阪崎腸桿菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒和制備方法

專利名稱：阪崎腸桿菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒和制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測阪崎腸桿菌的方法，以及用于該方法的阪崎腸桿菌金標 快速診斷試劑盒和其制備方法。
背景技術：
近年來，世界范圍重大食品安全事件頻頻發生，瘋牛病、葡萄球菌腸毒素牛奶中 毒、蘇丹虹、二惡英、三聚氰胺等事件對全球經濟和社會政局穩定造成巨大影響。在諸多食 品安全實踐中，嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌污染備受關注。阪崎腸桿菌(E. sakazakii)是近年來從奶粉(乳)制品中發現的、在一定條件下 可使人致病的一種食源性致病菌，屬于腸桿菌屬腸桿菌科的一種周生鞭毛、能運動的革蘭 氏陰性無芽孢桿菌，1980年由黃色陰溝菌更名為阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌是腸道正常菌群 的一種，在一定條件下可引起人和動物致病。阪崎腸桿菌在自然界的污染來源尚不清楚，但它在食品中分布較廣泛，主要危害 對象是嬰兒，尤其是新生兒、早產兒、低出生體重兒或免疫力低下新生兒，可引起嚴重的菌 血癥、腦膜炎、小腸結腸炎、造成嚴重的神經系統后遺癥和死亡，感染死亡率高達20-50%， 在某些情況下可達40-80%。2004年世界糧農組織和世界衛生組織經過風險性評估將阪崎 腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方奶粉A類致病菌。世界糧農組織和世界衛生組織通報，在不同地區，嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌 檢出率在2-22. 7%之間。因此，食源性阪崎腸桿菌污染已引起各國政府高度關注，加強了乳 品生產及進出口環節檢測，國外乳業巨頭所生產產品曾因檢出阪崎腸桿菌而被召回。阪崎 腸桿菌的生物學特征和檢測檢驗技術已成為學術界、政府和企業關注的熱點，已建立了實 時熒光定量PCR技術國際通用檢測標準，我國于2005年由中國檢驗檢疫研究院和天津檢疫 檢驗局牽頭完成了《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業標準，并已實施。實時熒光定量PCR 技術具有熒光定量PCR反應過程實時檢測、熒光定量重復性好、基因分析穩定性好、熒光檢 測濃度梯度實驗性范圍寬、熱循環升溫快速、熒光定量在對數期進行定量分析等優勢。其檢 測林敏度高、特異性強。但該方法還存在檢測設備昂貴、操作技術要求高、樣本污染易造成 假陽性等不足。目前檢測阪崎腸桿菌的方法主要是通過常規生化鑒定、血清學檢測和PCR測定法。國際檢測阪崎腸桿菌的標準生化方法是美國食品和藥品管理局(FDA)的檢測方 法，對嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌分離與計數，用“三管法”增菌可檢測樣品中微量的阪崎 腸桿菌并定量，檢測時至少需要333g樣品。我國目前尚無該菌檢測方法的國家標準，只有 行業標準。其中改進的傳統方法與FDA方法比較，檢測結果一致，但效率大大提高，時間縮 短了 1/3 1/2。盡管如此，常規檢測方法仍存在耗時較長，對檢驗員的要求較高，假陰性較 高的弊端。血清學檢測成本低廉，易于操作，制備多克隆抗體可用于輔助常規生化檢測，快速進行中毒診斷。我國國家標準目前仍然使用血清學鑒定的方法用于沙門氏菌、志賀氏菌的 分型。血清學檢測的缺點是易產生交叉反應，不適合作為獨立的檢測方法應用。分子生物學尤其是PCR技術的發展給阪崎腸桿菌的快速檢測提供了廣闊的空間。 除了普通PCR方法和熒光PCR方法，還有依據該菌生理生化特征建立的分子檢測方法。隨 機擴增多態性DNA(RAPD)、脈沖電場凝膠電泳(PFGE)、染色體DNA分析、核糖核酸分型以及 質粒分型等也都已用于對阪崎腸桿菌分型研究。但PCR法檢測費用昂貴，對儀器設備及檢 測環境的要求很高。阪崎腸桿菌感染具有發病急，致死率高等特點，同時該菌的自然來源非常廣泛，并 且目前對其致病機制還不是很清楚，雖然近年來相關檢測技術取得了很大的進展，但仍然 存在一些缺陷。所以，進一步研究該菌的快速、準確、靈敏的檢測方法對食源性致病菌感染 的控制、疾病的診斷和流行病學調查非常關鍵。本發明采用阪崎腸桿菌免疫家兔或羊制備多表位抗體，免疫BALB/c小鼠制備單 克隆抗體，研制一種可適用于現場操作的金標快速診斷試劑盒，本試劑盒可特異性的檢測 阪崎腸桿菌，檢測快速(5-20分鐘出結果)，可用于發病現場快速診斷。本發明的公開本發明的第一目的是提供一種阪崎腸桿菌的檢測方法，該方法為一步檢測法，靈 敏度高、特異性強，而且反應速度快、操作簡便，無需專門設備，適用于臨床檢測、流行病學 調查和場地檢疫等多種場合。本發明的第二目的是提供一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒，是針對阪崎腸 桿菌檢測提供的一種簡便而且直接的一步法檢測試劑盒，利用該試劑盒檢測阪崎腸桿菌的 靈敏度高、特異性強，速度快、操作簡便，無需專門設施。本發明的第三目的是提供一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，該 方法簡便、穩定性好、重復性好。本發明的第一目的可通過如下措施來實現一種阪崎腸桿菌檢測方法包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗阪崎腸桿菌抗體 載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被抗阪崎 腸桿菌抗體形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠 體金標記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌則在檢測載體上形成檢測線、控制 線雙線，顯雙線結果判定為陽性，僅控制線顯色，結果判定為陰性。本發明的第二目的可通過如下措施來實現一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒內設阪崎腸桿菌金標檢測卡組成。檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內。所述的阪崎腸桿菌金 標檢測條是在襯板上設有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水 層之間設有金標阪崎腸桿菌抗體層，在檢測層上包被有由抗阪崎腸桿菌單抗形成的檢測線 和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。本發明的第三目的可通過如下措施來實現一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標抗體層和檢 測層的控制線，檢測線的包被，然后再襯板上組合阪崎腸桿菌金標測試條和檢測板。所述的金標抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，在濃度為0. 005-0. 012%的氯金酸中加入其體積的1. 3-2%、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸10-20 分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記抗阪崎腸桿菌抗體，在膠體金溶液中 用0. 2M碳酸鉀溶液調pH7. 6-8. 6，按2-8mg/100ml加入阪崎腸桿菌抗體，攪拌后，再在溶液 中按0. 1-0. 6g/100ml加入動物血清蛋白，4°C靜置2_4小時；iii將上述膠體金溶液經2000 轉/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液經10000轉/分鐘離心60-80 分鐘離心得沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI緩沖液得膠體 金溶液，該緩沖液中含0. 2-0. 6%的動物血清蛋白和0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi將膠體金溶液 浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，37°C干燥過夜形成金標抗體層。所述的檢測 層的制備是在纖維素膜上設有阪崎腸桿菌抗體構成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成 的控制線。其制備方法是濃度為l_2mg/ml的或抗體溶液中加入的固定劑，再利用噴 膜機將抗體噴在纖維素膜上，噴膜后37°C干燥，再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS， 在37°C下封閉30分鐘，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。所述的固定劑選用甲醛、丙酮中的一種。本發明相比現有技術具有如下優點1、本發明檢測、診斷阪崎腸桿菌的方法為一步法，具有較高的特異性和靈敏性，且 操作簡便，無需專門設施。2、本發明的診斷試劑盒檢測阪崎腸桿菌時具有較高的特異性和靈敏性，檢測過程 操作迅速、快捷、方便，適用于臨床檢驗、流行病學調查和場地檢疫等多種場合。3、本發明的診斷試劑盒的制備方法簡便、穩定性好、重復性好。圖面說明

圖1是發明檢測板的外觀結構示意圖1-檢測板 2-加樣孔 3-檢視窗圖2是本發明檢測板的內部結構示意圖4-加樣端吸水層 5-金標抗體層 6-控制線 7-檢測線8-檢測層 9-吸水端吸水層 10-襯板本發明的實施方式本發明還將結合實施例作進一步詳述實施例一一種阪崎腸桿菌檢測方法包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗阪崎腸桿菌抗體 載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被阪崎腸 桿菌抗體形成的檢測線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠 體金標記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌則在檢測載體上形成檢測線、控制 線雙線，顯雙線結果判定為陽性，僅控制線顯色結果判定為陰性。參照圖1，一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒內設阪崎腸桿菌金標檢測卡1。參照圖2，所述的阪崎腸桿菌金標檢測卡1是在襯板10上設有加樣端吸水層4、檢 測層8和吸水端吸水層9，在檢測層和加樣端吸水層4之間設有金標阪崎腸桿菌抗體層5， 在檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層 濾紙制成；檢測層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜；金標抗體 層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標記抗體制成。
一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標抗體層(5) 和檢測層(8)的質控線(6)、檢測線(7)的包被，然后再襯板(10)上組合阪崎腸桿菌金標測 試條和檢測卡(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水層4和吸水端吸水層9 ；在 其中段粘貼包被檢測線和控制線的纖維素膜層8，在加樣端吸水層4與纖維素膜層8的交接 部位，夾貼含金標抗體層5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5 部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長規格切條，在組裝于塑料盒內。盒蓋上 加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。所述的金標抗體層5的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取IOOmg氯金 酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到 15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記阪崎腸桿菌抗體，取IOOml膠體金溶液，用0. 2ml 碳酸鉀溶液調PH8. 4，加入6mg阪崎腸桿菌抗體，攪拌20分鐘，再加入MOmg牛血清白蛋白， 繼續攪拌5分鐘，4°C靜置2-4小時；iii將上述膠體金溶液經2000轉/分鐘離心10分鐘， 棄沉淀物，收集上清液；iv將上清液經10000轉/分鐘離心60分鐘離心收集沉淀物；ν將 沉淀物按^iVlOOml溶于0. 02M、pH7. 4的Tris-HCI緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含 0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%疊氮鈉；vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體 開始滲出為止，在37°C下2小時干燥而形成金標抗體層5。所述膠體金標記抗體為羊、兔抗 阪崎腸桿菌抗體。所述的檢測層8是在硝酸纖維素膜上設有阪崎腸桿菌抗體構成的檢測線7和由 羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其制備方法是取抗阪崎腸桿菌抗體，調濃度為Img/ ml，加入2 %的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7 ；再取羊或兔抗鼠IgG調濃度 為2mg/ml，加入2%的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0. 5cm處，噴控制線6，按 20ul/10cm設置噴膜量，噴膜37°C干燥，2小時，再用0. 01MpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在 37°C下封閉30分鐘，0. 01MpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。實施例二 阪崎腸桿菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒與例一同。該試劑盒的制備方法除制備膠體金標記的抗體為抗阪崎腸桿菌單克隆抗體外，其 他條件與例一同。
權利要求
1.一種阪崎腸桿菌檢測方法，其特征在于(1)將膠體金標記的阪崎腸桿菌抗體載于 玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被抗阪崎腸桿 菌抗體(多抗或單抗)形成的檢測線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取檢測 樣本稀釋液滴于膠體金標記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌，則在檢測載體 上形成檢測線和控制線雙線，顯雙線結果判定為陽性，僅控制線顯色結果判定為陰性。
2.一種阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒內設阪崎腸桿菌金標檢 測卡，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡盒內。
3.如權利要求2所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑卡，其特征在于所述的阪崎腸 桿菌金標檢測卡⑴是在襯板(10)上設有加樣端吸水層G)、檢測層⑶和吸水端吸水層 (9)，在檢測層⑶和加樣端吸水層⑷之間設有金標阪崎腸桿菌抗體層(5)，在檢測層⑶ 上包被有檢測線(7)和控制線(6)。
4.如權利要求2所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于制備 金標抗體層( 和檢測層(8)的控制線(6)、檢測線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合阪 崎腸桿菌金標測試條和檢測卡(1)。
5.如權利要求4所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的金標抗體層(5)的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，在濃度為0. 004 0. 012% 的氯金酸中加入其體積的1. 3 2%，濃度為1 3%的檸檬酸三鈉，煮沸10 20分鐘， 可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記抗阪崎桿菌單克隆抗體，在膠體金溶 液中用0. 2m碳酸鉀溶液調pH8. 0 8. 4，按4 12mg/100ml加入抗人阪崎桿菌單克隆抗 體，攪拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動物血清蛋白，4°C靜置2_4小時；iii 將上述膠體金溶液經2000轉/分鐘離心10 15分鐘，棄沉淀物，得上清液；iv將上清 液經10000轉/分鐘離心60 80分鐘離心得沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml溶于 0. 02M、pH7. 4Tris-HCI緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含0. 2-0. 6 %的動物血清蛋白和 0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi將上述膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止， 37°C干燥過濾形成金標抗體層。
6.如權利要求4或5所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于 所述膠體金標記抗體為羊或兔抗阪崎腸桿菌抗體或阪崎腸桿菌單克隆抗體。
7.如權利要求4所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的檢測層(8)是在纖維素膜上設有羊或兔抗阪崎腸桿菌抗體或阪崎腸桿菌單克隆抗體構 成的檢測線(7)和由抗羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權利要求7所述的阪崎腸桿菌金標快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的固定劑為甲醛或丙酮。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測阪崎腸桿菌的方法，以及用于該方法的金標快速診斷試劑盒和其制備方法，其檢測方法包括(1)將膠體金標記的抗阪崎腸桿菌抗體載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被抗阪崎腸桿菌抗體形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；(2)取樣品稀釋液滴于膠體金標記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌，則在檢測載體上形成檢測線和控制線雙線，結果判定為陽性；僅控制線顯色，結果判定為陰性。該試劑盒由檢測卡組成，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內，檢測條是在襯板上設有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水層之間設有金標阪崎腸桿菌抗體層，在檢測層上包被有由抗阪崎腸桿菌單抗形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。
文檔編號G01N33/577GK102135541SQ201010272890
公開日2011年7月27日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者周海飛, 張遠興, 李克生, 李志遠, 杜惠芬, 鄭悅, 馬國榮 申請人:李克生