專利名稱：三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及體外免疫檢測，尤其是涉及一種三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒， 本發明還涉及該試劑盒的制備方法。
背景技術：
三碘甲狀腺原氨酸(3，5，3’_三碘甲狀腺原氨酸，T3)是一種分子量為651的碘化 酪氨酸，與甲狀腺素(T4) 一樣是一種重要的甲狀腺激素。碘和酪氨酸是合成甲狀腺激素的 主要原料，甲狀腺球蛋白是碘化的場所和原料，酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的偶聯均在此 進行，水解甲狀腺球蛋白時T3、T4被分泌入血，分泌物中90%為14，10%為了3。血液中20% 的Τ3由甲狀腺直接合成，另外80%的Τ3是由Τ4脫去1分子碘生成，脫碘位置不同也可形 成反Τ3，但反Τ3沒有生物活性。Τ3的半衰期為1.5天，20%在外周組織代謝消除，80%經 脫碘代謝。血清中Τ3的量只約為Τ4的1/60，但其生物活性比Τ4大5倍，因此Τ3的測定對診 斷甲狀腺功能紊亂和監測甲狀腺技能非常有意義。對甲狀腺功能亢進的病人來講，大多數 患者的總Τ3和總Τ4的水平都是升高的。不過在某些病例中，甲狀腺功能亢進僅僅是由于 Τ3的增多引起的(Τ3型甲亢癥)，因此對fT4正常的甲亢患者，建議檢測T3，尤其對于fT4 和TSH均正常的患者(一般患者常首先檢測fT4和TSH)，更應進一步檢測Τ3。Τ3水平升高 而Τ4正常還可見于甲狀腺功能正常而患有功能自主性甲狀腺疾病(Graves眼病)的患者， 也可為亞臨床型甲狀腺功能衰退者的一種代償現象，同時伴有TSH分泌增多。大量的實驗資料表明，測定血清T3是判斷甲狀腺功能亢進首選指標之一，特別是 T3毒血癥患者，血清T4濃度正常，而T3卻明顯升高。因此，測定血清T3是臨床診斷甲狀腺 功能的一項重要指標。一般來講，甲亢病人血清T3值會明顯升高。在多數甲亢病例中，血 清T3的升高和血清T4升高相平行；而T3毒癥，亦稱T3性甲亢中，血清T4值在正常范圍， 而僅T3升高。臨床上常見到某些病人在發展成典型的甲狀腺毒癥前，先經過一個血清T3 水平升高階段，說明測定血清T3對于診斷甲亢較測定血清T4更有意義。此外在甲亢病人 進行放射性碘或藥物治療過程中，血清T4降至正常，而血清T3仍高于正常，直至臨床甲狀 腺功能恢復正常，血清T3方降至正常水平；故測定血清T3又可作為判斷療效的可靠指標。從檢測原理上來講，目前臨床上常用的檢測三碘甲狀腺原氨酸的方法主要是競爭 法，包括標記抗原(包被抗體)的檢測方法和標記抗體(包被抗原)的檢測方法兩種，國外 試劑多為標記抗原的方法，國內試劑多為標記抗體的方法。從檢測技術上來講，過去以放免為代表的早期T3、T4測定試劑盒受方法學的限 制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應用較多 的為酶聯免疫技術和化學發光技術。化學發光技術興起于上個世紀80年代是繼酶聯免疫 技術和放免技術之后發展起來的新興技術，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快 速，標記結合物穩定，無放射性同位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發展。免疫 磁微粒技術是近幾年新興技術，它是利用高分子合成一定粒度大小的磁性固相微粒做載體，載體表面修飾有一定數量的化學功能團，可通過化學偶聯等方法包被上具有特異性親 和力的免疫活性物質(抗原或抗體)，具有分離速度快、效率高、可重復性好、反應均相等諸 多優點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，該試劑盒將酶促 化學發光技術與磁分離技術相結合，成本低廉，簡便快速，結果準確；本發明的另一目的還 在于提供該試劑盒的制備方法。為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案本發明所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，包括包被有二碘甲狀腺原氨 酸_明膠的磁微粒混懸液、三碘甲狀腺原氨酸系列校準品、辣根過氧化物酶標記的三碘甲 狀腺原氨酸抗體、解離劑、發光底物A液、發光底物B液及濃縮洗液。所述包被有二碘甲狀腺原氨酸-明膠的磁微粒混懸液中，所采用的磁微粒粒徑為 0. 8-1. 5um，表面含有濃度為20-30ueq/g的羧基活性基團。所述三碘甲狀腺原氨酸系列校準品采用去激素血清為基質，加入三碘甲狀腺原氨 酸純品配制而成。所述辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體，是將辣根過氧化物酶與鼠抗 三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體相連接。所述解離劑為含有1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)的Tris-NaCl緩沖液(三(羥甲 基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液)。所述發光底物A液由酶促化學發光底物、增強劑和氨基酸組成；發光底物B液由氨 基酸氧化酶和穩定劑組成。所述濃縮洗液為加有穩定劑和表面活性劑的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。本發明三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步，包被有二碘甲狀腺原氨酸_明膠的磁微粒混懸液的制備根據使用量取羧基磁微粒，用1-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC) 和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在酸性條件下(PH4. 5-PH5. 5)進行活化，活化完成后，加磁 場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用PH7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗去多余活化 劑；加入適量的二碘甲狀腺原氨酸-明膠，使其濃度為0. 5ul/mg磁微粒，在弱堿性條件下 (PH7. 4-PH8. 4)震蕩反應；反應結束后加磁場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含 有牛血清白蛋白的0. OlM的PBS緩沖液進行封閉，封閉結束后，加入封閉液以保存磁微 粒，使磁微粒的最終濃度為0. 5mg/ml ；該磁微粒混懸液置于2_8度保存，以備使用；第二步，三碘甲狀腺原氨酸系列校準品的制備用含有0.2%NaN3(防腐劑)和0. 15%-0. 25%PC300(防腐劑)的去激 素血清將三碘甲狀腺原氨酸純品配制成標示濃度為0ng/ml、0. 5ng/ml、lng/ml、2. 5ng/ml、 5ng/ml、10ng/ml的一系列校準品；第三步，辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的制備用活化劑EDC(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)將辣根過氧化物酶上的 氨基活化，然后加入鼠抗三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體，使抗體上的羧基與活化過的氨基縮合為酰胺化合物，透析后既得三碘甲狀腺原氨酸酶標抗體；在標記好的溶液中，等比加入 甘油-20度保存備用；第四步，解離劑的配制取純化水、Tris, NaCl, Proclin300、ANS按照下述比例配制成解離劑純化水 1000ml、Tri s 6. 05g、NaCl 8. 5g、Procl in3002ml、ANS l_3g ；第五步，發光底物A液和發光底物B液的配制發光底物A 液取 0. 2M Tris-Hcl、0. 15mM Luminol (魯米諾)、0. 59mM 羥基香豆 素、0. 59mM沒食子酸配制而成；發光底物B液取0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖、0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 008tween20、 0. 5mM DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、0. 12mM維生素C配制而成。第六步，濃縮洗液的配制取NaH2P04 · 2H20、Na2HP04 · 12H20、NaCl, Tween20、蒸餾水按照下述比例配制而 成NaH2P04 · 2H20 4. 6g、Na2HP04 · 12H20 62. 32g、NaCl 175. 6g、Tween202_10ml、蒸溜水 1000ml。本發明的優點在于采用了標記抗體包被抗原類似物的方法，與傳統標記同類激素 的免疫分析法不同，該方法包被了一種激素的化學結構類似物，而該類似物與所測激素具 有同等的免疫源性，因此能與該激素的抗體進行特異性結合，但與甲狀腺結合蛋白(THBP) 的結合能力卻大為降低，在很大程度上減小了結合蛋白對測量系統的影響。本發明的主要創新之處在于1、該試劑盒將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體 系，并且采用了一步法反應模式，使得檢測性能大大提高(靈敏度、精密性、檢測范圍等)， 反應時間大大縮短(從開始加樣到檢測結果，時間少于25min，明顯快于同類試劑盒)；2、發明了一種新的二碘甲狀腺原氨酸_明膠與磁微粒的偶聯方法，該方法偶聯效 率較高，結合牢固，且工藝穩定，在提高產品性能的同時，大大降低了產品成本；3、試劑盒中的校準品、酶結合物、解離劑、濃縮洗液、及發光底物配方均是該反應 體系下的最優配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
圖1是本發明試劑盒的標準曲線線形圖。圖2是本發明試劑盒與同類產品臨床對照圖。
具體實施例方式本發明所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，包括包被有三碘甲狀腺原氨酸 結構類似物(二碘甲狀腺原氨酸，Τ2)_明膠的磁微粒混懸液，該懸液中采用的磁微粒粒徑 約為0. 8-1. 5um，表面含有濃度為20-30ueq/g的羧基活性基團，采用活化劑對其羧基進行 活化，然后與二碘甲狀腺原氨酸-明膠的氨基進行連接，形成穩定的肽鍵；采用去激素血清 為基質，加入三碘甲狀腺原氨酸純品配制而成的三碘甲狀腺原氨酸系列校準品；將辣根過 氧化物酶與鼠抗三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體相連接的辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀 腺原氨酸抗體；含有ANS的Tris-NaCl緩沖液的解離劑；由酶促化學發光底物、增強劑和氨基酸組成的發光底物A液；由氨基酸氧化酶和穩定劑組成的發光底物B液以及含有穩定劑 和表面活性劑的PBS緩沖液，該緩沖液使用前需進行20倍稀釋。本發明三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步，包被有二碘甲狀腺原氨酸_明膠的磁微粒混懸液的制備根據使用量取適量的羧基磁微粒，用過量的EDC和NHS在酸性條件下 (PH4. 5-PH5. 5)進行活化，活化緩沖液為0. 05M-0. IM的MES (2-(N-嗎啉代)乙磺酸)緩 沖液，活化時間30min，活化完成后，加磁場，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清，用 PH7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗兩遍洗去多余的活化劑；加入適量的二碘甲狀腺原氨酸-明 膠，使其濃度為0. 5ul/mg磁微粒，在PBS緩沖液中(PH7. 4-PH8. 4)震蕩反應Ih ；反應結束 后加磁場，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有牛血清白蛋白的0. OlM的 PBS緩沖液進行封閉，反復封閉5次，每次lOmin，封閉結束后，加入適量的封閉液以保存磁 微粒，使磁微粒的最終濃度為0. 5mg/ml ；將該磁微粒混懸液置于2_8度保存，以備使用；該 連接方法效率較高，在很大程度上降低了包被原材料的使用量，減小了該試劑盒的成本，同 時該連接方法較為穩定，批間差異較小。第二步，三碘甲狀腺原氨酸系列校準品的制備依據國家藥品生物制品檢定所的三碘甲狀腺原氨酸標準品，用含有 NaN3 (0. l%-0. 2%)和PC300 (0. 15% -0. 25% )的去激素血清將三碘甲狀腺原氨酸純品配 制成標示濃度為 0ng/ml、0. 5ng/ml、lng/ml、2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml 的一系列校準品， 瓶蓋顏色依次為白、黃、綠、藍、紫、黑；由于該校準品采用去激素血清為基質，使得校準品與 樣本的反應性較為一致，在很大程度上減小了基質效應；同時該校準品依據國家標準品配 制而成，保證了測量結果的準確度；另外該校準品為液態，無需復溶，使用方便。第三步，辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的制備用活化劑EDC將辣根過氧化物酶上的氨基活化，然后加入鼠抗三碘甲狀腺原氨酸 單克隆抗體，使抗體上的羧基與活化過的氨基縮合為酰胺化合物，透析后既得三碘甲狀腺 原氨酸酶標抗體；在標記好的溶液中，等比加入甘油-20度保存備用；上述標記方法為碳二 亞胺(EDC)法，即將鼠抗三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體上的羧基與辣根過氧化物酶(HRP) 分子的氨基經EDC的作用縮合為酰胺化合物，透析后既得三碘甲狀腺原氨酸酶標抗體。經 檢測，該酶標記物在使用過程中的工作濃度為1 10000—1 20000。第四步，解離劑的配制取純化水、Tris, NaCl, Proclin300、ANS按照下述比例配制成解離劑純化水 1000ml,Tris 6. 05g、NaCl 8. 5g、Proclin3002ml、ANSl_3g。解離劑的目的是將血清樣本中 的三碘甲狀腺原氨酸從結合蛋白上解離下來，以保證該系統檢測的是血清中的總三碘甲狀 腺原氨酸的量。第五步，發光底物A液和發光底物B液的配制發光底物A液取0.2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM羥基香豆素、0. 59mM沒 食子酸配制而成；發光底物B液取0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖、0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 008tween20、 0. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C配制而成。第六步，濃縮洗液的配制
取NaH2P04 · 2H20、Na2HP04 · 12H20、NaCl, Tween20、蒸餾水按照下述比例配制而 成NaH2P04 · 2H20 4. 6g、Na2HP04 · 12H20 62. 32g、NaCl 175. 6g、Tween202_10ml、蒸溜水 1000ml。本發明試劑盒的使用操作程序如下1、樣本采集采用正確醫用技術收集血清(嚴重溶血或脂血的樣本不能用于測定)，收集后的 樣本在室溫放置不可超過8小時；如果不在8小時內檢測需將樣本放置于2-8°C的冰箱中； 若需72小時以上保存或運輸，則應凍存于-20°C以下，避免反復凍融。使用前恢復到室溫， 輕輕搖動混勻。2、實驗前準備①取1瓶濃縮洗液用蒸餾水進行20倍稀釋；②將恒溫箱或水浴鍋溫度調至37°C，待溫度穩定后使用；③將磁微粒混懸液充分混勻至無肉眼可見沉淀。3、實驗方法①取出一定量的反應容器，編號。根據實驗要求加入50ul校準品/質控品/臨床 樣本； ②搖勻磁微粒混懸液，每孔分別加入20 μ 1 ；③每孔分別加入解離劑50 μ 1、酶標記物50 μ 1 ；④將反應容器內溶液混合均勻，37°C溫育15分鐘；⑤使用磁分離及洗滌設備，將反應容器中磁微粒用洗液洗滌5次；⑥將洗滌后的反應容器充分振蕩使磁微粒散開；⑦每孔加入發光底物A和發光底物B各50 μ 1，振蕩混勻后避光室溫反應5分鐘；⑧化學發光檢測儀檢測發光強度；⑨采用四參數擬合方式，以校準品濃度值為X軸，以校準品發光強度值為Y軸，建 立定標曲線。根據待測樣本的發光強度值回算相應的濃度值。將本發明試劑盒按照方法學鑒定，可達到如下指標標準曲線線性=R大于0. 999 (如圖1所示)，最低檢出限小于0. lng/ml精密性分析內變異、分析間變異及批間變異均小于10% (見表1)表1.精密性數據表a)、分析內和分析間變異數據表
權利要求
一種三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于它包括包被有二碘甲狀腺原氨酸 明膠的磁微粒混懸液、三碘甲狀腺原氨酸系列校準品、辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體、解離劑、發光底物A液、發光底物B液及濃縮洗液。
2.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述包被 有二碘甲狀腺原氨酸一明膠的磁微粒混懸液中，所采用的磁微粒粒徑為0. 8-1. 5um，表面 含有濃度為20-30ueq/g的羧基活性基團。
3.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述三碘 甲狀腺原氨酸系列校準品采用去激素血清為基質，加入三碘甲狀腺原氨酸純品配制而成。
4.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述辣根 過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體，是將辣根過氧化物酶與鼠抗三碘甲狀腺原氨酸 單克隆抗體相連接。
5.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述解離 劑為含有1-苯胺基-8-萘磺酸的Tris-NaCl緩沖液。
6.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述發光 底物A液由酶促化學發光底物、增強劑和氨基酸組成；發光底物B液由氨基酸氧化酶和穩定 劑組成。
7.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮 洗液為含有穩定劑和表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
8.根據權利要求1所述的三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于它包括下述步驟第一步，包被有二碘甲狀腺原氨酸_明膠的磁微粒混懸液的制備根據使用量取羧基磁微粒，用EDC和NHS在酸性條件下進行活化，活化完成后，加磁場， 靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用PH7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗去多余活化劑；力口 入適量的二碘甲狀腺原氨酸-明膠，使其濃度為0. 5ul/mg磁微粒，在弱堿性條件下震蕩反 應；反應結束后加磁場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有1 %牛血清白蛋白的 0. OlM的PBS緩沖液進行封閉，封閉結束后，加入封閉液以保存磁微粒，使磁微粒的最終濃 度為0. 5mg/ml ；該磁微粒混懸液置于2_8度保存，以備使用；第二步，三碘甲狀腺原氨酸系列校準品的制備用含有0. -0. 2% NaN3和0. 15% -0. 25% PC300的去激素血清將三碘甲狀腺原氨 酸純品配制成標示濃度為 0ng/ml、0. 5ng/ml、lng/ml、2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml 的-系列 校準品；第三步，辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體的制備用活化劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺將辣根過氧化物酶上的氨基活化，然 后加入鼠抗三碘甲狀腺原氨酸單克隆抗體，使抗體上的羧基與活化過的氨基縮合為酰胺化 合物，透析后既得三碘甲狀腺原氨酸酶標抗體；在標記好的溶液中，等比加入甘油-20度保 存備用；第四步，解離劑的配制取純化水、Tris, NaCl, Procl in300、解離劑ANS按照下述比例配制成解離劑純化水 1000ml、Tris 6.05g、NaCl 8. 5g、Proclin3002ml、解離劑 ANSl_3g ；第五步，發光底物A液和發光底物B液的配制發光底物 A 液取 0. 2M Tris-Hcl、0. 15mM Luminol、0. 59mM 羥基香豆素、0. 59mM 沒食 子酸配制而成；發光底物B液取0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖、0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 008tween20、0. 5mM 二乙烯三胺五乙酸、0. 12mM維生素C配制而成； 第六步，濃縮洗液的配 制取NaH2P04 · 2H20、Na2HP04 · 12H20、NaCl、Tween20、蒸餾水按照下述比例配制而成 NaH2P04 · 2H20 4. 6g、Na2HP04 · 12H20 62. 32g、NaCl 175. 6g、Tween202_10ml、蒸餾水 IOOOml0
全文摘要
本發明公開了一種三碘甲狀腺原氨酸定量檢測試劑盒，包括包被有二碘甲狀腺原氨酸-明膠的磁微粒混懸液、三碘甲狀腺原氨酸系列校準品、辣根過氧化物酶標記的三碘甲狀腺原氨酸抗體、解離劑、發光底物A液、發光底物B液及濃縮洗液。本發明還公開了該試劑盒的制備方法。本發明的優點在于采用了標記抗體包被抗原類似物的方法，包被了一種激素的化學結構類似物，而該類似物與所測激素具有同等的免疫源性，因此能與該激素的抗體進行特異性結合，但與甲狀腺結合蛋白(THBP)的結合能力卻大為降低，在很大程度上減小了結合蛋白對測量系統的影響。本試劑盒的靈敏度、精密性和檢測范圍大大提高，反應時間大大縮短，提高產品性能的同時又降低了產品成本。
文檔編號G01N33/78GK101949944SQ20101024306
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者付光宇, 劉保鑫, 吳學煒, 渠海, 苗擁軍, 陳曉玲, 項立紅, 馬建軍, 高曉丹 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司