_19質粒，該Wnt5a 部分編碼序列如SEQ ID N0:1所示。所述GAPDH基因標準品為含有GAPDH部分編碼序列的重組pMD_19質粒，該GAPDH 部分編碼序列如SEQ ID NO 2所示。所述檢測Wnt5a基因的引物如SEQ ID NO :3_4所示、熒光探針如SEQ IDNO :5所不。所述檢測GAPDH基因的引物如SEQ ID NO :6_7所示、熒光探針如SEQ IDNO :8所不。所述的試劑盒，還包含陽性對照和陰性對照。所述陽性對照為正常人骨髓細胞總RNA逆轉錄合成的cDNA。所述陰性對照為滅菌雙蒸水。本試劑盒中淋巴細胞分離液常溫下保存，總RNA提取液置4°C保存，其它試劑應保 存于-20°C，盡量減少反復凍融。本發明還提供上述的試劑盒的使用方法，其操作簡便快速、費用低廉且易于標準 化，其主要包括步驟a.從待測標本中分離有核細胞，提取細胞總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉錄緩沖 液、M-MLV逆轉錄酶、逆轉錄引物Oligo (dT) 18、RNA酶抑制劑和dNTPs溶液，將RNA逆轉錄為 cDNA ；b.分別將已知拷貝數的Wnt5a和內對照GAPDH基因標準品倍比稀釋至108、107、 106、105、104、103、IO2UO1 個拷貝數 / μ L ；c.分別以步驟a所得待測cDNA及步驟b所得倍比稀釋的Wnt5a和GAPDH基因標 準品為模板，加入檢測Wnt5a基因的上、下游引物和熒光探針，檢測內對照GAPDH基因的上、 下游引物和熒光探針，定量PCR反應液以及Taq DNA聚合酶，進行熒光定量PCR ；d.模板的循環閾值與該模板的初始拷貝數的對數存在線性關系，根據倍比稀釋 的Wnt5a和內對照GAPDH基因標準品的循環閾值與初始拷貝數分別繪制Wnt5a和內對照 GAPDH基因標準曲線，再根據待測cDNA的循環閾值對其含有的Wnt5a和內對照GAPDH基因 的初始拷貝數進行定量。e.所述步驟c的PCR擴增條件為95°C預變性2分鐘，然后95°C變性10秒、58°C 退火40秒，共40個循環。本發明提供的用于診斷或檢測白血病的試劑盒，制備簡單、檢測方便、快速靈敏、 定量準確、重復性好、特異性高，適于臨床應用。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


現結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
圖Ia為將本發明試劑盒Wnt5a基因標準品模板按10倍梯度稀釋后，實施熒光定 量PCR獲得的熒光反應曲線，縱坐標代表相對熒光強度，橫坐標代表循環數，圖中平行于橫 坐標的直線代表循環閾值。圖Ib為將本發明試劑盒Wnt5a基因標準品模板按10倍梯度稀釋后，實施熒光定 量PCR獲得的標準曲線，其橫坐標代表起始模板濃度的對數，縱坐標代表循環數。圖2a為將本發明試劑盒內對照GAPDH基因標準品模板按10倍梯度稀釋后，實施 熒光定量PCR獲得的熒光反應曲線，縱坐標代表相對熒光強度，橫坐標代表循環數，圖中平 行于橫坐標的直線代表循環閾值。圖2b為將本發明試劑盒內對照GAPDH基因標準品模板按10倍梯度稀釋后，實施 熒光定量PCR獲得的標準曲線，其橫坐標代表起始模板濃度的對數，縱坐標代表循環數。
具體實施例方式為了更加清楚的說明本發明的目的、技術方案及使用方法等，下面結合實施例對 本發明進一步詳細描述。實施例lWnt5a基因mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的配制本試劑盒包括如下組成部分a.淋巴細胞分離液、Trizol總RNA提取液、5 X逆轉錄緩沖液、200U/ μ LM-MLV逆 轉錄酶、500ng/y L逆轉錄引物01igo(dT)18、40U/y L RNA酶抑制劑、DEPC-H2OUOx定量 PCR緩沖液、IOU/μ L Taq DNA聚合酶、IOmM dNTPs溶液。(淋巴細胞分離液購自天津TBD 公司、Trizol總RNA提取液購自Invitrogen公司)b. Wnt5a基因標準品含有Wnt5a部分編碼序列的重組pMD_19質粒，其濃度為IO8 拷貝/ μ L，所含Wnt5a核苷酸序列為5 ’ -AGTTCTTCCTAGTGGCTTTGGCCATATTTTTCTCCTTCGCCCAGGTTGTAATTGAAGCCAATTCTT GGTGGTCGCTAGGTATGAATAACCCTGTTCAGATGTCAGAAGTATATATTATAGGAGCACAGCCTCTCTGCAGCCAA CTGGCAGGACTTTCTCAAGGACAGAAGAAACTGTGCCACTTGTATCAGGACCACATGCAGTACATCGGAGAAGGCGC GAAGACAGGCATCAAAG-3，(SEQ ID NO 1)c. GAPDH基因標準品含有GAPDH部分編碼序列的重組pMD_19質粒，其濃度為IO8 拷貝/ μ L,所含GAPDH核苷酸序列為5 ’ -ACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATT TCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3，(SEQ ID NO 2)d.檢測Wnt5a基因所用上下游引物及熒光探針分別為Wnt5a-檢測上游引物5，-CCCAGGTTGTAATTGAAG-3，(SEQ ID NO 3),Wnt5a-檢測下游引物5，-ATATACTTCTGACATCTGAAC-3，(SEQ IDNO 4)，Wnt5a-熒光探針5，-FAM-CATACCTAGCGACCACCAAGAA-TAMRA-3，(SEQ ID NO :5)。e.檢測GAPDH基因所用上下游引物及熒光探針分別為GAPDH-檢測上游引物5，-CACTCCTCCACCTTTGAC-3，(SEQ ID NO 6),GAPDH-檢測下游引物5，-CACCCTGTTGCTGTAGCC-3，(SEQ IDNO 7)，GAPDH-熒光探針5，-FAM-TGCCCTCAACGACCACTTTGTC-TAMRA-3，(SEQ ID NO :8)。
檢測Wnt5a和內對照GAPDH基因的上下游引物和熒光探針濃度均為10 μ mol/L。f.陽性對照為正常人骨髓細胞總RNA逆轉錄合成的cDNA，陰性對照品為滅菌雙蒸 水。其中Wnt5a和GAPDH基因標準品的制備方法如下細胞總RNA提取培養表達Wnt5a基因的Jurkat細胞(李招權等，“Wnt5a基因在 血液病及白血病細胞株中的表達”，中國實驗血液學雜志，2007，15 (5) 927-930)，IOOOrpm 離心5分鐘收集約IO7個Jurkat細胞，轉移至1. 5mL EP管中，按實施例2中步驟②的方 法提取Jurkat細胞總RNA。cDNA的合成根據RNA定量結果，取1 μ g RNA，按實施例2中步驟③的方法逆 轉錄合成cDNA。PCR擴增取逆轉錄cDNA 1 μ L，5 X PCR緩沖液5 μ L、濃度為10 μ mol/L的標準品 引物各1 μ L、濃度為IOmM的dNTP溶液1 μ L，濃度為IOU/ μ L的Taq DNA聚合酶0. 2 μ L， 最后雙蒸水補足25 μ L ；PCR條件為94°C預變性3分鐘，然后94°C變性30秒、57°C退火45 秒、72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。標準品的克隆PCR產物電泳檢測后，切膠回收目的基因條帶，定量之后與pMD-19 載體連接，轉化到DH5ci菌中，培養后進行藍白篩選，提取陽性克隆質粒測序鑒定。鑒定后 的陽性質粒即為標準品，紫外分光光度法測質粒濃度并換算成拷貝數/體積。經測序確定 設計的標準品與預期序列相符。此外，本試劑盒中的淋巴細胞分離液、Trizol總RNA提取液、逆轉錄緩沖液、M-MLV 逆轉錄酶、逆轉錄引物Olig0 (dT) 18、RNA酶抑制劑、PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶 液均為RT-PCR的常規試劑，使用者可以自行制備或購買，故本試劑盒也可以不包括上述試 劑。實施例2Wnt5a基因mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的檢測本試劑盒每次檢測均設立陽性對照和陰性對照，其檢測方法包括以下步驟①骨髓或外周血有核細胞的分離將新鮮抗凝骨髓加入等體積生理鹽水稀釋，充 分混勻；離心管中先加入1/2體積(指稀釋后骨髓體積)的淋巴細胞分離液，將稀釋后骨髓 小心加入到分離液面上，保持清晰的界面，2000rpm離心15min ；小心吸取有核細胞層于離 心管中，用生理鹽水洗兩次，每次500rpm離心5min。②總RNA的提取加1. OmL Trizol于分離的細胞中，充分混勻，室溫靜置5min ；力口 入200 μ L的氯仿，用力振蕩15秒，室溫靜置2 3min，在4°C 12000rpm離心15min ；將上 層無色水相轉移入另一干凈Ep管，加等體積的異丙醇，混勻，室溫放lOmin，在4°C 12000rpm 離心15min ；小心棄上清，加1. OmLDEPC水配制的75% (V/V)乙醇，在4°C 7500rpm離心 5min。小心吸去大部分上清液，開蓋，室溫干燥IOmin ；沉淀用25 μ L DEPC水溶解，并吸出部 分溶液，用紫外分光光度計測定OD26tl和0D·。根據RNA在260nm波長處有最大的吸收峰， OD260值為1相當于大約40 μ g/mL的單鏈RNA，乘以稀釋倍數，即可得RNA濃度。③cDNA的合成根據RNA定量結果，取1 μ g RNA,加入Oligo (dT) 181· 0 μ L，再用 DEPC水補足體積至13 μ L，混勻，離心5s后，70°C預熱5min，立即冰浴lmin，再依次加入5 X 逆轉錄緩沖液 4. 0 μ L，IOmM dNTPs 1. 0 μ 1、200U/μ L 逆轉錄酶 M-MLV 1. 0 μ L、40U/μ L 的 RNA酶抑制劑l.OyL,最后總體積為20 μ L。混勻，離心5s后，42°C溫浴Ih, 95V 5min,產物置-20°C保存。④分別將已知濃度的Wnt5a和GAPDH基因標準品倍比稀釋至108、IO7, ΙΟ6、ΙΟ5、104、 IO3UO2UO1 個拷貝數/μ L。⑤分別以步驟③所得的cDNA及步驟④所得的倍比稀釋的Wnt5a和GAPDH基因標 準品為模板，進行熒光定量PCR ；PCR體系為10 X定量PCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為10 μ mol/ L的Wnt5a和GAPDH基因上下游檢測引物各1 μ L、濃度為10 μ mol/L的各基因熒光探針各 1. 2 μ L、濃度為IOmM的dNTP溶液1 μ L，濃度為IOU/ μ L的Taq DNA聚合酶0. 2 μ L、濃度為 IOOng/ μ L的待測cDNA或倍比稀釋的Wnt5a和GAPDH基因標準品1 μ L、雙蒸水補足25 μ L ； PCR條件為95°C預變性2分鐘，然后95°C變性10秒、58°C退火、延伸45秒，共40個循環 (PCR條件可根據不同的熒光定量PCR儀略作調整)；每個循環結束時在波長為525nm進行 熒光檢測。⑥模板的循環閾值與該模板的初始拷貝數的對數存在線性關系，根據倍比稀釋 的Wnt5a和內對照GAPDH基因標準品的循環閾值與初始拷貝數分別繪制Wnt5a和內對照 GAPDH基因標準曲線，再根據待測cDNA的循環閾值對其含有的Wnt5a和內對照GAPDH基因 的初始拷貝數進行定量。 實施例3試劑盒性能評價為了檢測Wnt5a基因mRNA實時熒光定量PCR方法的可重復性和靈敏度，本發明采 用重復性實驗和靈敏度實驗進行評價。1.標準曲線制備及線性范圍取梯度稀釋的Wnt5a和GAPDH基因質粒標準品(IO8-IO1c0Pies/ μ L)進行熒光定 量PCR反應。反應條件95 °C預變性2分鐘，然后95 °C變性10秒、58 °C退火、延伸45秒，共40 個循環，于退火溫度下收集熒光信號。根據儀器所檢測到的熒光信號經軟件處理(Bio-rad 公司iQ5 定量PCR儀自帶)獲得標準曲線，并計算相關系數(R)，得出線性范圍，見圖la、 Ib 和圖 2a、2b。結果為在IO8-IO1拷貝/ μ L Wnt5a和GAPDH基因均有有良好的線性關系，標準 曲線的相關性很好。其中根據標準曲線求得Wnt5a的回歸方程為y = -3. 333x+35. 406, R2 =0. 996 ；GAPDH 的回歸方程為:y = -3. 236x+32. 379，R2 = 0. 999。其相關系數分別為R2wnt5a = 0. 996，R2gapdh = 0. 999。2.靈敏度將Wnt5a和GAPDH基因標準品質粒以10倍梯度稀釋至濃度極限10拷貝/ μ L，用 去離子水做陰性對照，進行熒光定量反應，能區別于陰性對照的最低質粒濃度即為該法的 靈敏度。檢測結果顯示所建方法最低能檢測IO1拷貝/ μ L的重組質粒。3.重復性試驗以濃度分別為ΙΟ8、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO1 拷貝 / μ L 的 Wnt5a 和 GAPDH 基因 標準品做標準曲線，取IO7個Jurkat細胞，按本試劑盒使用方法所述步驟提取RNA，逆轉錄， 進行定量PCR反應。對同一批稀釋制備的質粒模板同時進行10次批內重復性檢測；對不同 天稀釋制備的質粒模板進行10天天間重復性檢測，結果見表1。表1 批內、天間重復性檢測結果
權利要求
一種用于診斷或檢測白血病的試劑盒，其特征在于，其包含淋巴細胞分離液、總RNA提取液、逆轉錄緩沖液、M MLV逆轉錄酶、逆轉錄引物Oligo(dT)18、RNA酶抑制劑、DEPC水、定量PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因標準品、內對照GAPDH基因標準品、檢測Wnt5a基因的引物和熒光探針、檢測內對照GAPDH基因的引物和熒光探針。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含的各組分的濃度為 5X逆轉錄緩沖液、200U/ii L ] -]\0^逆轉錄酶、500叫/111^逆轉錄引物01180((11018、4(^/111^ RNA酶抑制劑、DEPC水、10 X定量PCR緩沖液、10U/ u LTaq DNA聚合酶、10mM dNTPs溶液、 108拷貝/ y L Wnt5a基因標準品、108拷貝/ y L內對照GAPDH基因標準品。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述Wnt5a基因標準品為含有 Wnt5a部分編碼序列的重組pMD-19質粒，該Wnt5a部分編碼序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述GAPDH基因標準品為含有 GAPDH部分編碼序列的重組pMD-19質粒，該GAPDH部分編碼序列如SEQ ID NO 2所示。
5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測Wnt5a基因的引物如SEQ ID NO 3-4所示、熒光探針如SEQ ID NO 5所示。
6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測GAPDH基因的引物如SEQ ID NO 6-7所示、熒光探針如SEQ ID NO 8所示。
7.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，還包含陽性對照和陰性對照。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為正常人骨髓細胞總RNA 逆轉錄合成的cDNA。
9.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為滅菌雙蒸水。
全文摘要
本發明涉及一種用于診斷或檢測白血病的試劑盒，其包含淋巴細胞分離液、總RNA提取液、逆轉錄緩沖液、M-MLV逆轉錄酶、逆轉錄引物Oligo(dT)18、RNA酶抑制劑、DEPC水、定量PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs溶液、Wnt5a基因標準品、內對照GAPDH基因標準品、檢測Wnt5a基因的引物和熒光探針、檢測內對照GAPDH基因的引物和熒光探針。本發明提供的用于診斷或檢測白血病的試劑盒，制備簡單，檢測方便、快速靈敏、定量準確、重復性好、特異性高，適于臨床應用。
文檔編號G01N21/64GK101942519SQ20101029498
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者司維柯, 李軍, 李招權, 楊宗林, 潘靜, 趙宸 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學