專利名稱：抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑板及制備方法，具體地是一種抗狂犬病毒IgG抗體膠體 金免疫層析檢測試劑板及制備方法。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患傳染病，其主要宿主為 犬、貓等動物。典型癥狀為恐水癥，又稱恐水病。本病極為兇險，病死率幾乎為100%。隨 著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，寵物犬的數(shù)量在不但增加，犬的活動區(qū)域也在不斷 擴大。從寵物醫(yī)療市場得到的信息，人們迫切希望了解寵物犬接種狂犬疫苗后犬只是否獲 得保護力，而目前狂犬病毒抗體的檢測工作因受檢測條件和費用的限制，并沒有得到廣泛 的應用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原體，而我國又是狂犬病的高發(fā)國家，居 世界第二位，僅次于印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多數(shù)的人狂犬病是與人類密切接 觸的帶毒犬傳播的，其危害已經(jīng)引起政府和人民的高度關注。目前，國內外用ELISA方法檢測人血清中抗狂犬病毒抗體，輔助臨床上狂犬病的 診斷和用于狂犬疫苗效果的評價方法已經(jīng)成熟。用于實驗動物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗 體檢測的方法和相應的試劑盒，也有一定的研究和報道。但是現(xiàn)有檢測狂犬病毒抗體的方 法包括ELISA方法、熒光免疫法、放射免疫法及化學發(fā)光法等都存在相應的弱點。ELISA方 法雖然靈敏度高，但容易出現(xiàn)假陽性結果。熒光免疫法、放射免疫法及化學發(fā)光法需要一定 的實驗儀器，且放射免疫法還存在放射性同位素污染的問題。而膠體金免疫層析法剛好可 以避免以上幾種檢測方法的缺點。該方法是一種很成熟的實驗檢測方法，以其特異性強、成 本低，操作簡便，結果可靠、可單份或成批測定、不需任何儀器等優(yōu)點已被廣泛接受。中國 專利公開號為CN1963509的專利申請公開了一種狂犬病毒保護性抗體膠體金檢測試紙條， 該法采用包被糖蛋白，標記狂犬病毒的雙抗原夾心法。中國專利公開號為CN101029894的 專利申請公開了一種動物狂犬病毒抗體雙抗原夾心膠體金檢測試紙及制備方法，該法采用 包被狂犬病毒，標記GP/NP的雙抗原夾心法。中國專利公開號為CN101042401的專利申請 公開了一種犬抗狂犬病毒抗體膠體金免疫層析檢測試劑板及制備方法，該法采用包被糖蛋 白，標記二抗的間接檢測犬抗狂犬病毒IgG的方法。中國專利公開號為CN1326101A的專利 申請公開了一種膠體金免疫層析狂犬病病毒抗體檢測試劑條及制備方法，該法采用包被狂 犬病毒，標記抗人二抗的間接檢測人抗狂犬病毒IgG的方法。以上文獻資料涉及的方法存在著檢測受種屬限制和蛋白純化及復性困難的缺點。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的為了克服上述現(xiàn)有技術存在的問題及缺點，而提供一種抗狂犬病毒 IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板及制備方法。本發(fā)明采用金標記蛋白A(SPA)做探針， 包被狂犬病毒和抗SPA抗體的間接法檢測抗狂犬病毒IgG抗體，可供多種動物和人的抗體檢測。本發(fā)明的試劑板檢測快速，檢測準確率高、特異性強，攜帶方便，操作簡便，檢測試劑 板在常溫下即可保存，無需特殊的設備和儀器。保存期可達1年，且檢測重復性好。本發(fā)明的技術方案為抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板，試劑板水平面自下而上依次 為樣品吸收區(qū)1、金標記蛋白A(SPA)區(qū)2、固相化抗原、抗體區(qū)3和吸水區(qū)4，樣品吸收區(qū)1 鋪設的為在聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜5上鋪設玻璃纖維膜，且玻璃纖維膜上依次鋪設金標 探針聚酯膜7和硝酸纖維素膜6 ；硝酸纖維素膜6上包被檢測線31和對照線32，其中檢測 線31側貼有金標探針聚酯膜7，對照線32側貼有吸水濾紙8，其特征在于檢測線31包被 的是狂犬病毒純化抗原，包被量為0. I-IOyg蛋白；對照線32包被的是抗SPA純化抗體，包 被量為0. 1-10 μ g蛋白，金標探針合適SPA標記量為1-10 μ g/ml。抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板的制備方法，其特征在于按以下 步驟進行(1)狂犬病毒純化抗原的制備將狂犬病毒懸液接種到已長成單層的Vero細胞 上，35°C培養(yǎng)5 6天后，每隔3天連續(xù)收取培養(yǎng)液上清液3次；將收集的病毒懸液濃縮40 倍，并加入體積濃度為1/3000的甲醛溶液滅活病毒；將滅活的病毒懸液于5000rpm離心30 分鐘去沉淀，上清液通過S^harose 4FF層析柱進行純化得狂犬病毒純化抗原；(2)膠體金標記SPA的方法分別取半徑為5-40nm的膠體金20ml及SPA 50-200yg，在pH6.0-7.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血清白蛋白(BSA)作 為穩(wěn)定劑，且使得BSA最終質量濃度為0. 1-5%，采用離心法除去未結合的SPA和未穩(wěn)定的 膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-SPA復合物；(3)將膠體金-SPA復合物噴涂于聚酯膜上用20ml聚乙二醇洗滌膠體金-SPA復 合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2ml濃度為2mmol/L，pH6. 0-8. 0 的硼酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上，凍干；(4)免疫層析膜的包被檢測線包被的是狂犬病毒純化抗原，對照線包被的是抗 SPA純化抗體，每條線寬2-5mm，狂犬病毒純化抗原合適包被量為0. 1-10 μ g蛋白，抗SPA純 化抗體合適包被量為0. 1-10 μ g蛋白；(5)試劑板裝備用聚乙烯板作為支撐載體，上面依次粘上一層聚氯乙烯襯膜、玻 璃纖維組成樣品吸收區(qū)，再依次鋪上吸附了膠體金-SPA復合物的聚酯膜、硝酸纖維膜和吸 水濾紙，外面用膠帶包封制成。本發(fā)明的試劑板具有以下優(yōu)點檢測時，抽取被測者少量血清，滴在該試劑板上，對比檢測線和對照線的顏色，即 可判定被測者體內是否產(chǎn)生了抗狂犬病毒IgG抗體。1、檢測快速檢測時間只需5-10分鐘，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要。2、檢測準確率高、特異性強本反應與其他犬易感病原體沒有交叉反應，檢測靈敏 度與ELISA基本相同。3、攜帶方便，操作簡便本發(fā)明不需要借助其它儀器設備，適合各級人獸醫(yī)院及個 人使用。4、檢測試劑板在常溫下即可保存，無需特殊的設備和儀器。保存期可達1年，且檢 測重復性好。
圖1為抗狂犬病毒IgG抗體檢測試劑板平面結構區(qū)域圖。圖2為抗狂犬病毒IgG抗體檢測試劑板縱切面結構圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明進行詳細的說明實施例1 如圖1、圖2所示，抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板，試 劑板水平面自下而上依次為樣品吸收區(qū)1、金標SPA區(qū)2、固相化抗原、抗體區(qū)3和吸水區(qū) 4，樣品吸收區(qū)1鋪設的為在聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜5上鋪設玻璃纖維膜，且玻璃纖維膜 上依次鋪設金標探針聚酯膜7和硝酸纖維素膜6 ；硝酸纖維素膜6上包被檢測線31和對照 線32，其中檢測線31側貼有金標探針聚酯膜7，對照線32側貼有吸水濾紙8，檢測線31包 被的是狂犬病毒純化抗原，包被量為0. 1 μ g蛋白；對照線32包被的是抗SPA純化抗體，包 被量為0. 1 μ g蛋白，金標探針合適SPA標記量為1 μ g/ml。上述抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板制備方法如下(1)狂犬病毒純化抗原的制備將狂犬病毒懸液接種到已長成單層的Vero細胞 上，35°C培養(yǎng)5或6天后，每隔3天連續(xù)收取培養(yǎng)液上清液3次；將收集的病毒懸液濃縮40 倍，并加入體積濃度為1/3000的甲醛溶液滅活病毒；將滅活的病毒懸液于5000rpm離心30 分鐘去沉淀，上清液通過S^harose 4FF層析柱進行純化得狂犬病毒純化抗原；(2)膠體金標記SPA的方法分別取半徑為40nm的膠體金20ml及SPA50 μ g，在 PH6.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得 BSA最終質量濃度為5%，采用離心法除去未結合的SPA和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集 物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-SPA復合物；(3)將膠體金-SPA復合物噴涂于聚酯膜上用20ml聚乙二醇洗滌膠體金-SPA復 合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2ml濃度為2mmol/L，pH6. 0的硼 酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上，凍干；(4)免疫層析膜的包被檢測線包被的是狂犬病毒純化抗原，對照線包被的是抗 SPA純化抗體，每條線寬2mm ；(5)試劑板裝備用聚乙烯板作為支撐載體，上面依次粘上一層聚氯乙烯襯膜、玻 璃纖維組成樣品吸收區(qū)，再依次鋪上吸附了膠體金-SPA復合物的聚酯膜、硝酸纖維膜和吸 水濾紙，外面用膠帶包封制成。實施例2 除檢測線31包被量為10 μ g蛋白；對照線32包被的是抗SPA純化抗體，包被量為 g蛋白，金標探針合適SPA標記量為10 μ g/ml，膠體金標記SPA的方法分別取半徑為
5nm的膠體金20ml及SPA 200 μ g，在pH7. 0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血 清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得BSA最終質量濃度為0.1%，采用離心法除去未結合的 SPA和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-SPA復合物 外，其余與實施例1相同。實施例3
5
除檢測線31包被量為5 μ g蛋白；對照線32包被的是抗SPA純化抗體，包被量為 10 μ g蛋白，金標探針合適SPA標記量為5 μ g/ml，膠體金標記SPA的方法分別取半徑為 20nm的膠體金20ml及SPA 100 μ g，在pH7. 0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血 清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得BSA最終質量濃度為2.0%，采用離心法除去未結合的 SPA和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-SPA復合物 外，其余與實施例1相同。抗狂犬病毒IgG抗體快速檢測試劑板的使用方法檢測時，抽取被測者少量血清，滴在該試劑板上，對比檢測線和對照線的顏色，檢 測線出現(xiàn)紅色為陽性反應，如檢測線無此反應，即為陰性，表明血清中沒有狂犬病抗體或抗 體量不足，應及時加強免疫。對照線不管血清中有沒有狂犬病抗體均出現(xiàn)紅色的陽性反應， 表明試劑板有效，如對照線無反應，說明試劑板失效。
權利要求
抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板，試劑板水平面自下而上依次為樣品吸收區(qū)(1)、金標記蛋白A(SPA)區(qū)(2)、固相化抗原、抗體區(qū)(3)和吸水區(qū)(4)，樣品吸收區(qū)(1)鋪設的為在聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜(5)上鋪設玻璃纖維膜，且玻璃纖維膜上依次鋪設金標探針聚酯膜(7)和硝酸纖維素膜(6)；硝酸纖維素膜(6)上包被檢測線(31)和對照線(32)，其中檢測線(31)側貼有金標探針聚酯膜(7)，對照線(32)側貼有吸水濾紙(8)，其特征在于檢測線(31)包被的是狂犬病毒純化抗原，包被量為0.1 10μg蛋白；對照線(32)包被的是抗SPA純化抗體，包被量為0.1 10μg蛋白，金標探針合適SPA標記量為1 10μg/ml。
2.抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板的制備方法，其特征在于按以下步 驟進行(1)狂犬病毒純化抗原的制備將狂犬病毒懸液接種到已長成單層的Vero細胞上， 35°C培養(yǎng)5 6天后，每隔3天連續(xù)收取培養(yǎng)液上清液3次；將收集的病毒懸液濃縮40倍， 并加入體積濃度為1/3000的甲醛溶液滅活病毒；將滅活的病毒懸液于5000rpm離心30分 鐘去沉淀，上清液通過S^harose 4FF層析柱進行純化得狂犬病毒純化抗原；(2)膠體金標記SPA的方法分別取半徑為5-40nm的膠體金20ml及SPA50-200 μ g， 在pH6. 0-7.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血清白蛋白(BSA)作為穩(wěn)定劑，且 使得BSA最終質量濃度為0. 1_5%，采用離心法除去未結合的SPA和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及 其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-SPA復合物；(3)將膠體金-SPA復合物噴涂于聚酯膜上用20ml聚乙二醇洗滌膠體金-SPA復合物， 離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2ml濃度為2mmol/L，pH6. 0-8. 0的硼酸 緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上，凍干；(4)免疫層析膜的包被檢測線包被的是狂犬病毒純化抗原，對照線包被的是抗SPA純 化抗體，每條線寬2-5mm，狂犬病毒純化抗原合適包被量為0. 1_10 μ g蛋白，抗SPA純化抗體 合適包被量為0. I-IOyg蛋白；(5)試劑板裝備用聚乙烯板作為支撐載體，上面依次粘上一層聚氯乙烯襯膜、玻璃纖 維組成樣品吸收區(qū)，再依次鋪上吸附了膠體金-SPA復合物的聚酯膜、硝酸纖維膜和吸水濾 紙，外面用膠帶包封制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試劑板及制備方法，在聚乙烯板及聚氯乙烯襯膜上鋪設玻璃纖維紙以及硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上包被檢測線和對照線，檢測線側貼有金標探針聚酯膜，對照線側貼有吸水濾紙，其中檢測線是包被狂犬病毒純化抗原，對照線是包被抗SPA純化抗體。本發(fā)明的試劑板檢測快速，檢測準確率高、特異性強，攜帶方便，操作簡便，可供多種動物和人的狂犬病毒抗體檢測。檢測試劑板在常溫下即可保存，無需特殊的設備和儀器。保存期可達1年，且檢測重復性好。
文檔編號G01N33/569GK101930003SQ20101025726
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者劉漢平, 劉潔, 廖園園, 彭杏, 溫文生, 漆世華, 王威, 薛霜 申請人:武漢中博生物股份有限公司