一種同步檢測血清樣本中多種抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法

專利名稱：一種同步檢測血清樣本中多種抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種同步檢測血清樣本中西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽流感 抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法。
背景技術：
西尼羅熱是由西尼羅病毒感染引起的急性傳染病。人感染西尼羅病毒多數表現為 隱性感染，約140 300個感染者中有1個臨床病例。其癥狀為突然發熱、頭痛、背痛、肌肉 痛等。發燒可表現為雙波熱，約半數病人可見皮疹。出疹時間在發熱期或發熱末期。皮疹 可為玫瑰樣疹或斑丘疹，部位主要在頸背和上肢，持續時間約為1周。可見咽炎和惡心、嘔 吐、腹瀉、腹痛等胃腸道癥狀。病程一般為3 6天，然后迅速恢復，預后良好，少數病人特 別是老年人可表現為無菌性腦膜炎或腦膜腦炎，伴有頸強直、嘔吐、神志不安、嗜睡、四肢發 抖、痙攣、局部麻痹和昏迷等，病死率較高，達5 12%。土拉菌病是由土拉弗朗西斯菌引起的多種野生動物、家畜及人共患病，亦稱野兔 熱。臨床上以體溫升高、淋巴結腫大、脾和其他內臟壞死為特征，土拉菌可以被用作生物戰 中的致病病菌，感染者會出現高燒、渾身疼痛、腺體腫大和咽食困難等癥狀。登革熱是登革熱病毒引起、依蚊傳播的一種急性傳染病。臨床特征為起病急驟，高 熱，全身肌肉、骨髓及關節痛，極度疲乏，部分患可有皮疹、出血傾向和淋巴結腫大。禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，也能感染人類，人感染后的癥狀 主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭 導致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為百分之33。此病可通過消化道、呼吸 道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播，區域間的人員和車輛往來是傳播本病的重要途徑。免疫學方法酶聯免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應來檢測抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體的 原理是特異性抗原結合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應抗體結合形成免疫復合 物，洗滌后再加酶標記二抗與免疫復合物中的抗體結合形成酶標記二抗_抗體_固相抗原 復合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀70年代美國Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平 臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸 研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。目前發展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優化，以縮 短檢測時間，降低檢測成本。但是懸浮芯片方法是否能夠同步檢測人血清中的西尼羅抗體、 土拉抗體、登革熱抗體、禽流感抗體，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發明內容
本發明的目的在于提供一種同步檢測血清中西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、 禽流感抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包括包被有捕獲抗原的編碼微球，作為捕獲抗原的有 西尼羅E蛋白、土拉fopA蛋白、登革熱E2蛋白、禽流感H5蛋白，生物素標記的二抗和SPA 作為捕獲抗體，鏈親和素_藻紅蛋白及相關緩沖溶液。本發明提供上述檢測西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽流感抗體的蛋白懸浮 芯片的制備方法，其特征在于，在相關緩沖溶液中，025號編碼微球用西尼羅E蛋白抗原包 被、028號編碼微球用土拉fopA蛋白抗原包被、031號編碼微球用登革熱E2蛋白抗原包 被、032號編碼微球用禽流感H5蛋白抗原包被，用生物素標記的二抗為羊抗兔IgG或/和 Biotin-SPA，用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號檢測物，所述編碼微球優選025、028、 031、032號編碼微球。本發明提供一種采用蛋白懸浮芯片同步檢測血清樣品中西尼羅抗體、土拉抗體、 登革熱抗體、禽流感抗體的間接免疫學定量檢測方法，該方法采用間接法檢測抗體的免疫 學檢測原理，在檢測過程中所有反應可在96孔濾板上或在微量離心管中進行，其中包括下 列步驟(1)將西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被025編碼微球、用土拉fopA蛋白抗 原作為捕獲抗原來包被028號編碼微球、用登革熱E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被031號 編碼微球、用禽流感H5蛋白抗原作為捕獲抗原來包被032號編碼微球；(2)每孔或管中 加入含有各包被捕獲抗原的編碼微球，即西尼羅E蛋白抗原包被的025號編碼微球、用土 拉fopA蛋白抗原包被的028號編碼微球、用登革熱E2蛋白抗原包被的031號編碼微球、用 禽流感H5蛋白抗原包被的032號編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測血清 樣品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白 (SA-PE)，孵育后清洗，(6)加入檢測緩沖液后混合均勻，(7)用懸浮芯片系統讀取MFI數值 (即平均熒光強度)并分析數據判定檢測結果陰性或陽性。該方法中，采用生物素標記的SPA作為捕獲抗體，并且其與各包被抗原組合組 成間接法檢測體系；包被微球的各捕獲抗原用量為0. 01 250 μ g/1. 25X IO6個編碼微 球，標記檢測抗體羊抗人IgG的生物素為羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的檢測二抗 Bioin-SPAWl 2500稀釋作為檢測物進行檢測。本發明還提供一種采用蛋白懸浮芯片定量檢測血清樣品中西尼羅抗體、土拉抗 體、登革熱抗體、禽流感抗體的方法，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性檢測樣品或標 準品經4倍梯度倍比系列稀釋，(2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統中檢測讀取對應熒光 值(MFI) ； (3)制作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應標準曲線，(4)用分析軟件擬合劑 量-反應曲線和方程，(5)根據劑量-反應曲線可判定方法的動態檢測范圍，未知濃度樣品 可根據劑量_反應方程判斷檢測樣品的濃度。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分 析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。其在以下懸浮芯片 系統中完成檢測，標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應，反應后，利用機器自動 將反應液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發微球基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一 道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球 的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有 微球中的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的微球種 類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存 在，或同時存在有幾種至數十種病原。懸浮芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜 芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術， 大大提高了樣品檢測的準確性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。本發明人經過大量試驗和深入的研究，對同步檢測西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱 抗體、禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測條件作了實質性的改進和創新，其具有下 列優點1、抗原包被量的改進抗原的包被量是否適量是成功檢測的關鍵，本發明對包被微球的抗原包被量進行 實質性優化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很低， 本發明的抗原包被量為0. 01 250 μ g/1. 25 X IO6個微球，即0. 004 1000ng/5000個微 球/測試，而傳統免疫學ELISA方法的包被量為1 μ g/測試。2、生物素標記的改進通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素 因未標記上抗體而不被微球上結合捕獲抗體的抗體連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加 入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現 象，出現假陽性，因此建議生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標記2mg/mL的 IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度及動態范圍本發明同步檢測幾種微生物抗體的蛋白懸浮芯片系統檢測土拉fopA抗體的檢 測靈敏度為5. Ong/mL，并且懸浮芯片系統的動態檢測范圍為10. 9710ng/mL 11. 05 μ g/ mL ；同步檢測幾種微生物抗體的蛋白懸浮芯片系統檢測登革熱2型抗體的檢測靈敏度為 3. 39ng/mL,并且懸浮芯片系統的動態檢測范圍為258. 8ng/mL 66. 25 μ g/mL。4、方法的特異性本發明通過選用西尼羅E蛋白、土拉fopA蛋白、登革熱E2蛋白、禽流感H5蛋白為 包被抗原，分別以兔抗西尼羅E蛋白抗體、兔抗土拉抗體、兔抗登革熱2型抗體、兔抗禽流感 H5抗體為待測抗體，以生物素化的羊抗兔為捕獲抗體。本研究試驗證明各對應的抗原特 異性的與對應抗體結合，不與其它抗體發生交叉反應，說明本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測能力本發明評價了懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢測，初步證 實了該方法在檢測人血清中西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽流感抗體的實用性。


圖1 蛋白懸浮芯片方法檢測多種病原抗體示意圖；圖2 蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗土拉抗體劑量_反應標準曲線5
圖3 蛋白懸浮芯片同步檢測土拉抗體柱形圖；圖4 蛋白懸浮芯片方法檢測登革熱2型抗體劑量_反應標準曲線圖；圖5 蛋白懸浮芯片同步檢測登革熱2型抗體柱形圖。
具體實施例方式如圖1至圖5所示，本發明涉及同步檢測西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽 流感抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢測及定量方法通過下面的具體實施方式
作進一步說 明，但本發明不以任何方式受該實施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ； KH2P042mmol/L。用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HPO4 和 0. 24g ΚΗ2Ρ04。用 HCl調節溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘， 或過濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0. 05M MES, pH 5. 0 2. 44g MES, 5NNaOHO. 15mL,定容于 250mL。(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02%TWEEN,0. 05%疊氮化物，pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11)生物素化檢測物稀釋液PBS-TBN(PBS，0. 1% BSA, 0. 02% TWEEN-20,0. 05% NaN3, pH7. 4)。(12) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA。2.抗原與抗體本發明所使用的抗原為西尼羅E蛋白、土拉fopA蛋白、登革熱E2蛋白、禽流感H5 蛋白，西尼羅E蛋白、土拉f opA蛋白、登革熱E2蛋白可購自中國檢驗檢疫科學研究院，禽流 感H5蛋白可購自中國農科院哈爾濱獸醫研究所。本發明所使用檢測抗體為兔抗土拉IgG，可購自中國檢驗檢疫科學研究院，兔抗登 革熱2型抗體可購自軍事醫學科學研究院微生物研究所，檢測二抗為生物素化羊抗兔IgG 和生物素化SPA，所述的羊抗兔IgG可購自北京鼎國生物技術公司、SPA可購自Sigma公司。二、待測樣品的制備1、目標分析物樣品的制備目標分析物為兔抗土拉IgG、兔抗登革熱2型抗體。兔抗土拉IgG的儲備液濃度為 44. 2 μ g/mL，兔抗登革熱2型抗體的儲備液濃度為1. 06mg/mL。
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將待分析的兔抗土拉IgG、、兔抗登革熱2型抗體用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀 釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測 的敏感度，高濃度樣品應使編碼微球的結合位點處于飽和狀態。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測幾種病毒抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本發明采用的025號、028號、031號、032號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，025 號編碼微球用于標記可以捕獲西尼羅抗體的西尼羅E蛋白抗原，即利用西尼羅E蛋白包被 微球；028號編碼微球用于標記可以捕獲土拉抗體的土拉fopA蛋白抗原，即利用土拉fopA 蛋白包被微球；031號編碼微球用于標記可以捕獲登革熱抗體的登革熱E2蛋白抗原，即利 用登革熱E2蛋白包被微球；032號編碼微球用于標記可以捕獲禽流感抗體的禽流感H5蛋 白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球。A、編碼微球的活化取100 μ L (1. 25 X IO6個)編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出 并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室 溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7. 4)，震蕩后，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清 液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原各抗原1 200 μ g分別加入到活化后的各對應編碼微球中，用PBS緩 沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L 的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液 懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微 球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存備用。C、包被微球的計數吸取適量微球，稀釋后，用血球計數板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計數。 根據公式(每個大格數Xio4X稀釋倍數X體積(mL))計算微球數量。2、檢測物標記生物素A、生物素的標記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和2mg/mL的待標記抗體溶液，將計算好體 積的生物素加入到待標記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存備用。B、抗體的用量以標記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ L·
實施例2、懸浮芯片制備法條件的優化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 1 μ g、2. 5μ g、5y g、7. 5μ g、10y g、12. 5μ g、15y g、20y g、25y g、30y g、 40 μ g、50 μ g的量包被100 μ L編碼微球。經檢測效果比較，以1 50 μ g/1. 25 X IO6個微 球，即4 200ng/5000個微球/測試，包被效果最好，顯微鏡下計數后避光冷藏保存待用。 如圖1所示，包被西尼羅E蛋白的025號微球、土拉fopA蛋白抗原的028號微球、登革熱E2 蛋白的031號編碼微球、禽流感H5蛋白的032號編碼微球均落在其正確檢測區域內，并且 獲得高信噪比結果(MFI值遠大于2000)，說明優化的懸浮芯片檢測系統可成功用于西尼羅 抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽流感抗體的檢測。2、生物素化檢測物的優化本發明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性 的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體，經質控過程檢測效 果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標記檢測物檢測效果較好，檢測效果的方法采用本領 域的常規方法或安裝制造商的產品說明書所述的方法。本發明人經過試驗驗證，發現2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1 500稀釋作為 檢測物進行檢測兔血清中的土拉抗體，檢測結果顯示生物素化檢測物Bio-羊抗兔抗體可 獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化的檢測物Biotin-SPAWl 2500 稀釋作為檢測人血清中土拉抗體的檢測物，檢測結果顯示生物素化檢測物Biotin-SPA可 獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。實施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測及結果判定1、待測樣品制備用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測及結果判定檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用生物素檢測物稀釋液稀釋后的生物素化檢測物，混勻 后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經振蕩混勻使微球重懸；6)用懸浮芯片系統讀取MFI數值并分析數據。3、檢測結果判定根據試驗研究結果與相關研究報道，本發明定義蛋白質懸浮芯片方法檢測抗體的 最低檢出限(L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測物濃度。其中，Cutoff 的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)JP Cutoff 值為=MFI (空白對照)+3倍標準差。若檢測結果高于LOD對應熒光強度值則判定為待測抗 體檢測結果陽性；若檢測結果低于LOD對應熒光強度值則判定為待測抗體檢測結果陰性。實施例4、蛋白懸浮芯片定量檢測兔抗土拉IgG模型的建立1、兔抗土拉IgG標準曲線樣品制備
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用樣品稀釋液將兔抗土拉IgG標準品由濃度為44. 2 μ g/mL以4倍倍比梯度稀釋 至濃度為0. 168ng/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據懸浮芯片系統檢測結 果繪制劑量-反應標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表樣品濃度，Y軸代表懸浮芯片儀 檢測的熒光值(MFI)。每個數據代表3次的檢測結果平均值，坐標軸以對數-對數關系設定， 圖 2 中兔抗土拉抗體的濃度分別為:S1 0. 168ng/mL, S2 :0· 6744ng/mL, S3 :2· 6977ng/mL， S4 :10. 7910ng/mL，S5 :43. 164ng/mL, S6 :172. 6563ng/mL, S7 :690. 625ng/mL, S8 :2762.5ng/ mL, S9 :11050ng/mL, SlO :44200ng/mLo蛋白懸浮芯片系統根據檢測結果擬合兔抗土拉IgG劑量-反應標準曲線方程FI =-2. 35517+(9047. 57+2. 35517) / [1+(Conc/634. 508) “0· 62963J2'006223、懸浮芯片檢測兔抗土拉IgG的靈敏度和動態范圍根據最低檢出限定義和劑量_反應標準曲線方程，本發明即蛋白懸浮芯片方法檢 測兔抗土拉IgG的靈敏度為5. Ong/mL (Cutoff = 18. 484,MFI (空白對照)=10，標準差= 2. 828)。本發明定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處于飽和狀態的檢測物濃度。根 據標準曲線隨著兔抗土拉IgG濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞增，當兔抗土拉IgG濃 度超過11050ng/mL時，抗原抗體的免疫反應達到飽和狀態，MFI值開始進入平臺期，說明樣 品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定本發明即懸浮芯片定量檢測兔抗土 拉 IgG 的動態范圍為 10. 9710ng/mL 11050ng/mL。4、蛋白懸浮芯片檢測兔抗土拉IgG各編碼微球的熒光值以兔抗土拉抗體濃度為橫坐標，各編碼微球檢測所得的熒光值為縱坐標，不同編 碼微球為Z軸，繪制蛋白懸浮芯片檢測兔抗土拉抗體柱形圖，見圖3。從圖中可以看出在兔 抗土拉抗體濃度為11. 05 μ g/ml和44. 2 μ g/ml時與031號微球包被的登革熱E2蛋白有輕 微交叉反應，其他均無交叉，其特異性較好。實施例5、蛋白懸浮芯片定量檢測兔抗登革熱2型抗體模型的建立1、兔抗登革熱2型抗體標準曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗登革熱2型抗體標準品由濃度為1. 06mg/mL以4倍倍比梯度 稀釋至濃度為4. Ong/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據懸浮芯片系統檢測結 果繪制劑量_反應標準曲線(如圖4所示)。其中，X軸代表樣品濃度，Y軸代表懸浮芯片 儀檢測的熒光值(MFI)。每個數據代表3次的檢測結果平均值，坐標軸以對數-對數關系 設定，圖4中兔抗登革熱2型抗體的濃度分別為=Sl 4. 0436ng/mL, S2 :16· 1743ng/mL, S3 64.6973ng/mL, S4 :258.789ng/mL,S5 :1035.156ng/mL, S6 :4140.625ng/mL, S7 16562. 5ng/ mL, S8 :66250ng/mL, S9 :265000ng/mL，SlO : 1060000ng/mLo蛋白懸浮芯片系統根據檢測結果擬合兔抗登革熱2型抗體劑量-反應標準曲線方 禾呈
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FI = -0. 193944+(27086. 5+0. 193944) / [1+(Conc/71. 9287)7457]L 257193、懸浮芯片檢測兔抗登革熱2型抗體的靈敏度和動態范圍根據最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本發明即蛋白懸浮芯片方法檢 測兔抗土拉IgG的靈敏度為3. 39ng/mL (Cutoff = 30. 62，MFI (空白對照)=28. 5，標準差 =0. 707)。本發明定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處于飽和狀態的檢測物濃度。根 據標準曲線隨著兔抗登革熱2型抗體濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞增，當兔抗登革 熱2型抗體濃度超過66250ng/mL時，抗原抗體的免疫反應達到飽和狀態，MFI值開始進入 平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定本發明即懸浮芯片定量檢測兔抗登 革熱2型抗體的動態范圍為258. 8ng/mL 66. 25 μ g/mL。4、蛋白懸浮芯片檢測兔抗登革熱2型抗體各編碼微球的熒光值以兔抗登革熱2型抗體濃度為橫坐標，各編碼微球檢測所得的熒光值為縱坐標， 不同編碼微球為Z軸，繪制蛋白懸浮芯片檢測兔抗土拉抗體柱形圖，見圖5。實施例6、人血清樣品的檢測1、人血清樣品的準備將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5μ L加樣品稀釋液50μ L混 勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。2、人血清樣品的檢測1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用生物素檢測稀釋液稀釋后的生物素化SPA，混勻后室 溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；
5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經振蕩混勻使微球重懸；6)用懸浮芯片系統讀取MFI數值。經過多次重復試驗，生物素化SPA稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例 選用1 300稀釋，經過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標準差的3倍之 和為作為判斷陰陽性的界值，即Cutoff值，025號編碼微球檢測西尼羅抗體的檢測得到的 Cutoff值為1103，028號編碼微球檢測土拉抗體的Cutoff值為719. 7，031號編碼微球檢測 登革熱抗體的Cutoff值為490. 3，032號編碼微球檢測禽流感抗體的Cutoff值為1591 ；待 檢測血清中各編碼微球檢測對應抗體的MFI值如果大于其Cutoff值，即血清中的對應抗體 濃度過高，可視為對應抗體陽性可能被相應病毒感染，如果MFI值小于對應Cutoff值，即血 清中的相應抗體濃度低于正常值可判斷為相應抗體陰性，未感染相應微生物或是隱性攜帶 者ο
權利要求
一種同步檢測血清樣品中多種抗體的蛋白懸浮芯片，其特征在于，該芯片包括編碼微球，作為包被編碼微球抗原的西尼羅E蛋白、土拉fopA蛋白、登革熱E2蛋白、禽流感H5蛋白，生物素標記的二抗和SPA作為捕獲抗體，鏈親和素 藻紅蛋白和相關緩沖溶液。
2.一種同步檢測多種抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于，在相關緩沖溶液 中，用西尼羅E蛋白抗原包被025號編碼微球、用土拉fopA蛋白抗原包被028號編碼微球、 用登革熱E2蛋白抗原包被031號編碼微球、用禽流感H5蛋白抗原032號編碼微球，用生物 素標記的二抗為羊抗兔IgG或/和Biotin-SPA，用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號 檢測物。
3.一種采用蛋白懸浮芯片同步檢測血清樣品中多種抗體的間接免疫學定量檢測方法， 其特征在于，該方法包括下列步驟1)將若干種蛋白抗原作為捕獲抗原來包被編碼微球；2)向檢測載體內加入含各已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；4)加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；5)加入鏈親和素_藻紅蛋白，孵育后清洗；6)加入檢測緩沖液后混勻；7)用懸浮芯片系統讀取平均熒光強度數值并分析數據判定檢測結果。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中采用生物素標記的SPA 作為捕獲抗體，并且其與相應抗原組合組成間接法檢測體系。
5.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述包被微球的捕獲抗原西尼羅E蛋 白、土拉fopA蛋白、登革熱E2蛋白、禽流感H5蛋白抗原的用量為0. 01 250 μ g/1. 25X106 個編碼微球或0. 004 1000ng/5000個微球/測試。
6.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中各已包被捕獲抗原編碼 微球為，用西尼羅E蛋白抗原包被025號編碼微球、用土拉fopA蛋白抗原包被028號編碼 微球、用登革熱E2蛋白抗原包被031號編碼微球、用禽流感H5蛋白抗原032號編碼微球編 碼微球。
7.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟4)中二抗為羊抗兔IgG或/ 和 Biotin-SPA。
8.如權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述方法中的標記檢測抗體羊抗人IgG 或/和Biotin-SPA的生物素為羧基活性的生物素。
9.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟4)中2mg/mL生物素化的檢測 二抗Bioin-SPA以1 2500稀釋作為檢測物進行檢測。
10.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測載體為96孔濾板或者微量離 心管，所述檢測步驟中全部反應在96孔濾板的孔或者微量離心管內進行。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測血清樣本中多種抗體的蛋白懸浮芯片及其制備方法和使用方法。本發明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態范圍寬，并建立了以西尼羅抗體、土拉抗體、登革熱抗體、禽流感抗體為代表的微生物抗體蛋白懸浮芯片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N21/64GK101936989SQ201010235680
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者孫肖紅, 張曉龍, 曹曉梅, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院