專利名稱：人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測 試齊U盒。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患傳染病，其主要宿主為 犬、貓等動物。典型癥狀為恐水癥，又稱恐水病。本病極為兇險(xiǎn)，病死率幾乎為100%。隨 著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，寵物犬的數(shù)量在不但增加，犬的活動區(qū)域也在不斷 擴(kuò)大。從寵物醫(yī)療市場得到的信息，人們迫切希望了解寵物犬接種狂犬疫苗后犬只是否獲 得保護(hù)力，而目前狂犬病毒抗體的檢測工作因受檢測條件和費(fèi)用的限制，沒有得到廣泛的 應(yīng)用?？袢《臼强袢〉牟≡w，而我國又是狂犬病的高發(fā)國家，居世界第二位，僅次于 印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多數(shù)的人狂犬病是由與人類密切接觸的帶毒犬傳播 的，其危害已經(jīng)引起政府和人民的高度關(guān)注。目前，用于人狂犬病毒抗體檢測的方法和相應(yīng)的試劑盒，有一定的研究和報(bào)道，也 有一定的產(chǎn)品上市。但是現(xiàn)有檢測狂犬病毒抗體的方法包括普通ELISA方法、熒光免疫法、 放射免疫法及化學(xué)發(fā)光法等都存在相應(yīng)的弱點(diǎn)。普通ELISA試劑盒多用原核表達(dá)的重組蛋 白或培養(yǎng)的全病毒做包被抗原。重組蛋白存在復(fù)性困難，缺乏空間構(gòu)象表位的缺點(diǎn)，全病毒 存在不易純化的缺點(diǎn)，這些都會導(dǎo)致檢測靈敏度低下。熒光免疫法、放射免疫法及化學(xué)發(fā)光 法需要一定的實(shí)驗(yàn)儀器，且放射免疫法還存在放射性同位素污染的問題。而膠體金免疫層 析法雖然有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是靈敏度比較低。寧波天潤生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品“人狂犬 病病毒IgG抗體測定試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，國藥準(zhǔn)字20060008”采用的狂犬病毒全病毒抗 原包被微孔板。中國專利公開號為CN101251537的專利申請公開了一種人和動物狂犬病中 和抗體競爭ELISA檢測試劑盒。上述專利所用檢測板包被方法為抗原直接包被法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒，本發(fā)明采 用單克隆抗體包被法間接包被抗原制備反應(yīng)板，進(jìn)而組成用間接免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測犬抗狂 犬病毒IgG抗體的試劑盒，本試劑盒除了具有普通ELISA試劑盒的優(yōu)點(diǎn)外，還彌補(bǔ)了由于抗 原問題而致的靈敏度低的缺點(diǎn)，從而提高檢測的靈敏度和特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預(yù)包 被狂犬病毒抗原酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、 酶底物溶液和終止液，其特征在于酶標(biāo)板預(yù)先包被抗狂犬病毒單克隆抗體，包被緩沖液 0. 05M ρΗ9· 6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔 0. I-Iug ；封閉液為質(zhì)量濃度是1-10%的BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被狂犬病毒純化抗 原，包被量為每孔0. Ι-lug;樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有
3質(zhì)量濃度0. 01-0. 05% NaN3的0. Olmol/L及pH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；酶結(jié)合物為 辣根過氧化物酶_小鼠抗人IgG單抗酶結(jié)合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0. 05%吐溫-20 的0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液，酶底 物B溶液為雙氧水溶液；終止液為lmol/L H2SO4溶液，陽性對照、陰性對照放置在盒內(nèi)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的是小鼠抗人IgG單克隆抗體。人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其步驟是(1)抗狂犬 病毒單克隆抗體的制備用純化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟 細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用 ELISA方法和IFA(間接免疫熒光)方法鑒定抗狂犬病毒的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行三次亞克隆 化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗狂犬病毒的單克隆抗 體；(2) HRP-小鼠抗人IgG酶結(jié)合物的制備按常規(guī)方法提取純化人IgG ；免疫BALB/c小 鼠，得到抗原刺激的脾臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，利用HAT選擇性培 養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用ELISA方法鑒定抗人IgG的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行三次亞克隆化后得 到分泌高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗人IgG的單克隆抗體；用改 良的過碘酸氧化法進(jìn)行標(biāo)記；最后酶標(biāo)記物加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白 和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存?zhèn)溆茫?3)上述各種溶液的配制①樣品稀 釋液0. 1-10% BSA,0. 01-0. 05% NaN3 的 0. 01mol/L,pH7. 2-7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)；② 洗滌液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3，-5， 5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液i)底物A液稱取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO) 中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL 純化水，用乙酸調(diào)PH值為5. 0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度 為95-98%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增，經(jīng)凍融，超聲波 破碎、差速離心提取和S印harose 4FF柱過濾純化，-20°C保存，作為包被用狂犬病毒用抗 原。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.特異性檢測用本發(fā)明制造的試劑盒分別檢測人狂犬病毒免疫血清，人陰性血 清，人乙腦疫苗免疫血清，操作和判定按照具體實(shí)施方式
中人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA 檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行，結(jié)果顯示，人狂犬病毒免疫血清檢測為陽性，其他樣品檢測為 陰性，特異性為100%。2.靈敏度檢測用本發(fā)明制造的試劑盒檢測不同稀釋度的陽性參考血清，操作和 判定按照具體實(shí)施方式
中人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行，檢 測結(jié)果為最高檢測到陽性參考樣品的稀釋度為1 640。
圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式一 .人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法
4
1.狂犬病毒單克隆抗體的制備用純化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗 原刺激的脾臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選 雜交瘤細(xì)胞，用ELISA方法和IFA方法鑒定抗狂犬病毒的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行三次亞克隆 化后得到分泌高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗狂犬病毒的單克隆抗 體；2. HRP-小鼠抗人IgG酶結(jié)合物的制備按常規(guī)方法提取純化人IgG ；免疫BALB/c 小鼠，得到抗原刺激的脾臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，利用HAT選擇性 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用ELISA方法鑒定抗人IgG的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行三次亞克隆化后 得到分泌高特異性的單克隆抗體的細(xì)胞株，通過小鼠腹水生產(chǎn)抗人IgG的單克隆抗體；用 改良的過碘酸氧化法進(jìn)行標(biāo)記；最后酶標(biāo)記物加入牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的 中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存?zhèn)溆茫?.所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增，經(jīng)凍融，超聲 波破碎、差速離心提取和S印harose 4FF柱過濾純化，-20°C保存，作為包被用狂犬病毒用 抗原；4.將狂犬病毒單克隆抗體均勻的包被在酶標(biāo)板孔上，包被緩沖液為0.05M pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔0. I-Iug ；封 閉液為BSA或脫脂牛奶，濃度是1-10% ；封閉完再包被的是狂犬病毒純化抗原，包被量為每 孔0.I-Iug ；5.試劑盒其他溶液配制①樣品稀釋液BSA，0.05% NaN3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)；②洗滌液在IOOOml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐 溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液i)底物A液稱取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮 液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL純化水，用乙酸調(diào)PH值為5.0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度為95%濃硫酸加蒸餾水至IOOOml即可。二 .人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的操作步驟1.將待檢樣本用樣本稀釋液10倍稀釋，每孔加lOOul，同時(shí)加入陽性和陰性對照 液，設(shè)空白對照。置37°C孵育1小時(shí)，洗滌液洗板5次，甩干，每孔加酶標(biāo)抗體100ul，37°C 孵育1小時(shí)；洗滌液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光顯色5-10分鐘，加 入終止液，每孔50 μ 1。利用酶標(biāo)儀在450nm測定光吸收值A(chǔ)450nm.2.結(jié)果判定Cutoff (C0值)=陰性對照光吸收值A(chǔ)450nmX2. 1倍，樣品值=樣品 光吸收值A(chǔ)450nm/C0值，樣品值大于1判為陽性；樣品值小于1判為陰性。
權(quán)利要求
一種人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預(yù)包被狂犬病毒抗原酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，其特征在于酶標(biāo)板預(yù)先包被抗狂犬病毒單克隆抗體，包被緩沖液0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，包被量為每孔0.1 1ug；封閉液為質(zhì)量濃度是1 10％的BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被狂犬病毒純化抗原，包被量為每孔0.1 1ug；樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度0.1 10％牛血清白蛋白BSA和含有質(zhì)量濃度0.01 0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶 小鼠抗人IgG單抗酶結(jié)合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0.05％吐溫 20的0.01mol/L及pH7.2 7.4的PBS；酶底物A溶液為3，3’ 5，5’ 四甲基聯(lián)苯胺溶液，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為1mol/L H2SO4溶液，陽性對照、陰性對照放置在盒內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于所 述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增，經(jīng)凍融，超聲波破碎、差速離 心提取和S印harose 4FF柱過濾純化，_20°C保存，作為包被用狂犬病毒用抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及人用抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒，酶標(biāo)板預(yù)先包被抗狂犬病毒單克隆抗體，包被緩沖液0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，包被量為每孔0.1-1ug；封閉液為質(zhì)量濃度是1-10％的BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被狂犬病毒純化抗原，包被量為每孔0.1-1ug；樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有質(zhì)量濃度0.01-0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-小鼠抗人IgG酶結(jié)合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0.05％吐溫-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為1mol/L H2SO4溶液，陽性對照、陰性對照放置在盒內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的特異性達(dá)100％；靈敏度為1∶640。本試劑盒用于人接種狂犬疫苗后的免疫效果評價(jià)。
文檔編號G01N33/535GK101936997SQ20101025726
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者劉漢平, 劉潔, 廖園園, 彭杏, 溫文生, 漆世華, 王威, 謝紅玲 申請人:武漢中博生物股份有限公司