專利名稱：一種發酵液中蘇氨酸含量的快速測定方法
技術領域：
本發明屬于蘇氨酸檢測技術領域，具體涉及一種發酵液中蘇氨酸含量 的快速測定方法。
背景技術：
蘇氨酸發酵液中主要含有一定量的酸和糖，另外還含有一些金屬離 子、維生素、和微量元素等，現在測量發酵液中蘇氨酸含量的主要方法為紙層析法、氨基酸 分析儀法等。紙層析法是行業內最常用的測定發酵液中蘇氨酸含量的方法，但該方法存在 檢測時間長的缺點，從而不能迅速出具數據為發酵生產起指導作用。氨基酸分析儀法測定 結果比較準確，但缺點是費用較高。測定蘇氨酸含量的方法還有高氯酸電位滴定法，此法是在非水介質(如冰乙酸) 中，用高氯酸作滴定劑，結晶紫為指示劑準確滴定蘇氨酸，產物為蘇氨酸的高氯酸鹽，呈酸 性。結晶紫在強酸介質中為綠色，PH2左右為藍色，pH > 3時為紫色，可以指示此反應的滴 定終點。因此，高氯酸電位滴定法只能用于非水滴定測定蘇氨酸，局限于測定固體樣品，不 能測定發酵液中蘇氨酸的含量。發明內容本發明的目的是解決現有技術存在檢測時間長、費用高和有局限性的 技術問題，提供一種發酵液中蘇氨酸含量的快速測定方法，此方法不僅費用低廉，而且能夠 為蘇氨酸實際生產快速準確地提供所要求的檢測數據。本發明發酵液中蘇氨酸含量的快速測定方法，按照以下步驟操作1)、0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液配制在500ml的容量瓶中加入100ml冰醋酸， 移取4. 5ml高氯酸于容量瓶中，然后加入5ml醋酸酐，搖勻，用冰醋酸定容至500ml，靜置過 夜；2)、自動電位滴定儀標定精確稱量0. 15-0. 2g已于105-110°C下干燥2h的基準 試劑鄰苯二甲酸氫鉀，放入100ml燒杯中，用25ml的冰醋酸微熱溶解，用配制好的0. lmol/ L高氯酸的冰醋酸溶液電位標定，按下式計算 式中…一0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定樣品用的體積數，mlV2—0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定空白用的體積數，mlm-—鄰苯二甲酸氫鉀的質量，gM――鄰苯二甲酸氫鉀的相對分子質量，204. 21F0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液的標定值3)、采用高氯酸電位滴定法測定蘇氨酸和還原糖總含量將蘇氨酸發酵液在 8000 10000r/min的轉速下高速離心5 lOmin后，取1ml離心后的上清液注入燒杯中， 然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，小心的將電極插入到燒杯中的液體中，啟動攪拌裝 置，攪拌均勻后，按電位滴定儀面板上的樣品鍵，選擇測定蘇氨酸的方法，輸入樣品體積，啟 動測定鍵，反應開始，樣品自動測定，測定完成后，自動打印測定結果，測量完畢后先關閉攪 拌，取出電極并及時將電極清洗，用干凈的濾紙擦干放入無水甲醇氯化鉀保護液中；4)、采用斐林試劑法測定還原糖含量準確吸取步驟3)中離心后的上清液5ml，用
3蒸餾水稀釋定容至100ml待用，準確移取斐林甲、乙液各5ml于三角瓶內，混勻，吸取0. 5ml 上清液的稀釋液注入此三角瓶中，混勻后，將此三角瓶放在電爐上，加入適量的0. lg/dl標 準葡萄糖液，加熱至沸騰，立即以每3秒1-2滴的速度繼續用0. lg/dl標準葡萄糖液滴定三 角瓶中的溶液，直至藍色剛好消失，此滴定操作需在lmin內完成，在同樣條件下以蒸餾水 代替離心后的上清液做空白對照試驗，按下式計算還原糖的含量 式中X—還原糖含量，g/dlVI-空白滴定時耗0. lg/dl標準葡萄糖液的體積，mlV2-樣品滴定時耗0. lg/dl標準葡萄糖液的體積，ml5)、結果計算采用高氯酸電位滴定法測定的蘇氨酸和還原糖的總含量-0.662X 采用斐林試劑法測定的還原糖的含量=發酵液中蘇氨酸的含量，單位為g/dl。本發明方法只適用于以蔗糖或者葡萄糖為碳源發酵產生的蘇氨酸發酵液。本發明方法通過蘇氨酸發酵液樣品預處理，合理利用高氯酸電位滴定法和斐林試 劑法，實現了測定發酵液中蘇氨酸的含量。由于高氯酸電位滴定是非水滴定，因此通過加入 醋酸酐能迅速與發酵液中的水分反應生成冰乙酸，冰乙酸作為高氯酸電位滴定中非水介質 使用。在高氯酸電位滴定過程中，高氯酸同時與發酵液中的蘇氨酸和還原糖反應，因此采用 斐林試劑法測定還原糖。最終，通過高氯酸電位滴定法測定的結果和斐林試劑法測定還原 糖的結果之間的換算可得到發酵液中蘇氨酸的含量。本發明與現有技術相比所具有的優點在于1)較于紙層析法，大大縮短了檢測時間，在蘇氨酸實際生產過程中能夠快速準確 地提供所要求的檢測數據；2)較于氨基酸分析儀法，節省了檢測費用；3)打破了高氯酸電位滴定法的非水滴定，開創了利用高氯酸電位滴定法測定發酵 液中蘇氨酸含量的先河；4)本發明方法快速、靈敏、準確、精密度高、省時省力。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行詳細論述。實施例1 1)、0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液配制在500ml的容量瓶中加入100ml冰醋酸， 移取4. 5ml高氯酸于容量瓶中，然后加入5ml醋酸酐，搖勻，用冰醋酸定容至500ml，靜置過 夜；2)、自動電位滴定儀標定精密稱量0. 2g已于110°C下干燥2h的基準試劑鄰苯二 甲酸氫鉀，放入100ml燒杯中，用約25ml的冰醋酸微熱溶解，用配制好的0. lmol/L高氯酸 的冰醋酸溶液電位標定，，按下式計算 式中…一0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定樣品用的體積數，mlV2—0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液滴定空白用的體積數，ml
m—鄰苯二甲酸氫鉀的質量，gM――鄰苯二甲酸氫鉀的相對分子質量，204. 21F0. lmol/L高氯酸的冰醋酸溶液的標定值3)、采用高氯酸電位滴定法測定蘇氨酸和還原糖總含量取5ml蘇氨酸發酵液樣 品1#，將其在lOOOOr/min的轉速下高速離心5min后，取1ml離心后的上清液注入燒杯中， 然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，小心的將電極插入到燒杯中的液體中，啟動攪拌裝 置，攪拌均勻后，按電位滴定儀面板上的樣品鍵，選擇測定蘇氨酸的方法，輸入樣品質量，啟 動測定鍵，反應開始，樣品自動測定，測定完成后，自動打印測定結果，測量完畢后先關閉攪 拌，取出電極并及時將電極清洗，用干凈的濾紙擦干放入保護液(無水甲醇氯化鉀飽和溶 液活化電極)中；4)、采用斐林試劑法測定還原糖含量準確吸取樣品1#離心后的上清液5ml，用蒸 餾水稀釋定容至100ml待用，準確移取斐林甲、乙液各5ml于三角瓶內，混勻，吸取0. 5ml上 清液的稀釋液注入此三角瓶中，混勻后，將此三角瓶放在電爐上，加入適量的0. lg/dl標準 葡萄糖液，加熱至沸騰，立即以每3秒1-2滴的速度繼續用0. lg/dl標準葡萄糖液滴定三角 瓶中的溶液，直至藍色剛好消失(此滴定操作需在lmin內完成)，在同樣條件下以蒸餾水代 替離心后的上清液做空白對照試驗，， 式中X—還原糖含量，g/dlVI-空白滴定時耗0. lg/dl標準葡萄糖液的體積，mlV2-樣品滴定時耗0. lg/dl標準葡萄糖液的體積，ml5)、結果計算采用高氯酸電位滴定法測定的蘇氨酸和還原糖的總含量-0.662X 采用斐林試劑法測定的還原糖的含量=發酵液中蘇氨酸的含量，單位為g/dl ；6)、蘇氨酸發酵液樣品1#按照以上步驟重復測定5次；7)、取蘇氨酸發酵液樣品2#、樣品3#，均按照以上步驟進行測定。測定蘇氨酸發酵液樣品1#、樣品2#、樣品3#中蘇氨酸含量見下表表1重復試驗測定結果(n = 5)單位g/dl 表2精密度計算結果(n = 5) 表2可見，以上實驗結果相對標準偏差都小于0. 5%，精密度較高。實施例2 分別取5ml蘇氨酸發酵液樣品4#、樣品5#、樣品6#，按照實施例1中步驟1) 5) 操作，分別測得蘇氨酸發酵液樣品4#、樣品5#、樣品6#中蘇氨酸的含量。同時采用紙層析 法對蘇氨酸發酵液樣品4#、樣品5#、樣品6#進行對比測定，兩種方法測定結果見表3 表3兩種方法測定結果對比 由表3可見，兩種方法對蘇氨酸發酵液樣品4#、樣品5#、樣品6#的測定結果一致 性較好。實施例3 分別取5ml蘇氨酸發酵液樣品7#、樣品8#、樣品9#，按照實施例1中步驟1) 5) 操作，分別測得蘇氨酸發酵液樣品7#、樣品8#、樣品9#中蘇氨酸的含量。同時采用氨基酸 分析儀法對蘇氨酸發酵液樣品7#、樣品8#、樣品9#進行對比測定，兩種方法測定結果見表 4 表4兩種方法測定結果對比 由表4可見，兩種方法對蘇氨酸發酵液樣品7#、樣品8#、樣品9#的測定結果一致 性較好。
權利要求
一種發酵液中蘇氨酸含量的快速測定方法，其特征是按照以下步驟操作1)、將蘇氨酸發酵液在8000～10000r/min的轉速下高速離心5～10min后，取1ml離心后的上清液注入燒杯中，然后再加入5ml醋酸酐、50ml冰乙酸，攪拌均勻后，用自動電位滴定儀，按照高氯酸電位滴定法進行操作，當測定完成后，得到高氯酸電位滴定法測定的結果；2)采用斐林試劑法測定離心后的上清液中的還原糖，得到斐林試劑法測定還原糖的含量；3)結果計算高氯酸電位滴定法測定的蘇氨酸和還原糖的總含量 0.662×斐林試劑法測定還原糖的含量＝發酵液中蘇氨酸的含量，單位為g/dl。
全文摘要
本發明公開了一種發酵液中蘇氨酸含量的快速測定方法，首先將蘇氨酸發酵液離心，取上清液加入醋酸酐、冰乙酸，攪拌均勻后，用自動電位滴定儀，按照高氯酸電位滴定法進行操作得到高氯酸電位滴定法測定的結果；再采用斐林試劑法測定離心后的上清液中的還原糖，得到斐林試劑法測定還原糖的結果；然后按高氯酸電位滴定法測定的蘇氨酸和還原糖的含量-0.662×斐林試劑法測定還原糖的含量＝發酵液中蘇氨酸的含量，單位為g/dl進行計算即可。本發明較紙層析法，大大縮短了檢測時間；較氨基酸分析儀法，節省了檢測費用；并打破了高氯酸電位滴定法的非水滴定限制。它具有快速、靈敏、準確、精密度高、省時省力的特點。
文檔編號G01N27/42GK101923066SQ201010234629
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者喬連生, 劉元濤, 姜守剛, 張春宇, 徐國華, 王均成, 郭英熙 申請人:山東阜豐生物科技開發有限公司