專利名稱：糖鏈衍生物的制造方法、結構解析方法、以及糖鏈衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及來自糖鏈的混合物的糖鏈衍生物的制造方法、以及糖鏈的結構解析方 法。進一步，涉及根據本發明的糖鏈衍生物的制造方法制造的新的糖鏈衍生物。
背景技術：
糖蛋白質中的糖鏈認為具有保持蛋白質的立體結構、獲得防止被蛋白酶的分解的 抵抗性等作用。最近，逐漸地闡明了糖蛋白質中的糖鏈參與受精和分化、信號傳導、癌化、蛋 白質的細胞內輸送和生理活性的調節等的生命現象。另外，還闡明了細胞表面的粘接分子 和糖蛋白質性激素等的糖鏈與其功能的關系，總結了糖質科學公會(consortium)構想。現 在，糖鏈功能研究的中心研究以影響其的生合成糖轉移酶(糖鏈基因)為中心，如果考慮糖 轉移酶還根據基因組情報被保存，利用與其他蛋白質的協調作業，參與生命功能，還需要利 用捕捉細胞、組織中表達的糖鏈的整體圖像進行解析的結構糖組學(glyconomics)手法， 進行糖鏈的功能解析。糖鏈科學中的結構糖組學的作用是綜合地解析在多數生命現象中擔負重要作用 的糖鏈識別機理，對功能糖組學是不可缺少的要素。作為結構糖組學所要求的技術的要素， 有高綜合性、高生產量、高感度以及高精度。現在，作為糖蛋白質糖鏈的結構解析法，對從蛋白質切出的糖鏈進行熒光標記后， 利用高效液相色譜(HPLC)或者質譜分析法(MS)的解析的方法成為利用質譜分析的快速技 術進步的有力的手段(非專利文獻1 4)，唾液酸糖鏈的分離中，逐漸地專門地利用陰離子 交換色譜色譜(非專利文獻5)。非專利文獻1Biomed Chromatogr. 16 103-115 (2002)非專利文獻2Anal Biochem. 206 :278_287 (1992)非專利文獻3Biochem Soc Trans. 21 121-125 (1993)非專利文獻4Chem Rev. 102 :321_369 (2002)非專利文獻5Biochim Biophys Acta. 705 167-173 (1982)但是，對細胞或組織中的糖鏈綜合解析的場合，由于存在唾液酸和巖藻糖等的非 還原末端修飾的多樣性和糖鏈的分枝這樣的問題，不能充分地分離混合存在的糖鏈，不能 得到滿意的結果。特別地，如果使用離子交換色譜等，由于沒有特異的分離能力，不僅不能 獲得充分的分離，而且分離操作后必須要進行脫鹽處理，可以說并不是實用的方法。因此，對這些的糖鏈不均一性情報有擔心，同時迫切希望對細胞、組織可以詳細進 行特征糖鏈結構解析的實用的手法。本發明的課題在于，提供從像細胞或者組織中的糖鏈那樣混合存在的各種的糖鏈 的狀態分離、獲取各糖鏈的手段。另外，本發明課題在于，提供對于分離的各糖鏈化合物的結構進行解析的手段。進一步，本發明的課題在于提供新的糖鏈衍生物。
發明內容
本發明涉及以下的發明。1.糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于， 包括下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的 工序、以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺(serotonin)親合柱色譜法進行處理 的工序。2.上述1記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具備(C)采用氨基 柱或者酰氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。3.上述記載的糖鏈衍生物的制造方法，其中，在(C)工序之前，具備(d)用糖水解 酶進行處理的工序。4.糖鏈的結構解析方法，是解析糖鏈混合物中的糖鏈的結構的方法，其特征在于， 具備以下工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的 工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進行處理的工序、以及(e)用 質譜分析法進行處理的工序。5.上述記載的糖鏈的結構解析方法，其特征在于，在(b)工序之后，具備(C)通過 采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。6.上述記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(C)工序之前具備(d)用糖水解酶進 行處理的工序。7.上述4記載的糖鏈的結構解析方法，其中，質譜分析法是利用MALDI-TOF MS的 質譜分析法。8.后述的式(1) (6)表示的糖鏈衍生物[式中R1表示2-羧基苯基、3-羧基苯 基、4-羧基苯基、ρ-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羥基、基-Asn或者基-Asn-R3。 在此，Asn表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保護基。Ac表示乙酰基。]。9.由式(1) (6)表示的糖鏈衍生物衍生的癌標記物。本發明人等經過深入研究，結果發現在糖鏈上導入脂溶性基成為糖鏈衍生物后， 采用把對唾液酸有親合性的5-羥色胺作為配基的親合柱色譜法進行處理，由此可以進行 無唾液酸糖鏈和唾液酸糖鏈的分離，還可以利用唾液酸殘基的數目對唾液酸糖鏈中的單唾 液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖鏈等進行分離。進一步還發現，把利用該親合柱色譜法分離的級分，分別供給使用氨基柱或者酰 氨基柱的色譜，將分枝結構不同的糖鏈衍生物可以進行詳細分離，可以大量地制造單一結 構的糖鏈。另外還發現，使分離的各糖鏈衍生物與適當的糖水解酶作用，供給采用氨基柱或 者酰氨基柱的色譜進行分離，對得到的糖鏈衍生物用質譜分析法進行處理，由此可以高精 度且綜合地解析糖鏈結構，進而完成了本發明。在本發明的制造方法中使用的糖鏈混合物的糖鏈沒有特別的限制，包括天冬酰胺 鍵合型糖鏈(N-葡糖甙鍵合型糖鏈)、muCin型糖鏈(0-葡糖甙鍵合型糖鏈)、游離型糖鏈、 進一步還包括像糖鏈鍵合天冬酰胺那樣的結合了氨基酸的糖鏈。這些糖鏈也可以是利用化學的手法調制的糖鏈，例如，從天然的糖蛋白質由來的 糖鏈在其非還原末端的糖殘基隨機欠失的糖鏈的混合物，優選使用這些糖鏈的混合物。此外，優選使用含有在糖鏈殘基上具有唾液酸殘基的糖鏈的糖鏈混合物。作為天然糖鏈的混合物，可舉出天然原料、例如乳汁、牛由來胎球蛋白、卵或者生 體的組織或細胞由來的糖鏈混合物。特別地，使用癌組織或者癌細胞由來的糖鏈混合物可 以期待特別濃厚興趣的結果。作為本發明中可以使用的天然糖鏈的混合物，可優選以下所示的糖鏈混合物，特 別優選含有唾液酸糖鏈的糖鏈混合物。可以使用下述獲得的混合物，S卩，從該天然原料中利用公知的方法獲得糖蛋白質 以及/或者糖肽的混合物，使當該混合物與蛋白質分解酶等作用，切斷肽部分，利用采用凝 膠過濾柱或者離子交換柱等的色譜法進行精制獲得的糖鏈鍵合天冬酰胺的混合物。另外，可以使用下述獲得的混合物，S卩，采用例如生體的組織或者細胞、特別是培 養組織或培養細胞，將培養液中的組織或者細胞勻化，然后將離心分離獲得的細胞膜級分， 用2-巰基乙醇處理后，使作用于N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖鏈的混合物。另外，可以使用將培養組織或培養細胞勻化，采集離心分離的上清液獲得的游離 糖鏈的混合物。在這些的糖鏈之中由于含有作為中性糖鏈的高甘露糖型糖鏈和多種唾液酸 糖鏈，所以適用于各種糖鏈的制造。在獲得的糖鏈的混合物中的糖鏈上導入脂溶性基使其成為糖鏈衍生物的混合物。脂溶性基是與糖鏈的還原末端的開環醛、糖鏈鍵合天冬酰胺的天冬酰胺氨基或者 羧基反應形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3_或者4-羧基苯基氨基、ρ-乙氧基羰基苯 基氨基、2-吡啶基氨基等作為通常熒光標記使用的取代基、或者9-芴基甲氧基羰基(Fmoc) 基、叔-丁氧基羰基(BOC)基、芐基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等的作為氨基甲酸酯系或 者酰胺系保護基使用的取代基。這些脂溶性基的導入可以利用公知的方法進行導入，從操作的簡便、得到的糖鏈 衍生物的穩定性、激發光與水銀光源或者激光光源對應等方面出發，可以優選使用2-羧基 苯基氨基、Fmoc基或者BOC基。例如，采用2-氨基苯甲酸，在氰基硼氫化鈉或者二甲基氨基化硼等的還原劑的存 在下，使其與糖鏈反應，由此可以成為氨基醛糖醇衍生物。另外，例如采用9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，在碳酸氫鈉存在下，使與糖 鏈鍵合天冬酰胺反應，可以在天冬酰胺的氨基導入氨基甲酸酯樣上鍵合的Fmoc基。根據以上的操作，可以得到導入了脂溶性基的糖鏈衍生物的混合物。把獲得的糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法進行分離。本發明中的5-羥色胺親合柱色譜法可以采用把與唾液酸具有親合性的5-羥色胺 作為配基的親合柱。作為5-羥色胺親合柱，可以將5-羥色胺固定在填充劑上制成，也可以采用市售的 柱。作為市售的柱，可舉出LA-5-羥色胺柱(株式會社J-才O S ^ *制)等。色譜的分離條件可以適當設定，如果舉出其一例，采用熒光檢測器，設定激發波長 350nm、熒光波長425nm，流速0. 5ml/min、流動相使用超純水和醋酸銨水溶液，進行直線梯 度洗脫，可以達到分離。通過5-羥色胺親合柱色譜法，將糖鏈衍生物的混合物，根據糖鏈衍生物的唾液酸 殘基的數目可以進行分離，沒有唾液酸殘基的無唾液酸糖鏈衍生物最早洗脫，接著按單唾液酸糖鏈衍生物、二唾液酸糖鏈衍生物這樣地與唾液酸殘基的數目增加成比例地進行分離 洗脫。把利用以上的5-羥色胺親合柱分離的糖鏈衍生物，用采用聚合物基質的氨基柱 或者二氧化硅基質的酰氨基柱的正相HPLC進行處理，由此可以很好地進行糖鏈衍生物間 的分離。所謂正相色譜法，是將氨基、氨基丙基、丙烯酰胺基等極性固定相作為填充劑使用 的色譜法，其特征在于，根據相對于試料成分的固定相-流動相的試料成分的分配度的差 別達到分離。基本上是基于糖鏈的親水性而分離的模式，還可以優選用在結合了唾液酸的 糖鏈的異構體的分離中。另外，還可以利用在采用稀酸或者唾液酸苷酶處理的無唾液酸型 的糖鏈的分離中。作為使用的聚合物基質的氨基柱，是將把氨基結合在聚乙烯醇系基材凝膠等的聚 合物上的固定相作為填充劑使用的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的氨基柱，可舉出Asahi Shodex NH2P-504E(昭和電工株式會社制)。作為二氧化硅基質的酰氨基柱，是將把丙烯酰胺等的酰胺基與把二氧化硅作為固 定相的填充劑進行化學鍵合而導入的柱子，可以使用自制的柱子、也可以使用市售的柱子。作為市售的酰氨基柱，可舉出TSK-GEL Amide-80 (T0S0H Corp制)。色譜的分離條件進行適宜地設定，如果舉出其一例，通過采用熒光檢測器，激發波 長350nm、熒光波長425nm，流速lml/min，流動相采用含有醋酸的乙腈和醋酸以及含有三乙 胺的水溶液，進行線性梯度洗脫可以進行分離。以上那樣分離獲得的糖鏈衍生物通過采用糖水解酶、利用質譜分析法進行分析， 可以將其糖鏈結構解析。作為糖水解酶，可以采用公知的酶，例如可舉出唾液酸酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷 酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶(acetylglucosamidase)、巖藻糖苷酶等。作為質譜分析方法，利用采用現有公知的質譜分析法的質譜分析裝置進行，近年 特別優選采用用于糖鏈分析的MALDI-TOF MS進行測定。為了解析糖鏈結構，與特定的糖水解酶作用后，通過采用聚合物基質的氨基柱或 者二氧化硅基質的酰氨基柱的正相HPLC處理，將得到的級分質譜分析，考慮到消失的質量 分和水解酶的特性，可以通過進一步反復該操作進行糖鏈結構解析。獲得的糖鏈衍生物通過將其脂溶性基除去，可以人工容易地且大量地獲得各種的 糖鏈。脂溶性基的除去可以使用現有公知的方法。例如，2-羧基苯基氨基的除去通過在醋酸中與過氧化氫在室溫進行反應而達到， 可以容易地作為游離型糖鏈回收。另外，Fmoc基的除去通過在N，N- 二甲基甲酰胺中、糖鏈衍生物中加入嗎啉進行反 應來達到，為了除去BOC基，通過與弱酸反應來達到。糖鏈是糖鏈鍵合天冬酰胺的場合，通過與無水胼反應后乙酰化的方法，在堿性水 溶液中加熱回流后乙酰化的方法等，可以除去天冬酰胺殘基。該糖鏈類，在醫藥品開發等領域中非常有用，可舉出例如癌的疫苗合成，將得到的 糖鏈類組合利用化學反應或糖轉移酶的反應等鍵合新的糖殘基而衍生物化，可以開發新的 疫苗。
本發明人等通過本發明的結構解析方法以及制造方法，成功地分離出在各種癌細 胞中迄今為止沒有發現的下述式(1) (6)表示的糖鏈。
權利要求
癌細胞由來的糖鏈的結構解析方法，是解析癌細胞由來的糖鏈混合物中的糖鏈的結構的方法，其特征在于，具備以下工序(a)在癌細胞由來的糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序、(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5 羥色胺親合柱色譜法進行處理的工序、以及(e)用質譜分析法進行處理的工序。
2.權利要求1記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(b)工序之后，具備(c)利用采用 氨基柱或者酰氨基柱的正相色譜法進行處理的工序。
3.權利要求1記載的糖鏈的結構解析方法，其中，在(c)工序之前，具備(d)用糖水解 酶進行處理的工序。
4.權利要求1記載的糖鏈的結構解析方法，其中，質譜分析法是利用MALDI-TOFMS的 質譜分析法。
5.下表所示的糖鏈衍生物，
全文摘要
本發明涉及糖鏈衍生物的制造方法，是從糖鏈混合物制造糖鏈衍生物的方法，其特征在于，具備下述工序(a)在糖鏈混合物中的糖鏈上導入脂溶性基，得到糖鏈衍生物的混合物的工序，以及(b)將該糖鏈衍生物的混合物用5-羥色胺親合柱色譜法處理的工序。
文檔編號G01N27/62GK101949901SQ201010266780
公開日2011年1月19日 申請日期2006年7月19日 優先權日2005年7月19日
發明者掛樋一晃, 木下充弘, 松野裕樹 申請人:大塚化學株式會社