專利名稱：一種分子生物傳感器及其對dna或蛋白質進行單分子檢測的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速高靈敏分子生物傳感器及其對DNA或蛋白質進行直接、實時單分子檢測的方法。
背景技術：
建立一種在單分子水平上直接進行生物和化學活性檢測的實用平臺是工業和科研領域共同關注的目標之一，因為這對于環境監測、工業質量控制以及臨床診斷等一系列的應用都具有重要意義。為了能夠可信地檢測DNA-蛋白質的相互作用，目前已經發展了多種直接以及標記的技術如酶聯免疫吸附試驗、表面等離子共振、電化學、掃描探針顯微鏡、納米粒子、微懸臂梁、碳納米管、阻抗、納米線等。但是很多現有的方法難以進行實時檢測或者動力學的分析，一些方法面臨很高的技術要求，一些則缺乏高的靈敏度以及選擇性。因此需要進行策略優化，設計并且建立一種對于單個結合事件能夠進行快速實時檢測，同時兼具靈敏度、選擇性、可逆性特征的方法體系。(l:Sander，C. et al. Science, 2000，287，1977. 2 :Liu，J.，Cao, Ζ.，Lu, Y. Chem. Rev.，2009，109，1948. 3 =Drummond, Τ. G.， Hill, Μ. G. ， Barton, J. K. Nat. Biotechnol. ,2003,21,1192. 4 =Patolsky, F. ， Zheng, G.， Lieber, C. Μ. Nat. Protoc. , 2006,1,1711. 5 :Fang, X. H. , Tan, W. H. Accounts of Chemical Research,2010,43,48. 6 :Nam, J. -Μ. , Thaxton, C.S., Mirkin, C.A. Science,2003,301, 1884. 7 Zheng, G. ,Patolsky,F. ，Cui，Y. , Wang, W. U. , Lieber, C. M. Nat. Biotechnol. 2005, 23，1294.)。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速高靈敏基于核酸適體的分子生物傳感器及其制備方法。本發明所提供的基于核酸適體的分子生物傳感器，包括a)至少一個單壁碳納米管晶體管器件，每個所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、源極、漏極和導電溝道；所述導電溝道為單壁碳納米管，所述源極和漏極位于所述單壁碳納米管上；其中，所述單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為I-IOnm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管的兩端連接；所述核酸適體能夠特異性識別待測分子。其中，所述柵極為含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的硅基底，其電阻率為 5-20ohm · cnf1 ；所述源極和漏極均由Cr電極層和設于所述Cr電極層上的Au電極層組成， 所述Cr電極層厚度為3-lOnm，所述Au電極層厚度為40-100nm ；所述源極和漏極之間的距離為5-30 μ m ；所述單壁碳納米管的直徑為l-3nm。上述單壁碳納米管晶體管器件既可以是底柵結構也可以是頂柵結構，但是由于底CN 102375007 A
說明書
2/10 頁 柵結構的制備工藝相對簡單方便優先選用。制備上述基于核酸適體的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)構建單壁碳納米管晶體管器件；2)對步驟1)得到的單壁碳納米管晶體管器件中的單壁碳納米管依次進行電子束刻蝕、氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；3)將步驟2、得到的具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進行活化，然后將經活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的核酸適體在PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。上述步驟1)中單壁碳納米管晶體管器件可按照常規方法進行構建，具體方法如下在含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的高導性硅芯片(基底電阻率為5-20ohm ·cnT1) 基底表面，采用化學氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，得到的單壁碳納米管的長度為 30-10000 μ m ；在所述單壁碳納米管陣列上間隔5-30 μ m蒸鍍漏極和源極；所述漏極和源極的制備方法為在單壁碳納米管上依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層、厚度為40-100nm 的Au電極層。步驟幻中對具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS，EDCI)的IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8-12小時；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES緩沖溶液中 Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的濃度為5-15mM，EDCI (1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)的濃度為3-10mM;步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH 值為6-8。步驟2)中電子束刻蝕和氧化切割得到的納米間隙(I-IOnm)由于太小以至于不能通過SEM進行表征，但是能夠使用AFM進行直接、局域的成像表征。對本發明制備的基于核酸適體的生物傳感器進行電學信號監測，結果表明碳納米管的最初的半導體或者金屬的性質在連接核酸適體后得以保留。另外，可將上述基于核酸適體的生物傳感器在不同的緩沖溶液中進行處理，然后進行電學性質監測，排除連接過程中離子參與導電的干擾。本發明還提供了上述基于核酸適體的生物傳感器在檢測DNA或蛋白質中的應用。利用基于核酸適體的生物傳感器對DNA或蛋白質進行單分子檢測的方法如下1)對本發明制備的基于核酸適體的生物傳感器進行DNA或蛋白質結合與識別的電學信號檢測，同時進行對照實驗設計排除干擾因素；2)對本發明制備的基于核酸適體的生物傳感器進行DNA或蛋白質檢測的選擇性、 靈敏度以及可逆性的測試；3)根據步驟1)和幻的實驗結果確定檢測條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實現生物相互作用的實時檢測。上述1)- 各步驟的確定均使用探針臺對于器件的電學信號進行監測，在常溫常壓下測量數據結果。當用本發明的生物傳感器檢測Thrombin時，所用的核酸適體為 H2N- (CH2) 6-5 ‘ -TTTTTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' -(CH2)6-NH2GSSApt-A, 其核苷酸序列如序列1所示)。
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當用本發明的生物傳感器檢測免疫球蛋白E(IgE)時，所用的核酸適體為H2N_(CH 2) 6-5 ‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-B,其核苷酸序列如序列3所示)。當用本發明的生物傳感器檢測血管內皮生長因子(VEGF)時，所用的核算適體為吐 N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCAGUUUGAGAAGUCGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列 4 所示)在上述檢測方法中，步驟1)是該方法的關鍵步驟，具體的結合過程是將待測的 DNA或蛋白質的溶液的液滴覆蓋在所述生物傳感器表面10-60min，為達到器件最大的響應性質，溶液需確定在最佳的PH值，核酸適體-蛋白質發生相互作用之后，用緩沖溶液(可以是PBS緩沖溶液或者Tris-HCl的溶液)沖洗干凈，氮氣吹干后進行電學信號的測量，通過電信號的變化實現對DNA或蛋白質的檢測。對器件的電學信號進行監測后，能夠觀察到器件導電性質明顯增強，為驗證實驗結果的可信性，對不同的連接器件在相同實驗條件下進行重復性實驗，結果表明上述實驗現象具有一致性特征。步驟1)中觀察到的導電性的明顯變化來源于共價連接在電路中的局域化的單個 DNA或RNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變或表面的非特異性吸附過程。為排除潛在的假相，本發明在相同的處理條件下進行了兩種類型的對照實驗。在第一類對照實驗中發明人對原生的碳管按照上述結合過程(即按照具有納米間隙的單壁碳納米管與核酸適體的結合過程)在相同條件下進行處理，進行電學性質的測量。經過蛋白質處理的結合過程之后，所有的SWNT器件都顯示出電阻輕微增加的趨勢，與之前文獻報道的在未經切割的、表面功能化修飾DNA分子的SWNT的器件表面吸附蛋白質分子將引起器件電流減弱的現象一致。該現象與上述基于核酸適體的生物傳感器觀察的實驗結果相反。第二類的對照實驗中，發明人對于在氧氣等離子體處理階段沒有完全切斷的部分切割的SWNT器件進行了相同的處理，依然觀察到的是與第一類對照實驗類似但與所述基于核酸適體生物傳感器變化趨勢相反的電流變化結果。步驟2)為驗證基于核酸適體的生物傳感器的選擇性，發明人設計了 2類重要的結合實驗。其一是對于功能化的器件實施相同的實驗處理，但是用另外一種非特異性結合的蛋白質取代特異性結合的蛋白質，處理過程導致器件電阻明顯增加，待除去非特異性結合的蛋白質之后，用特異性結合的蛋白質進一步處理器件會觀察到與工作器件電阻減小相同的現象，這可以很好的驗證該方法具有很好的選擇性。其二是將連接對照DNA分子的器件用于蛋白質相互作用的檢測，對照DNA與待檢測的蛋白質不存在相互作用，未發生工作器件的電阻變化，而是顯示出類似SWNT表面非特異性吸附蛋白質引起電阻增加的結果。步驟幻中是通過改變蛋白質的濃度來研究連接器件的靈敏度。多個基于核酸適體的生物傳感器用來檢測不同濃度的蛋白質。在蛋白質溶液處理前后，通過電學測量的I-V 曲線監測結合過程，在不同的檢測濃度下可以得到不同器件之間一致的實驗結果，再次證明本發明具有好的可信性與重現性。使用本發明基于核酸適體的生物傳感器進行的單分子器件的生物檢測與之前檢測蛋白質的方法相比，具有更高的檢測靈敏度，目前使用aptamer 和Thrombin的模型體系的檢測靈敏度已經達到2. 6aM。而其他方法的檢測限分別是酶聯免疫吸附試驗( 3pg/mL)，表面等離子共振( 10-100pg/mL)、微懸臂梁( 0. 2ng/mL)、 碳納米管( IpM)、納米線陣列( 0. 9pg/mL)等。最近有文獻報道(Nam,J. -Μ. ,Thaxton,C. S.，Mirkin, C. A. Science, 2003, 301,1884.)使用磁性和金納米粒子得到蛋白質的檢測靈敏度30aM與本發明生物傳感器靈敏度結果相近，但是該方法需要標記以及多步的化學以及生物處理。由于本發明提供的生物傳感器中只含有1個至多2個的蛋白質結合位點， 本發明具有檢測DNA-蛋白質相互作用的單分子靈敏度(具體見實例一所述)。步驟2、中選擇性和靈敏度檢測方法建立之后，本發明將研究器件響應的可逆性。 可逆性的實驗可以根據DNA(或RNA)-蛋白質相互作用的作用力的類型以及作用力的大小選擇最佳的測試方法和條件，如蛋白質溶液的PH值等因素。連接器件在蛋白質作用之后經過處理可以回到初始狀態，實現多次可逆的循環檢測。以上各步驟的實驗結果為實時的生物檢測奠定了實驗基礎。步驟3)中的實時檢測是本發明的核心之處。為了能夠更方便的進行實時檢測操作，本發明還提供了一種結合微流控技術制備 SffNT晶體管生物傳感器陣列的方法。該方法是將上述生物傳感器制備成SWNT晶體管生物傳感器陣列并引入微流道組件得到的。具體制備方法如下通過兩次光刻的方法發明人設計并制備了含有若干個(對陣列的個數沒有具體要求，為保證成功率，優選至少50個)單獨的SWNT晶體管的重復模型 (以制備79個單獨的SWNT晶體管為例，見圖5a)。該方法需要生長高密度的、電學性質良好的超長SWNT陣列。第一步光刻是在含有SWNT陣列的硅基底上形成毫米尺寸的電極圖形，顯影后蒸鍍金屬電極(Cr/Au電極層)。為了消除肖特基勢壘改變以及蛋白質在金屬電極表面的非特異性結合的可能性，通過電子束熱蒸鍍的方法在金屬電極表面沉積50-100nm 的二氧化硅鈍化電極。緊接著使用第二次的光刻保護SWNTs器件的中心區域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去(見圖5b)。制得的器件可以通過SEM的手段進行表征，圖如顯示的是一根碳管完全穿過電極的SEM照片，按照之前所述的單分子器件的制備步驟(步驟 2)和步驟幻，能夠在每片的79個單獨的SWNT晶體管中平均得到2個工作器件。結合微流控技術，便可以實時檢測DNA-蛋白質的相互作用，圖5c是本發明大量制備的器件的照片， 5d顯示的是微流控測試過程中PDMS覆蓋在中心電極的微流溝道示意圖。實時檢測的操作過程中，根據步驟2)的實驗結果選擇合適的測量條件，首先使用緩沖溶液對器件進行穩定，然后向上述微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列中注入待檢測的蛋白質溶液。在實時檢測過程中，器件在不同濃度蛋白質溶液的刺激下可以實現良好的電流變化的可逆性，同時使用對照蛋白質進行刺激未觀察到電流的明顯變化；對照DNA分子鏈的連接器件在實時測量的條件下當待測蛋白質溶液通過時，電流波動可以忽略。值得強調的一點是，同一器件在不同濃度蛋白質溶液通過時表現出的可逆的電流變化的數值幾乎一致，使該發明有別于之前關于碳管和納米線在檢測蛋白質時觀察到的變化范圍與濃度有依賴關系的研究報道，成為一種獨特的研究平臺方法。實時檢測中缺乏濃度依賴性的事實證明這些器件是在單分子水平上進行的DNA-蛋白質相互作用的檢測。本發明是將分子電子學與生物體系相結合，利用功能化的單分子器件通過電學信號測量實現對DNA或者蛋白質的活性進行直接的、實時的、具有專一選擇性與超高靈敏度檢測的可靠、實用的普適性方法。由于本方明技術上的獨特之處，必將擁有廣闊的應用前景。可以根據特定目的可控地進行單分子連接與功能化，在單分子水平上實現特定的生物活性。這些性質有助于本發明提供的基于核酸適體的生物傳感器從事于臨床中生物活體組織的問題研究以及檢測環境中痕量的特定化學或者生物有害物質。由于單分子器件的可靠性與重現性，可以在硅基底上將不同的器件集成，與目前的CMOS技術具有良好的相容性， 可以構建對藥物開發或者其他檢測適用的低噪聲、靈活性強的實時檢測陣列。這種快速響應、穩定、直接、靈活、同時具有超高靈敏度與選擇性的響應器件的制備，證明本發明可以成為從基因組學到蛋白質組學中獲取信息的有力工具，成為發展更加準確的分子水平上臨床及時診斷護理的新技術。本發明所提供的直接的、實時的單分子器件生物檢測普適性方法具有以下優點1、本發明只需將DNA分子(或RNA分子)連接在碳納米管的分子點電極之間得到功能化的單分子器件即可進行生物體系中相互作用的測量，在合適的條件下達到優良的檢測結果，無需進行再次標記，是一種直接的測量手段；2、本發明使用的功能化單分子器件具有很好的穩定性，在檢測DNA(或RNA)-蛋白質相互作用的過程中能夠快速響應，通過電學信號的特征顯示生物體系的識別與結合作用；3、本發明的檢測方法利用的是功能化器件中的單分子位點進行相互作用的識別， 具有單分子水平檢測的特征，因此與目前現有的方法相比，具有更高的檢測靈敏度和選擇性特征，控制合適的結合條件，可以實現器件的可逆性檢測；4、本發明提供了一種利用單分子器件能夠實時檢測生物體系相互作用的方法，利用實際樣品的檢測，拓展了其應用領域，可以在液相條件下對樣品進行檢測，保持樣品天然活性，加快了實際應用的步伐；5、本發明是一種普適性的方法，可以根據特定的目的構建功能化的單分子器件， 在適宜的條件下進行直接、實時、超高靈敏度與選擇性的測量，可以用于環境監測、工業控制、臨場診斷等不同的實際領域。
圖1為本發明以aptamer-Thrombin體系為模型的器件檢測示意圖以及器件結構表征以及實施例1中各步驟的電學性質。圖2為實施例1中單分子器件檢測的性質圖，包括選擇性、靈敏度以及可逆性實驗結果以及傳輸機制。圖3為實施例1中連接Con-A的單分子器件的對照實驗示意圖。圖4為實施例1進行實時檢測時的器件結構表征以及實時檢測結果。圖5為實施例1中實時檢測的器件設計以及各步驟的光學顯微鏡照片。圖6為實施例2和實施例3中結合過程的電學性質圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明， 均可從商業途徑獲得。實施例中所涉及的DNA或RNA序列均由寶生物工程(大連)有限公司按照序列進行合成構建得到。實施例一單分子aptamer器件檢測Thrombin的應用
1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導性硅芯片基底上(電阻率為 5-20ohm · cnT1)，使用化學氣相沉積的方法生長高質量的超長的碳納米管陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000 μ m)上間隔約20微米依次蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進行超精細的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙，圖1中b圖顯示的是器件的SEM以及AFM圖片，圖中碳管的直徑 1. 2nm，納米間隙的大小是 IOnm ；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時，進行末端羧基活化；然后將經活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到連接aptamer的單分子器件。設計并使用了 2種不同的DNA單分子鏈，其序列如下DH2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (記為Apt-A，其核苷酸序列如序列1所示)，2) H2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TCC AM CCA ACC ACC ATT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (記為Con-A，其核苷酸序列如序列2所示)。其中Apt-A是一種中間含有15個堿基，在3'和5'進行T7修飾，與人的 α -thrombin作用時可以形成G4結構的單分子鏈；Con-A是中間含有15個堿基兩端經過T7 修飾，不和α -thrombin有相互作用的對照單分子鏈。對Apt-A連接得到的器件在不同的緩沖溶液(PBS緩沖溶液pH 7. 2 ；Tris-HCl溶液，pH 8.3)中進行電學信號測量，均沒有明顯的變化，排除離子導電的影響；Apt-A本身可以形成G4結構，金屬離子K+和Mg2+可以在室溫下穩定其構象，由于用于連接反應的PBS溶液中含有12mM的K+，推測連接后G4結構已經形成，分別使用20mM的K+和Mg2+處理連接器件，未觀察到明顯變化，證實了推測的合理性。考慮到Apt-A形成G4后的大小( 2.8nm) 以及碳管的直徑(< 3nm)，在連接器件中至多只含有1個的DNA分子。2、單分子aptamer器件檢測Hirombin的應用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質Thrombin結合與識別的電學信號檢測，在最適宜的結合條件PH 8. 3下，器件經過^OnM Thrombin的處理，電阻發生了一個數量級的明顯減小，從 300ΜΩ降至 30ΜΩ的水平。圖1中的Ic顯示的是上述器件在各狀態下的電學性質曲線，所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢。同時進行的對照實驗結果證明了觀察到的導電性的明顯變化來源于共價連接在電路中的局域化的單個DNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程；2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試。器件選擇性的測試其一是使用和Thrombin的等電點以及分子量類似的另一種絲氨酸蛋白質Elastase處理器件，觀察到與非特異性表面吸附情形類似的器件電阻明顯增加的現象，待除去Elastase之后，用Thrombin進一步處理器件則觀察到相反的現象，圖2中的a圖顯示的是這一過程的電學測量結果。器件選擇性的測試其二是將連接對照DNA分子Con-A的器件用于Thrombin的檢測，結果顯示類似SWNT表面非特異性吸附的影響，如圖3所示。根據Apt-A與Thrombin結合過程中的電流變化，推測在結合過程中，不僅不會破壞G4構象，反而使構象固定更加穩定，增強η電子的堆積，提高DNA分子的電荷傳輸。另一種可能則是G4構象中間穩定的鳥嘌呤為電荷傳輸提供了一條新的通道，但目前的實驗結果不能區分這兩種結果的影響，可能是兩者的結合。圖2中的b圖顯示的是這兩種機制的示意圖。對不同的DNA單分子器件使用一系列不同濃度的Thrombin進行處理(2. 6nM, 2. 6pM, 2. 6fM以及2. 6aM在Tris-HCl PH = 8. 3溶液中)，均顯示出良好的重現性，在該體系下，本發明的檢測靈敏度是2. 6aM。圖 2的c-f顯示的是這一過程的測量結果。經過多次嘗試，發明人在pH 8. 3的條件下通過6M 鹽酸胍對于結合后的器件進行處理，實現了器件的可逆性測量，得到了多次的循環測量結果，如圖2的g和h所示。3)根據以上步驟的實驗結果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實現生物相互作用的實時檢測。制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列具體制備方法如下1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導性硅芯片基底上，使用化學氣相沉積的方法生長高質量的超長的單壁碳納米管(SWNT)的陣列；2)在含SWNT陣列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且電極之間依次間隔為20 μ m的電極圖形，顯影之后蒸鍍金屬電極(Cr/Au電極層)。為了消除肖特基勢壘改變以及蛋白質在金屬電極表面的非特異性結合的可能性，通過電子束熱蒸鍍的方法在金屬電極表面沉積 50-100nm的二氧化硅鈍化電極。3)緊接著使用第二次的光刻保護SWNTs器件的中心區域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去(見圖5b)。制得的器件可以通過SEM的手段進行表征，圖如顯示的是一根碳管完全穿過電極的SEM照片。4)將步驟3)得到的SWNT器件陣列進行超精細的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙。5)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時，進行末端羧基活化；然后將經活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer (Apt-A)在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到連接aptamer的單分子器件陣列。在每片硅基底上的79 個單獨的SWNT晶體管中平均得到2個工作器件。在上述單分子器件陣列中引入微流控組件，即得到微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列。結合微流控技術，便可以實時檢測DNA-蛋白質的相互作用，圖5c是本發明大量制備的器件的照片，5d顯示的是微流控測試過程中 PDMS覆蓋在中心電極的微流溝道示意圖。實時檢測時，首先用緩沖溶液(Tris-HCl的溶液)對微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列器件進行穩定，在pH 8. 3的條件下，通過微流道組件的入口注入Thrombin溶液，對不同濃度的Thrombin (從2. 6fM到2. 6pM到2. 6nM)實時測量，得到良好的可逆的電流變化結果。進一步使用Elastase (3. 4nM)處理該器件，未見明顯的電流變化，實驗結果中電流變化缺乏濃度依賴性的事實證明這些器件是在單分子水平上進行的DNA-蛋白質相互作用的檢測。不同濃度下電流變化的微小差異可能源于隨著蛋白質濃度增加帶來的碳管表面的非特異性結合的增強以及/或者實時測量過程中器件性質的衰減。實時檢測部分的結果在圖 4b、c的各圖中顯示。實施例2、單分子aptamer器件檢測免疫球蛋白E(IgE)的應用免疫球蛋白E是一類具有δ鏈的親同種細胞抗體，是參與過敏性鼻炎、過敏性哮喘和濕疹等發病機制調節的主要抗體。對于IgE檢測對研究過敏性疾病具有重要的意義。1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導性硅芯片基底上，使用化學氣相沉積的方法生長高質量的超長的碳納米管陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000微米) 上間隔約20微米先后蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進行超精細的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時，進行末端羧基活化；然后將經活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到連接aptamer的單分子器件。設計并使用的核酸適體的序列如下H2N-(CH2) 6-5‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3‘ - (CH2) 6 -NH2(Apt-B，其核苷酸序列如序列3所示)。其中Apt-B是一種能夠與免疫球蛋白E發生相互作用的核酸適體，在3'和5'進行氨基修飾。2、單分子aptamer器件檢測免疫球蛋白E(IgE)的應用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質IgE結合與識別的電學信號檢測，在最適宜的結合條件PH 7.4下，器件經過160碰IgE的處理，電阻發生了明顯減小。 所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢，如圖6a所示。同時進行的對照實驗結果證明了觀察到的導電性的明顯變化來源于共價連接在電路中的局域化的單個DNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程。2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試。器件選擇性的測試是使用與連接的核酸適體無相互作用的牛血清蛋白 (BSA)，實驗結果顯示的是與非特異性表面吸附類似的器件電阻明顯增加的現象，待除去 BSA之后，用IgE進一步處理器件則觀察到相反的現象。對不同的DNA單分子器件使用一系列不同濃度的IgE進行處理QnM，2pM以及2fM在PBS pH = 7. 4溶液中)，均顯示出良好的重現性。經過多次嘗試，發明人在PH 7. 4的條件下通過6M鹽酸胍對于結合后的器件進行處理，也可以實現如實施例1中所示的器件的可逆性測量。3)根據以上步驟的實驗結果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實現生物相互作用的實時檢測。
制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列的方法同實施例1，只需將核酸適體 Apt-A 替換為 Apt-B。實時檢測時，首先用緩沖溶液對器件進行穩定，在pH 7.4的條件下，使用不同濃度的IgE(從2fM到2pM到2nM)實時測量，得到良好的可逆的電流變化結果。進一步使用 BSA(3nM)處理該器件，未見明顯的電流變化，實驗事實證明這些器件是在單分子水平上進行的DNA-蛋白質相互作用的檢測。實施例3、單分子aptamer器件檢測血管內皮生長因子(VEGF)的應用血管內皮生長因子是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生，在腫瘤生長擴散過程中會直接影響VEGF的體內含量，對于VEGF的檢測可以應用于癌癥的診斷與治療。1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導性硅芯片基底上，使用化學氣相沉積的方法生長高質量的超長的碳納米管的陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000微米)上間隔約20微米先后蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進行超精細的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙，圖1中b圖顯示的是器件的SEM以及AFM圖片，圖中碳管的直徑 1. 2nm，納米間隙的大小是 IOnm ；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時，進行氨基活化；然后將經氨基活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的RNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到連接aptamer的單分子器件。設計并使用的核酸適體的序列如下H2N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCA⑶UUGAGAA⑶CGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列4所示)。其中Apt-C是一種能夠與血管內皮生長因子發生相互作用的核酸適體， 在3'和5'進行氨基修飾。2、單分子aptamer器件檢測血管內皮生長因子(VEGF)的應用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質VEGF結合與識別的電學信號檢測，在最適宜的結合條件PH 7.4下，器件經過104碰VEGF的處理，電阻發生了明顯減小。所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢，如圖6b所示。同時進行的對照實驗結果證明了觀察到的導電性的明顯變化來源于共價連接在電路中的局域化的單個RNA探針分子， 而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程。2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進行蛋白質檢測的靈敏度測試。對不同的RNA單分子器件使用一系列不同濃度的VEGF進行處理(1. 04nM, 104pM以及1. 04fM在 PBS pH = 7. 4溶液中)，均顯示出良好的重現性。3)根據以上步驟的實驗結果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實現生物相互作用的實時檢測。制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列的方法同實施例1，只需將核酸適體
12Apt-A替換為Apt-C。實時檢測時，首先用緩沖溶液對器件進行穩定，在pH 7. 4的條件下， 使用2nM的VEGF進行實時測量，可以觀察到器件明顯的電流增加的變化趨勢。
綜上所述，本發明是一種實時的、直接的、具有良好選擇性與單分子靈敏度的，能夠可逆檢測DNA-蛋白質相互作用的普適性方法，利用功能化的單分子器件可以根據特定檢測目的，對實際樣品進行不同體系、專一的選擇性與超高靈敏度的實時檢測具有廣闊的實際應用價值。本發明所舉實例不能概括生物體系中眾多的相互作用，但是使用本發明所述的方法，經過合理的分子設計與修飾，均可在單分子器件上實現高靈敏度、高選擇性的檢測。值得一提的是，本發明在檢測兩種相互作用的物質基礎上，還可以繼續引入與第二種物質相互作用的其他物質，實現第三種物質的實時檢測，如DNA-蛋白質-蛋白質體系(如 DNA-抗體-抗原)和DNA-蛋白質-小分子體系(如DNA-鏈霉親和素-生物素)等。除了可用于蛋白質的檢測，本發明還可以應用于檢測和連接的單分子DNA有相互作用的DNA或者小分子。鑒于本發明廣泛的普適性與應用性同時結合微流控的實時檢測技術，使得本發明具有廣闊的研究與應用的價值和意義。
權利要求
1.一種基于核酸適體的生物傳感器，包括a)至少一個單壁碳納米管晶體管器件，每個所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、 源極、漏極和導電溝道；所述導電溝道為單壁碳納米管，所述源極和漏極位于所述單壁碳納米管上；其中，所述單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為I-IOnm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管的兩端連接；所述核酸適體能夠特異性識別待測分子。
2.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于所述柵極為含有厚度為 IOO-IOOOnm二氧化硅層的硅基底，其電阻率為δΙΟοΙιπ ΜπΓ1 ；所述源極和漏極均由Cr電極層和設于所述Cr電極層上的Au電極層組成，所述Cr電極層厚度為3-lOnm，所述Au電極層厚度為40-100nm ；所述源極和漏極之間的距離為5_30 μ m ；所述單壁碳納米管的直徑為 l-3nm。
3.根據權利要求1或2所述的生物傳感器，其特征在于所述基于核酸適體的生物傳感器包括至少50個所述單壁碳納米管晶體管器件；所述基于核酸適體的生物傳感器還包括微流道組件，所述微流道組件至少包括樣品進口和樣品出口的相互連通的分流式微流道。
4.制備權利要求1所述的基于核酸適體的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)構建單壁碳納米管晶體管器件；2)對步驟1)得到的單壁碳納米管晶體管器件中的單壁碳納米管依次進行電子束刻蝕和氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到長度為I-IOnm的間隙；3)將步驟幻得到的具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進行活化，然后將活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的核酸適體在磷酸鹽緩沖液中進行納米間隙中的單分子共價連接，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟3)中對具有間隙的單壁碳納米管末端羧基進行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有Sulfo-NHS和EDCI的 IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8_12小時；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES緩沖溶液中Sulfo-NHS的濃度為5-15mM，EDCI的濃度為3_10mM ；步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH值為6_8。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟1)中構建單壁碳納米管晶體管器件的方法為在含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的硅片表面，采用化學氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，所述硅芯片電阻率為5-20ohm · cnT1，所述單壁碳納米管的長度為 30-10000 μ m ；在所述單壁碳納米管陣列上間隔5-30 μ m蒸鍍漏極和源極；所述漏極和源極的制備方法為在單壁碳納米管上依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層、厚度為40-100nm 的Au電極層。
7.制備權利要求3所述的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)在含有厚度為IOO-IOOOnm二氧化硅層的硅片表面，采用化學氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，所述硅片電阻率為5-20ohm · cnT1 ；2)在步驟1)制備的含單壁碳納米管陣列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且電極之間依次間隔為5-30 μ m的電極圖形，顯影后依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層和厚度為40-100nm的Au電極層；再通過電子束熱蒸鍍的方法在Au電極表面沉積50-100nm的二氧化硅鈍化電極；3)采用光刻法保護步驟幻得到的器件的中心區域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去，得到單壁碳納米管晶體管陣列器件；4)對步驟幻得到的單壁碳納米管晶體管陣列器件中的單壁碳納米管依次進行電子束刻蝕和氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；5)將步驟4)得到的具有納米間隙的單壁碳納米管進行氨基活化，然后將經氨基活化的單壁碳納米管與經末端氨基修飾的核酸適體在PBS緩沖液中進行納米間隙中的單分子共價連接，然后引入微流道組件，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟5)中對具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有Sulfo-NHS和EDCI 的IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8_12小時；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES 緩沖溶液中Sulfo-NHS的濃度為5-15mM，EDCI的濃度為3_10mM ；步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH值為6_8。
9.權利要求1-3中任一所述的生物傳感器在對DNA或蛋白質進行單分子檢測中的應用。
10.一種對DNA或蛋白質進行單分子檢測的方法，包括下述步驟1)對權利要求1或2所述基于核酸適體的生物傳感器進行DNA或蛋白質結合與識別的電學信號檢測，確定檢測的PH值；2)對權利要求1或2所述基于核酸適體的生物傳感器進行DNA或蛋白質檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試；3)根據步驟1)和2、的實驗結果確定檢測條件，向權利要求3所述生物傳感器中注入待檢測的DNA或蛋白質溶液，測量檢測過程中生物傳感器的電流變化，基于電流的變化實現對DNA或蛋白質的實時檢測。
全文摘要
本發明公開了一種快速高靈敏分子生物傳感器及其對DNA或蛋白質進行單分子檢測的方法。本發明所提供的的生物傳感器，包括a)至少一個單壁碳納米管晶體管器件，所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、源極、漏極和導電溝道；所述導電溝道為單壁碳納米管，該單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為1-10nm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管兩端連接。本發明是將納米/分子電子學與生物體系相結合，利用功能化的單分子器件通過電學信號測量實現對DNA或者蛋白質的活性進行直接的、實時的、具有專一選擇性與超高靈敏度檢測的可靠、實用的普適性方法。
文檔編號G01N27/26GK102375007SQ201010253888
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者劉松, 郭雪峰 申請人:北京大學