專利名稱：檢測膀胱癌的裝置的制作方法
技術領域：
本發明關于一種用于檢測膀胱癌的裝置，尤其關于一種用于檢測受檢者尿液中的鈣激活蛋白酶-9(Calpain-9)，以判斷受檢者是否罹患膀胱癌的裝置。
背景技術：
膀胱癌是最常發生于泌尿系統中的惡性腫瘤，全球每年約有十萬人罹患膀胱癌， 其中四分之三為男性，且以中老年人居多。一般認為膀胱癌的發生與飲食、抽煙或化學致癌物質(例如砷)等因素有關。膀胱癌于早期并無明顯癥狀，一旦出現無痛性血尿、尿頻、尿痛、小腹脹痛、排尿困難等癥狀時，通常已進入膀胱癌的中晚期，而膀胱癌腫瘤發展快，且易進行遠處及多處的轉移，故一旦發現罹癌時，往往已無法有效地進行治療。此外，膀胱癌的復發率高，更使其難以根治。因此，若能于膀胱癌早期即發現罹癌，則可提升治愈率，此更突顯膀胱癌篩檢的重要性。目前常見的膀胱癌檢測方法包括非侵入性(non-invasive)的尿液細胞學(urine cytology)檢查、以及侵入性(invasive)的膀胱鏡檢查與病理組織切片檢查。其中，以細胞形態判讀為依據的尿液細胞學檢查的靈敏度與準確度均偏低，對于低度變異的細胞往往無法進行判別，因而影響篩檢結果。至于膀胱鏡檢查及病理組織切片檢查，其靈敏度與準確度雖較高，但檢測費用昂貴，且會造成受檢者的痛苦。因此，臨床上仍亟須一種可方便、快速且準確地檢測膀胱癌的方法。本發明即針對上述需求所為的研究，本發明人發現膀胱癌患者尿液中具有高濃度的鈣激活蛋白酶-9 (Calpain-9)，從而開發一種檢測膀胱癌的裝置，其可用于快速且精確地篩檢膀胱癌。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可方便、快速且準確地檢測膀胱癌的裝置。為達到上述目的，本發明采用的技術手段如下一種用于檢測膀胱癌的裝置，包含一樣本接受墊，用于吸收一尿液樣本；一檢測試劑墊，連接至該樣本接受墊，且包含一鈣激活蛋白酶-9 (Calpain-9)的第一抗體、以及一與該第一抗體結合的金屬顆粒；一顯示膜，其連接至該檢測試劑墊，且包含一檢驗區及一品質管控區；以及一吸收墊，其連接至該顯示膜的該品質管控區，其中，該檢驗區位于該品質管控區與該檢測試劑墊之間，且包含一固定于該檢驗區上的蛋白質，及一結合至該蛋白質上的鈣激活蛋白酶-9，且其中該品質管控區包含一固定于其上的第二抗體，其是該第一抗體的抗體。本發明的有益效果在于本發明一種檢測膀胱癌的裝置利用膀胱癌患者尿液中具有高濃度的鈣激活蛋白酶-9 (Calpain-9)，能夠快速且精確地篩檢膀胱癌。本發明的詳細技術及較佳實施形態，將配合附圖而描述于以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明了本發明的特征。
圖1是本發明裝置的上視圖；圖2是本發明裝置的剖面圖；圖3是本發明裝置的連接示意圖；圖4是本發明的一實施形態的剖面圖；圖5是本發明裝置的作用原理的示意圖；圖6是本發明裝置呈陽性反應的示意圖；以及圖7是本發明裝置呈陰性反應的示意圖。主要元件符號說明1樣本接受墊6 粘著劑2 檢測試劑墊
7金屬顆粒3 顯示膜8 第一抗體
3A檢驗區9 金屬顆粒-第--抗體復合體
3B品質管控區10鈣激活蛋白酶-94吸收墊
11第:二抗體5背襯
具體實施例方式除非文中有另外說明，于本說明書中(尤其是在權利要求中)所使用的“一”、“該” 及類似用語應理解為包含單數及數個形式。鈣激活蛋白酶(Calpain)是一種鈣依賴性的細胞內非溶酶體的半胱胺酸蛋白酶家族(calcium-requiring intracellular non-lysosomal cysteine protease family), 其是細胞增生的調控劑，且經由參與細胞周期進程、細胞分化及細胞凋亡等過程，而于各種癌癥的致癌機制中扮演關鍵角色。目前已知有十四種鈣激活蛋白酶，其中，鈣激活蛋白 Sl -9 (Calpain-9)(Yoshikawa et al. , Isolation of two novel genes，down—regulated in gastric cancer. Jpn. J. Cancer Res. 2000，91，459—463，i亥文獻全文并于此處以供參考)。本發明發明人利用尿液檢體易于取得的便利性，以及膀胱癌患者尿液中具有高濃度的鈣激活蛋白酶-9的特性，使用鈣激活蛋白酶-9作為膀胱癌的生物腫瘤標記，而開發一種用于檢測膀胱癌的裝置。以下將參照圖1及圖2以說明根據本發明裝置的一實施形態，其中，圖1及圖2分別為該實施形態的上視圖及剖面圖。如圖1所示，根據本發明的用于檢測膀胱癌的裝置，包含樣本接受墊1、檢測試劑墊2、顯示膜3、以及吸收墊4，且顯示膜3包含檢驗區3A及品質管控區:3B。樣本接受墊1用于吸收受檢者的尿液樣本，以供進行尿液中鈣激活蛋白酶-9的檢測。于此，樣本接受墊1可以滴入尿液樣本或浸泡至尿液樣本中的方式來吸收該樣本；較佳地，以滴入尿液樣本的方式吸收該樣本，蓋因相較于浸泡方式，滴定方式可更為精確地控制受測樣本的量，使檢測結果具有更高的準確性。
樣本接受墊1的材料采用對尿液具良好吸收性，舉例言之，于本發明的一實施形態中，以纖維素纖維作為樣本接受墊的材料。檢測試劑墊2連接至樣本接受墊1，其包含一鈣激活蛋白酶-9的第一抗體以及一與該第一抗體結合的金屬顆粒。該第一抗體的來源并無特別限制，其可利用一般基因選殖技術或使用勝肽合成儀來制得；也可采用將鈣激活蛋白酶-9接種至一動物體內，使其產生鈣激活蛋白酶-9的抗體的方法來獲得該第一抗體。此外，該第一抗體經該金屬顆粒標定 (label)，兩者結合而形成一金屬顆粒-第一抗體的復合體。此復合體的第一抗體可與鈣激活蛋白酶-9結合，進一步形成一金屬顆粒-第一抗體-鈣激活蛋白酶-9的復合體，其可因金屬顆粒與鈣激活蛋白酶-9間發生反應而呈色。于檢測試劑墊2中，由于金具有良好的生物相容性，且易經由蛋白質(或抗體)上的硫氫基(-SH)而與蛋白質(或抗體)結合，故可采用金顆粒作為所需的金屬顆粒。一般采用具納米等級尺寸的金屬顆粒，較佳為粒徑不大于100納米，更佳為不大于80納米，例如粒徑在15納米至80納米的范圍。此外，可使用任何合宜的材料以提供檢測試劑墊2，只要其可提供所欲的尿液吸收性。舉例言之，于本發明一實施形態中，以玻璃纖維提供檢測試劑墊。顯示膜3用于呈現或顯示本發明裝置的檢測結果，以供判斷受檢者是否罹患膀胱癌。顯示膜3連接至檢測試劑墊2，且包含檢驗區3A及品質管控區:3B，其中，檢驗區3A位于品質管控區3B與檢測試劑墊2之間。檢驗區3A包含一固定(immobilize)于其上的蛋白質，及一結合至該蛋白質上的鈣激活蛋白酶-9。該蛋白質的功能類似于錨，可使鈣激活蛋白酶-9固定于檢驗區3A上。該蛋白質的種類并無特別限制，舉例言之，于本發明一實施形態中，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為該固定于檢驗區3A上的蛋白質。借助該蛋白質固定于檢驗區3A 上的鈣激活蛋白酶_9，用于捕捉位于檢測試劑墊2但隨檢測樣本傳送至檢驗區3A，且尚未與鈣激活蛋白酶-9反應的金屬顆粒-第一抗體復合體。品質管控區IBB包含一固定于其上的第二抗體，其是該第一抗體的抗體。該第二抗體用于捕捉第一抗體，并進行呈色反應，以供確認第一抗體的反應活性，借此檢視本發明裝置的有效性。該第二抗體的來源并無特別限制，其可利用一般基因選殖技術或使用勝肽合成儀來制得；也可采將第一抗體接種至一動物體內，使其產生第一抗體的抗體來獲得該第二抗體。可使用任何合宜的材料以提供顯示膜3，舉例言之，于本發明一實施形態中，以硝化纖維素(nitrocellulose)作為該顯示膜的材料。吸收墊4連接至顯示膜3的品質管控區3B，其用于提供本發明裝置的毛細流動 (capillary flow)或橫向流動(lateral flow)的驅動力，故其對尿液樣本的吸收能力較樣本接受墊1、檢測試劑墊2及顯示膜3為強。較佳地，于本裝置中，各區的吸收能力為吸收墊4 >品質管控區:3B檢驗區3A檢測試劑墊2 >樣本接受墊1，以使尿液可輕易地自樣本接受墊1往吸收墊4的方向移動，使本發明裝置發生作用。可使用任何合宜的材料以提供吸收墊4，舉例言之，于本發明一實施形態中，以纖維素纖維作為吸收墊4的材料。一般而言，本發明裝置中的樣本接受墊1、檢測試劑墊2、顯示膜3及吸收墊4如圖1及圖2所示般地呈一長條狀的形式。于此，較佳地，如圖3中虛線處所示，于各相鄰區的連接處以交互重疊的方式連接，以提供更為緊密的接合。此外，如圖4所示，本發明裝置可更包含一背襯5，以支撐樣本接受墊1、檢測試劑墊2、顯示膜3及吸收墊4，其中，可透過一粘著劑6，使樣本接受墊1、檢測試劑墊2、顯示膜3及吸收墊4得以粘附于背襯5上，使彼此更緊密連接。以下將參照圖5、圖6及圖7，以進一步說明本發明裝置的作用。就膀胱癌患者而言，當將其尿液樣本滴定至樣本接受墊1，或將樣本接受墊1浸泡于尿液樣本中，然后橫置本發明裝置時，尿液會借助毛細作用原理以及吸收墊4所提供的驅動力，向吸收墊4的方向移動。當尿液移動至檢測試劑墊2時，因膀胱癌患者尿液中具有高濃度的鈣激活蛋白酶-9， 其會與檢測試劑墊2中由金屬顆粒7與第一抗體8所組成的金屬顆粒-第一抗體復合體9 結合，而形成一金屬顆粒-第一抗體-鈣激活蛋白酶-9復合體。此復合體會隨著尿液繼續移動至顯示膜3的檢驗區3A。于此，由于此復合體上的第一抗體8已與尿液樣本中的鈣激活蛋白酶-9結合，故不會與固定于檢驗區3A上的鈣激活蛋白酶-9結合，因此，此復合體會繼續往品質管控區3B的方向移動；而固定于檢驗區3A上的鈣激活蛋白酶-910則因無法與第一抗體8結合，遂無法與金屬顆粒7反應而呈色，因此，在檢驗區3A處不會有呈色反應。 隨后，當金屬顆粒-第一抗體-鈣激活蛋白酶-9復合體移動至品質管控區:3B時，固定于品質管控區:3B上的第二抗體11會與此復合體上的第一抗體8結合，使該復合體固定于品質管控區:3B處而呈色，至于過量而無法與第二抗體11結合的復合體則繼續往吸收墊4移動。 因此，對于罹患膀胱癌的受檢者而言，其尿液樣本經本發明裝置的檢測分析后，會于顯示膜 3上呈現單一色帶，即于品質管控區:3B所呈現的色帶(如圖6所示)，說明第一抗體具有反應活性，故本發明裝置運作正常，且也說明此測試結果為膀胱癌的陽性反應。另一方面，就正常受檢者(即，未罹患膀胱癌的受檢者)而言，當將其尿液樣本滴定至樣本接受墊1，或將樣本接受墊1浸泡于其尿液樣本中，然后橫放本發明裝置時，尿液會借助毛細作用原理以及吸收墊4所提供的驅動力向吸收墊4的方向移動。當尿液移動至檢測試劑墊2時，因膀胱癌患者尿液中不具有鈣激活蛋白酶_9，或鈣激活蛋白酶-9濃度過低，故檢測試劑墊2中由金屬顆粒7及第一抗體8所組成的金屬顆粒-第一抗體復合體 9以未與鈣激活蛋白酶-9結合的形式，而隨著尿液移動至顯示膜3的檢驗區3A。于此，金屬顆粒-第一抗體復合體9上的第一抗體8會與固定于檢驗區3A上的鈣激活蛋白酶-910 結合，使金屬顆粒-第一抗體復合體9固定于檢驗區3A處，且使鈣激活蛋白酶-910與金屬顆粒-第一抗體復合體9上的金屬顆粒7發生反應而呈色，因而在檢驗區3A處發生呈色反應，而出現一色帶。隨后，過量而無法與固定于檢驗區3A上的鈣激活蛋白酶-910結合的金屬顆粒-第一抗體復合體9會繼續往品質管控區:3B的方向移動，當其移動至品質管控區:3B 時，固定于品質管控區3B上的第二抗體11會與金屬顆粒-第一抗體復合體9上的第一抗體8結合，使金屬顆粒-第一抗體復合體9固定于品質管控區:3B處而呈色，過量而無法與第二抗體11結合的金屬顆粒-第一抗體復合體9則繼續往吸收墊4移動。因此，對于正常受檢者而言，其尿液樣本經本發明裝置的檢測分析后，會于顯示膜3上呈現兩個色帶，即于檢驗區3A與品質管控區:3B所呈現的色帶(如圖7所示)，說明第一抗體具有反應活性，故本發明裝置運作正常，且也說明此測試結果為膀胱癌的陰性反應。于任何情形中，若品質管控區:3B未呈現色帶，則代表該裝置失效，須重新使用另一裝置再行檢測。
綜上，本發明提供一種檢測膀胱癌的裝置，其可方便、快速且準確地進行膀胱癌的早期檢測，且可用于監測膀胱癌是否復發。茲以下列具體實施形態以進一步例示說明本發明。其中該些實施形態僅提供作為說明，而非用以限制本發明的范疇。制備例依以下步驟制備本發明裝置中的樣本接受墊、檢測試劑墊、顯示膜、以及吸收墊。制備樣本接受墊及吸收墊樣本接受墊及吸收墊使用一材質為非織物、100%純纖維素纖維的墊片(C048， Millipore，馬薩諸塞州，美國)。樣本接受墊裁成15X300毫米的尺寸，并使其浸泡于一包含20毫摩爾濃度/公升硼酸鈉、2. 0重量/體積％蔗糖、2. 0重量/體積％牛血清白蛋白、 以及0. 1重量/體積％疊氮化鈉的緩沖液(pH 8. 0)中，再于56°C下干燥1小時。吸收墊則裁成40X300毫米的尺寸。將樣本接收墊及吸收墊置于室溫下，以干燥劑儲存。制備檢測試劑墊使用一含有8. 75重量/體積％蔗糖、8. 75重量/體積％牛血清白蛋白、0. 6摩爾/ 公升氯化鈉、10毫摩爾/公升乙二胺四乙酸(EDTA)、及0. 1重量/體積％疊氮化鈉的硼酸鈉緩沖液(PH 8.0，20毫摩爾/公升)稀釋膠體狀的經金(Ag)結合標定的鈣激活蛋白酶-9 的單株抗體至最終濃度為2微克/毫升，以制備一檢測試劑溶液。將一尺寸為7X300毫米的玻璃纖維墊(型號GFCP203000，4004311，Millipore，馬薩諸塞州，美國)浸泡于該檢測試劑溶液中，再于56°C下干燥1小時，以制備一檢測試劑墊。將該檢測試劑墊置于室溫下， 以干燥劑儲存。制備顯示膜[制備檢驗區試劑]利用一般基因工程技術將鈣激活蛋白酶-9連結至牛血清白蛋白上(即，鈣激活蛋白酶-9-BSA)，以作為檢驗區的試劑。將5毫克鈣激活蛋白酶-9-BSA溶于4毫升氯化氫 (0. 01摩爾/公升，冷卻至0至5°C )中，并與10毫克亞硝酸鈉混合。于4°C下攪拌該混合物達6小時后，添加2毫升磷酸鹽緩沖液(0. 1摩爾/公升，pH 8. 6，含有20毫克牛血清白蛋白)，并于4°C下再次攪拌該混合物達6小時。將所得溶液置于室溫下一夜，再以kphadex G-50(購自Roche公司，美國)過濾或以透析方式(使用一磷酸鹽(PBQ緩沖液(含有8公克氯化鈉、0. 2公克氯化鉀、1. 44公克磷酸氫二鈉、0. 24公克磷酸二氫鉀(溶于1公升二次水中)純化鈣激活蛋白酶-9-BSA，即制得檢驗區的試劑。[制備品質管控區試劑]使用羊的抗老鼠免疫球蛋白(Goat anti-mouse immunoglobulin)作為品質管控區的試劑。以兩星期一次的周期，將老鼠的鈣激活蛋白酶-9抗體(即第一抗體)的免疫球蛋白G(先以Freimd's complete佐劑(Pierce，伊利諾伊州，美國)進行均質化一次，再以 Freund' s incomplete佐劑進行其余均質化程序)接種至一羊體內，使其產生抗體(即第二抗體)，共進行四次。在最后一次接種后，使該羊流血達14天，并收集血清。根據產品說明，使用一蛋白質-G 親合性管柱(protein-G affinity column，Amersham Biosciences， Uppsala，瑞士)自血清中純化出羊的抗老鼠免疫球蛋白G抗體(第二抗體)，即制得品質管控區的試劑。
[固定檢驗區與品質管控區的試劑]將以上制備的鈣激活蛋白酶-9-BSA與羊的抗老鼠免疫球蛋白G分別以PB S稀釋至1.0毫克/毫升的濃度，并使用一連接至XYZ Biostrip分散器(Bio-Dot，加州，美國) 的Quanti 3000 Biojets，以50點/微升/厘米的點狀形式，分別施用及固定鈣激活蛋白酶-9-BSA與羊的抗老鼠免疫球蛋白G至一膜(HiFlow Plus Cellulose Ester Membrane, 300X25毫米，Millipore, Bedford，馬薩諸塞州，美國)上，以完成包含一檢驗區與一品質管控區的顯示膜。該顯示膜的毛細流動時間(capillary flow time)為180秒/4厘米，且厚度為135微米。于40°C下干燥1小時后，將該顯示膜密封并置于干燥環境及室溫下儲存。組裝本發明的裝置于一塑料襯板上依序粘貼以上制得的樣本接受墊、檢測試劑墊、顯示膜與吸收墊， 并于兩端覆蓋彩色薄膜，再使用一 CM 4000裁切器(Bio-Dot，加州，美國)將粘貼好的墊片裁切成3毫米寬的長條，即制得本發明的裝置。將本發明裝置密封于一塑料袋中，并以干燥劑儲存于4°C下備用。上述實施例僅用以例示說明本發明的原理及功效，而非用于限制本發明。任何熟于此項技藝的人士均可在不違背本發明的技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明的權利保護范圍應如后述的申請專利范圍所列者。
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權利要求
1.一種用于檢測膀胱癌的裝置，其特征在于包含一個樣本接受墊，用于吸收尿液樣本；一個檢測試劑墊，連接至該樣本接受墊，且包含鈣激活蛋白酶-9 (Calpain-9)的第一抗體、以及與該第一抗體結合的金屬顆粒；一個顯示膜，其連接至該檢測試劑墊，且包含一個檢驗區及一個品質管控區；以及一個吸收墊，其連接至該顯示膜的該品質管控區，其中，該檢驗區位于該品質管控區與該檢測試劑墊之間，且包含固定于該檢驗區上的蛋白質，及結合至該蛋白質上的鈣激活蛋白酶-9，且其中該品質管控區包含固定于其上的第二抗體，該第二抗體是該第一抗體的抗體。
2.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該樣本接受墊及該吸收墊的材料是纖維素纖維。
3.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該檢測試劑墊中的金屬顆粒的粒徑為小于或等于100納米。
4.如權利要求3所述的裝置，其特征在于，該檢測試劑墊中的金屬顆粒的粒徑為小于或等于80納米。
5.如權利要求3或4所述的裝置，其特征在于，該檢測試劑墊中的金屬顆粒是金顆粒。
6.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該檢測試劑墊的材料是玻璃纖維。
7.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該固定于該檢驗區上的蛋白質是牛血清白蛋白(bovine serum albumin)。
8.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該顯示膜的材料是硝化纖維素 (nitrocellulose)。
9.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該樣本接受墊供以浸泡尿液樣本的方式來吸收該樣本。
10.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，該樣本接受墊供以滴入尿液樣本的方式來吸收該樣本。
全文摘要
一種用于檢測膀胱癌的裝置，其包含一樣本接受墊，用于吸收一尿液樣本；一檢測試劑墊，連接至該樣本接受墊，且包含一鈣激活蛋白酶-9的第一抗體、以及一與該第一抗體結合的金屬顆粒；一顯示膜，連接至該檢測試劑墊，且包含一檢驗區及一品質管控區；以及一吸收墊，其連接至該顯示膜的該品質管控區，其中，該檢驗區位于該品質管控區與該檢測試劑墊之間，且包含一固定于該檢驗區上的蛋白質，及一結合至該蛋白質上的鈣激活蛋白酶-9，且其中該品質管控區包含一固定于其上的第二抗體，其是該第一抗體的抗體。本裝置可方便、快速且準確地檢測膀胱癌。
文檔編號G01N33/574GK102338803SQ201010238920
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者陳黎明, 高忠漢 申請人:陳黎明, 高忠漢