專利名稱：鉛離子抗原及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鉛離子抗原及其制備方法與應用。
背景技術：
重金屬是環境與農產品中的重要污染物質，可以通過食物鏈在動物及人的體內富 集，對人類健康會帶來嚴重的危害。鉛是重金屬污染中毒性較大的一種，一旦進入人體很難 排除。直接傷害人的腦細胞，特別是胎兒的神經板，可造成先天大腦溝回淺，智力低下；對老 年人造成癡呆、腦死亡。目前，重金屬鉛的分析方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發射光/ 質譜法、X-射線熒光光譜法、電位溶出分析法以及近幾年發展的生物傳感器檢測法等。但 是用這幾種方法檢測鉛離子需要昂貴的儀器設備，檢測費用高，耗時，不能用于現場快速檢 測。與儀器分析法相比，免疫分析法具有快速、簡便、實時、易于進行現場檢測、樣品前處理 簡單、靈敏度高、選擇性強、適合于高通量分析等優點，而且還能大幅度降低檢測成本。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種制備鉛離子抗原的方法。本發明所提供方法，包括如下步驟1)將螯合劑溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亞硝酸鹽水溶液，進行重氮化反 應，得到重氮化的螯合劑；2)將步驟1)得到的重氮化的螯合劑和載體蛋白溶液混合，進行偶聯反應，得到所 述螯合劑與載體蛋白的偶聯物；3)將步驟2)得到的所述螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子的溶液混合，進行 絡合反應，得到螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子形成的絡合物，即得到鉛離子抗原。步驟1)中，所述螯合劑、所述酸和所述亞硝酸鹽的投料配比為 2. 5mg 2.5Xl(T4mol 0.7Xl(T5mol;步驟2)中，所述重氮化螯合劑和所述載體蛋白的投料摩爾比為12 1 ；步驟3)中，所述偶聯物與所述鉛離子的投料摩爾比為1 12。步驟1)中，所述重氮化反應的條件為反應溫度為0°C，反應時間為15min，避光；步驟2)中，所述偶聯反應的條件為反應溫度為41^!1為7.5，避光，反應時間為 8h ；在步驟3)中，所述絡合反應的條件為反應溫度為251^!1值為7.5，反應時間為 12h。步驟1)中，所述螯合劑為對氨基芐基乙二胺四乙酸；所述亞硝酸鹽為亞硝酸鈉， 所述酸的水溶液中，所述酸為鹽酸、硫酸、硝酸或硼酸；在步驟2)中，所述載體蛋白溶液按照如下方法制備將載體蛋白溶解到緩沖液 中得到所述載體蛋白溶液；所述緩沖液為碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液，所述緩沖液的pH值為9. 6;所述載體蛋白為牛血清 白蛋白或卵清白蛋白；在步驟3)中，所述鉛離子的溶液為硝酸鉛水溶液。所述步驟3)中，所述絡合反應后，包括將絡合反應產物進行透析得到鉛離子抗原 的步驟，所述透析用的溶液是PH值為7.5、濃度為0.1!1101/1 PB (磷酸鹽溶液)溶液，IL所 述PB溶液按如下方法制備將0. 2g KH2PO4和2. 96g Na2HPO4 · 12H20溶于水中，用水定容到 1L。由上述任一所述方法制備得到的鉛離子抗原也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種鉛離子抗原。本發明提供的鉛離子抗原，是重氮化的螯合劑與載體蛋白通過共價鍵連接形成的 偶聯物再與鉛離子通過配位鍵連接形成的絡合物；所述共價鍵是重氮化螯合劑上的氨基上 的氮與載體蛋白酪氨酸上酚羥基的鄰位或對位形成的；所述配位鍵是偶聯物中重氮化螯合 劑上的有孤對電子的氧或氮與鉛離子中空軌道形成的；所述重氮化的螯合劑的結構式如 下
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/=V /~N Cl _ N三口八 j>‘ Lcooh；所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。由上述任一所述鉛離子抗原制備 得到的抗體也屬于本發明的保護范圍。上述任一所述鉛離子抗原和 發明的保護范圍；上述任一所述鉛離子抗原和 免疫試劑盒中的應用；上述任一所述鉛離子抗原和 免疫試劑盒中的應用；上述任一所述鉛離子抗原和 親和色譜柱中的應用；所述樣品為水體、食品或土壤。本發明的實驗證明，本發明中的制備鉛離子抗原的方法能夠方便、快捷地獲得鉛 離子抗原，且合成步驟簡潔明了、合成成本低，效果好。用本發明方法制備的鉛離子抗原進 行免疫得到的抗體的特異性好、最低檢測限值低。因此，本發明中的制備鉛離子抗原的方法 及由該方法獲得的鉛離子抗原在鉛離子的快速免疫檢測應用中將有廣闊的前景。
/或所述抗體在檢測樣品中鉛離子的應用也屬于本 /或所述抗體在制備用于檢測樣品中鉛離子的酶聯 /或所述抗體在制備用于檢測樣品中鉛離子的發光 /或所述抗體在制備用于檢測樣品中鉛離子的免疫
圖1為鉛離子抗原的合成路線圖
圖2為以EDTA-Pb為標準樣品建立的鉛離子間接ELISA法標準曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。對氨基芐基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)購于Sigma公司，產品號A3473.， 弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，EDTA乙二胺四乙酸，牛血清白蛋白，卵清白蛋白和硝酸鉛 Pb (NO3) 2 (原子吸收級)均購于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP購自Jackson公司，鄰苯二 胺(OPD)等其余常規試劑均購自北京化學試劑公司。實施例1、鉛離子抗原及其制備圖1為鉛離子抗原的合成路線圖，具體步驟如下一、鉛-對氨基芐基乙二胺四乙酸_卵清白蛋白抗原(Pb-對氨基芐基-EDTA-0VA) 的制備1、重氮化將2. 5mg對氨基芐基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)溶解于2mL IM的HCl水溶液中，得到溶液I ；在0°C避光條件下，向溶液I中滴加50ul 0. 1 % (質 量百分含量)的NaNO2水溶液，攪拌反應15分鐘，得到重氮化的對氨基芐基乙二胺四乙 酸的酸性溶液。該反應體系中對氨基芐基乙二胺四乙酸、HCl和NaNO2的的投料配比為 2. 5mg 2. 5X10_4mol 0. 7X10_5mol。重氮化的對氨基芐基乙二胺四乙酸的結構式如式I所示
權利要求
一種制備鉛離子抗原的方法，包括如下步驟1)將螯合劑溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亞硝酸鹽水溶液，進行重氮化反應，得到重氮化的螯合劑；2)將步驟1)得到的重氮化的螯合劑和載體蛋白溶液混合，進行偶聯反應，得到所述螯合劑與載體蛋白的偶聯物；3)將步驟2)得到的所述螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子的溶液混合，進行絡合反應，得到螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子形成的絡合物，即得到鉛離子抗原。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述螯合劑、所述酸和所述亞硝酸鹽的投料配比為 2. 5mg 2.5Xl(T4mol 0.7Xl(T5mol;步驟2)中，所述重氮化螯合劑和所述載體蛋白的投料摩爾比為12 1 ；步驟3)中，所述偶聯物與所述鉛離子的投料摩爾比為1 12。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述重氮化反應的條件為反應溫度為0°c，避光，反應時間為15min ；步驟2)中，所述偶聯反應的條件為反應溫度為4°C，PH為7. 5，避光，反應時間為8h ；在步驟3)中，所述絡合反應的條件為反應溫度為25°C，pH值為7.5，反應時間為12h。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述螯合劑為對氨基芐基乙二胺四乙酸；所述亞硝酸鹽水溶液中的亞硝酸 鹽為亞硝酸鈉，所述酸的水溶液中的酸為鹽酸、硫酸、硝酸或硼酸；在步驟2)中，所述載體蛋白溶液按照如下方法制備將載體蛋白溶解到緩沖液中得到 所述載體蛋白溶液；所述緩沖液為碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或4-羥乙 基哌嗪乙磺酸緩沖液，所述緩沖液的pH值為9. 6 ；所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白 蛋白；在步驟3)中，所述鉛離子的溶液為硝酸鉛水溶液。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述絡合反應 后，包括將絡合反應產物進行透析得到鉛離子抗原的步驟。
6.由權利要求1-5中任一所述方法制備得到的鉛離子抗原。
7.一種鉛離子抗原，是重氮化的螯合劑與載體蛋白通過共價鍵連接形成的偶聯物再與 鉛離子通過配位鍵連接形成的絡合物；所述重氮化的螯合劑的結構式如下
8.由權利要求6或7所述鉛離子抗原制備得到的抗體。
9.權利要求6或7所述鉛離子抗原和/或權利要求8中所述抗體在檢測樣品中鉛離子中的應用；權利要求6或7所述鉛離子抗原和/或權利要求8中所述抗體在制備用于檢測樣品中 鉛離子的酶聯免疫試劑盒中的應用；權利要求6或7所述鉛離子抗原和/或權利要求8中所述抗體在制備用于檢測樣品中 鉛離子的發光免疫試劑盒中的應用；權利要求6或7所述鉛離子抗原和/或權利要求8中所述抗體在制備用于檢測樣品中 鉛離子的免疫親和色譜柱中的應用； 所述樣品為水體、食品或土壤。
全文摘要
本發明公開了一種鉛離子抗原及其制備方法與應用。本發明提供的制備鉛離子抗原的方法，包括如下步驟1)將螯合劑溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亞硝酸鹽水溶液，進行重氮化反應，得到重氮化的螯合劑；2)將步驟1)得到的重氮化的螯合劑和載體蛋白溶液混合，進行偶聯反應，得到所述螯合劑與載體蛋白的偶聯物；3)將步驟2)得到的所述螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子的溶液混合，進行絡合反應，得到螯合劑與載體蛋白的偶聯物與鉛離子形成的絡合物。本發明的制備鉛離子抗原的方法及由該方法獲得的鉛離子抗原在鉛離子的快速免疫檢測應用中將有廣闊的前景。
文檔編號G01N33/566GK101935348SQ20101025987
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者南鐵貴, 孫碩, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 譚桂玉, 趙洪偉, 高巍 申請人:中國農業大學