專利名稱：一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物活性檢測方法，特別是涉及一種大豆北方莖潰瘍病菌 (Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell)Sacc. var. caulivora Athow & Caldwell,DPC)的活性檢測方法。
背景技術：
大豆北方蓬饋蕩病菌(Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell) Sacc. var. caulivora Athow & Caldwell，DPC)是嚴重危害大豆生產的一種種傳病原真菌，屬子囊菌門、子囊菌綱、間座殼目、黑腐皮殼科、間座殼屬，無性階段為擬莖點霉屬。大豆北方莖潰瘍病菌能侵染大豆植株的各個生長階段，植株受侵染的莖組織部位易碎，表皮剝落，形成環形帶的環狀損傷，嚴重時導致植株死亡。受侵染的種子皺縮，變輕， 外表白堊狀。發病嚴重的田塊有80%的植株受到侵染，產量損失高達50%，造成嚴重的經濟損失。該菌主要以帶病植物殘體及種子進行遠距離傳播，種子帶菌率達10% -20%. 近年來該病害發展迅速，在美國、加拿大、阿根廷(Pioli et al.，2003)、厄瓜多爾、巴西 (Costamilan et al.，2008)、保加利亞、克羅地亞、塞爾維亞、黑山、法國、意大利、俄羅斯、 西班牙、韓國等國家及地區有發生報道，是國外大豆生產上的重要真菌病害。病原菌活性檢測是檢驗檢疫的一項重要任務，對正確的評價有害生物的入侵風險具有重要意義。為了研究準確、靈敏、快速的檢測方法，對大豆北方莖潰瘍病菌的檢測研究主要集中于分子生物學方面，這類方法如PCR等，能夠提高檢測效率，但是不能反映病原菌的活性情況。目前，大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測依賴于傳統的形態學鑒定方法，該方法因為需要通過10天左右的保濕培養，然后對培養物進行形態學鑒定，所以在進行病原菌形態學鑒定的同時也確定了其活性，因此，真正意義上的單獨對大豆北方莖潰瘍病菌的活性研究尚未有報道。雖然，通過形態學鑒定能夠準確、可靠的檢測出大豆北方莖潰瘍病菌的活性，但是該方法耗時長，不能很好的滿足實際檢驗檢疫工作的需要。
發明內容
本發明的目的是針對上述大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測時間長的問題，提供一種新的簡便、快速的大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法。為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，該方法采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察經過熒光染料染色的大豆北方莖潰瘍病菌孢子，優選的染料為碘化丙啶。所述活性檢測方法中碘化丙啶的染色終濃度為0. 05 μ mol/L-2 μ mol/L,優選染色濃度為 0. 05 μ mol/L-0. 06 μ mol/L。所述碘化丙啶染料的染色時間為15min-30min，優選為15min，且染色過程于室溫避光條件下進行。由于采用以上技術方案，本發明的有益效果在于
本發明的活性檢測方法能夠有效的區分大豆北方莖潰瘍病菌孢子的死活，從制樣到檢測完成僅需要30分鐘，可以直接對單個孢子的染色情況進行死活判斷。本發明具有快速、準確、靈敏、重復性好等特點，有望替代傳統的通過形態學檢測活性的方法，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
圖1為本發明一種實施例的大豆北方莖潰瘍病菌單個孢子活性檢測圖，圖中A和 B為活孢子的掃描結果圖，A為激光掃描通道下的掃描結果，孢子內部沒有熒光，B為明場通道下的掃描結果，C和D為死孢子的掃描結果圖，C為激光掃描通道下的掃描結果，孢子內部顯示紅色熒光，D為明場通道下的掃描結果。
具體實施例方式本發明公開了一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，包括如下步驟(1)孢子懸浮液配制；用滅菌去離子水配置大豆北方莖潰瘍病菌孢子懸浮液，收集于1. 5mL離心管中，振蕩混勻，IOOOOrpm離心lmin，棄上清收集孢子；再加入ImL滅菌去離子水洗滌孢子，IOOOOrpm離心lmin，棄上清，最后加入ImL滅菌去離子水重懸，獲得孢子懸浮液，濃度約為105-106個/mL。(3)孢子染色處理；采用染料對孢子懸浮液進行染色，優選的染料為碘化丙啶， 染色條件為，室溫下避光染色15min-30min，優選15min ；離心移棄含有染料的上清液，終止染色，滅菌蒸餾水洗滌兩次，重懸孢子，制片。所用染料碘化丙啶與孢子懸浮液混合后， 碘化丙啶在混合液中的適合染色終濃度應在0. 05ymOl/L-2ymOl/L，優選染色濃度為 0. 05ymol/L-0. 06ymol/L。(4)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察；采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察對染色制片的孢子進行觀察，為確保掃描的準確性，觀察明場通道下所得孢子圖像是否清晰。顯微鏡參數設置如下物鏡Objective為63倍油鏡，激光管為氬離子激光器，熒光信號激發波長為480-500nm，熒光信號發射波長為555-565nm，設置一個明場通道作為對照，探測針孔 Pinhole為IAU即IAiry Units = 0. 8 μ m，光電倍增管增益feiin為560，激光掃描強度Scan Str為5%，掃描模式為line，重復掃描次數Average為2，掃描速度kan speed為6，精確掃描方式xy為2048X2048。(5)結果判定；根據激光掃描共聚焦顯微鏡對單個孢子的染色情況掃描結果進行判斷，活孢子染色后孢子內部沒有熒光，而死孢子內部有熒光(圖1)。為確保檢測的準確性，每個樣品隨機觀察30個孢子。激光掃描共聚焦顯微鏡技術是在傳統光學顯微鏡基礎上采用共軛聚焦裝置，以激光為光源對不同的熒光染料進行激發，使其產生不同的熒光信號，并利用計算機對熒光信號進行數字圖象采集、分析最后輸出系統，形成可以直接觀察的圖像信息，因此激光掃描共聚焦顯微鏡技術比傳統的形態學鑒定所用的顯微鏡具有更準確和靈敏的觀察效果，對不同的熒光染料均有較好的適用性，本發明優選采用染料為碘化丙啶。碘化丙啶染色法通常應用于植物和動物的細胞染色，由于真菌的孢子外壁及膜成分組成與動植物的細胞不同，研究對象的不同，會造成結果的差異，適合植物或動物細胞活性染色的染料不一定適合真菌 抱子染色，甚至在不同的真菌檢測對象之間也會有不同的適用性差異，因此需要進行詳細 的實驗論證才能獲得適合大豆北方莖潰瘍病菌活性染色檢測的染料和染色條件。下面通過具體實施例并結合附圖對本發明作進ー步詳細說明。以下實施例僅僅對 本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測一、儀器和材料(1)供試菌株來源于美國大豆上分離的單孢菌株(Diaporthe phaseolorum var. caulivora)。(2)熒光染料本實驗采用的染料為Molecular Probes公司的碘化丙啶(PI)，該染料激發波長 為536nm，發射波長為617nm。(3)培養基PDA :200g馬鈴薯于1，OOOmL水中煮沸約20min后，用雙層紗布過濾，濾液定容到 IL后加入20g瓊脂粉并加熱溶解，再加入20g葡萄糖，121°C高壓蒸汽滅菌20min，備用。WA 1, OOOmL去離子水煮沸，加入18 20g瓊脂粉并加熱溶解，121°C高壓蒸汽滅 菌20min，備用。美國大豆豆桿流水沖洗表面灰塵，121°C高壓蒸汽滅菌20min，備用。(4)主要儀器設備LSM 5E)(CITER激光掃描共聚焦顯微鏡 ZEISSZEISS STANDARDS 顯微鏡ZEISSHICLAVE HV-50 高壓滅菌鍋HIAYAMASC-R型生物安全柜Labcairespectrafuge 24D 型臺式離ンネ幾Labnet International incDK-S28型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司SANYO MLR-350HT 生化培養箱SANYOSIEMENS KK242III 冰箱SIEMENSニ、實驗方法(1)菌株培養挑取大豆北方莖潰瘍病菌培養物接種于PDA培養基平板上，用Parafilm膜密封培 養皿，于條件下光照培養7天。將上述培養的菌株沿著菌落邊緣切取3_5mm見方的菌絲塊至于滅過菌的豆桿上， 保濕培養30天左右，產生子囊及子囊孢子備用。(2)孢子懸浮液配制挑取大豆莖潰瘍病菌的子囊及子囊孢子收集于1. 5mL離心管中，振蕩混勻，獲得 孢子懸浮液，濃度約為IO4個孢子/mL。(3)激光掃描共聚焦顯微鏡掃描對大豆北方莖潰瘍病菌孢子激光掃描共聚焦顯微鏡掃描設置如下將樣品制備 玻片，封片，倒置于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上，低倍鏡下找到孢子，轉到100倍油鏡(Objective)下觀察，微調至視野內圖像清晰。根據所用染料，選擇相應的激光管(氬離子激光器)激發熒光信號，設置熒光通道的激發波長G88nm)，收集熒光信號的發射波長 (560nm)，并設置一個明場通道作為對照。選擇低像素的平面掃描方式進行粗略掃描(xy 512X512)，依據掃描成像效果中熒光信號強弱可調整探測針孔(Pinhole :1AU即IAiry Units = 0.8 μ m)、光電倍增管增益(Gain :560)、激光掃描強度(Scan Str )，根據圖像信噪比調整掃描模式(line)、重復掃描次數(Average 2)和掃描速度(Scan speed :6)等， 調整至成像質量較好時，再用精確掃描方式(xy =2048X2048)獲取最終圖像。本實驗中，首先確保是同一組掃描參數對所有樣品進行掃描，然后要保證圖像能夠反映出孢子最真實的熒光染色情況，則需觀察明場通道下所得孢子圖像是否清晰。(4)孢子萌發實驗將大豆北方莖潰瘍病菌新鮮配制的孢子懸浮液1.5mL，分裝為兩組一組未經水浴處理，表示為imkilled(UK)——活孢子，另一組經50 °C水浴處理5min，表示為 killed (K)——死孢子，混勻，分別取約含200個孢子的孢子懸浮液于PDA平板上均勻涂布， 用Parafilm封口，下光照培養M小時，顯微鏡下觀察孢子萌發情況，每個樣品統計200 個孢子，計數萌發率。(5)碘化丙啶染料處理病菌孢子將大豆北方莖潰瘍病菌新鮮配制的孢子懸浮液1. 5mL,分裝為兩組一組未經水浴處理，另一組經50°C水浴處理5min，取12 μ mol/L碘化丙啶染料1 μ L加到200 μ L孢子懸浮液(染料在混合液中的終濃度為0. 06 μ mol/L)，混勻，室溫下避光染色15min，13，OOOrpm 離心;3min去上清液終止染色，滅菌去離子水洗滌三次，重懸，避光放置。制備玻片，LSCM掃描取圖，觀察染色結果。三、結果與分析(1)孢子萌發實驗結果新鮮配制的孢子懸浮液萌發實驗表明孢子的萌發率為95%，50°C水浴處理5min 孢子全部不萌發。(2)碘化丙啶對病菌活孢子和死孢子染色結果根據激光掃描共聚焦顯微鏡掃描結果，經碘化丙啶染色后，活孢子和子囊染色后沒有熒光，死孢子和死子囊染色后呈紅色熒光，碘化丙啶染色能夠明顯區分大豆北方莖潰瘍病菌活孢子、子囊與死孢子、子囊。以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，其特征在于采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察經過熒光染料染色的大豆北方莖潰瘍病菌孢子。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于所述熒光染料為碘化丙啶。
3.如權利要求2所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色濃度為0.05ymol/L-2ymol/L。
4.如權利要求3所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色濃度為0.05μ mol/ L-0. 06ymol/L。
5.如權利要求2-4所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色時間為15min-30min，且染色過程于室溫避光條件下進行。
6.如權利要求5所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色時間為15min。
全文摘要
本發明公開了一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，該方法利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測，能夠快速、準確、靈敏的區分大豆北方莖潰瘍病菌孢子的死活，可以替代傳統的孢子活性檢測方法，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
文檔編號G01N21/64GK102401792SQ201010277268
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優先權日2010年9月9日
發明者馮建軍, 向才玉, 王穎, 程穎慧, 章桂明 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心