專利名稱：一種用于特異性檢測新型h1n1流感病毒的合成多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于特異性檢測新型Hmi流感病毒的合成多肽。
背景技術：
流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是一類具有高度傳染性的呼吸道病毒，也是被列 入生物恐怖武器的其中一種。目前檢測新型Hmi流感病毒的方法主要有病毒分離培養、逆 轉錄多聚酶聯反應(RT-PCR)、血清學診斷和抗原檢測。但是，流感病毒分離鑒定所需的時間 長、成本高，且需要在生物安全實驗室或國家指定研究機構進行，而RT-PCR則依賴于特定 的設備、良好的實驗室條件和高素質的技術人員，難以在邊境口岸推廣應用，因此，亟待研 究建立一種新型Hmi流感病毒快速、有效的抗原診斷技術。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種用于特異性檢測新型Hmi 流感病毒的合成多肽。為實現上述目的，本發明特異性合成多肽序列為CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。上述特異性合成多肽的篩選方法為(1)從NCBI數據庫中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用DNA-STAR進 行序列比對和同源性分析比對，篩選出HA分子中信號肽之后到蛋白酶切位點之間具有良 好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區段和500-520區段作為候選片段；(2)將篩選出的候選肽段與載體蛋白偶聯，獲得免疫抗體，通過特異性抗體的篩 選，最終得到對新型Hmi流感病毒具有特異性的合成多肽，該多肽的位點為322-340，其序 列為CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。進一步，所述載體蛋白為KLH血藍蛋白。上述步驟⑵具體為以包被免疫家兔的偶聯多肽檢測免疫血清，當兔多抗血清滴度已經達到 1 100000，進行終放血，收獲血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對免疫兔的多克隆血清抗體進 行篩選，其中，包被液稱取Na2CO3O. 15g，NaHCO3O. 293g，蒸餾水稀釋至 100ml，得到 0. 05mol/L PH9.6碳酸緩沖液，4°C，保存；洗滌液(稀釋液)稱取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液，4°C，保存；封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式進行ELISA實驗，并根據實驗結果篩選出對新型Hmi流感病毒具 有特異性的合成多肽，即
1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱保存 至少12h ；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置2min，反復三次，最后將反應板倒置 在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加封閉液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗滌同 2)；5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋，反應板每孔加lOOul，同時作稀 釋液對照，37 °C放置Ih;6)洗滌同 2)；7)加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，反應板每孔lOOul，37°C放置 lh;8)洗滌同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min ；10)加終止液反應板每孔50ul ；11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄490nm讀數。本發明特異性合成多肽具有抗原制備簡單，不存在生物安全問題，且比天然微生 物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低等優點，綜合流 感病毒的診斷方法情況，以及當前全球防控流感的嚴峻形勢，本發明無疑具有較大的市場 價值和社會效益。
具體實施例方式下面結合實例對本發明進行詳細說明。本發明特異性合成多肽的篩選方法包括如下步驟(1)肽抗原表位的生物信息學選擇與合成、修飾從NCBI數據庫中搜索流感病毒的HA氨基酸序列，用已知DNA-STAR和 antheprot5. 0分析顯示，330-350之間部分無論在抗原性、親水性還是易溶性分析都是很 好的候選片段；在400位下游存在大量的α螺旋結果，且主要位于疏水性片段，而且該區段 變異度很低，序列穩定，因此判斷為可能的穿膜部分，該區域放棄。但該區域(500-520)之 后有較短的變異較大的區域，且該部分抗原性和親水性均很強。同時，流感病毒的各亞型的 表位線性肽的序列如表1和表2所示。表 1 表2 故在330-350和500-520區域中，選擇不同亞型的差異性片段合成十條備選多肽， 見表3。表 3 (2)抗體的制備以包被免疫家兔的偶聯多肽檢測免疫血清，當兔多抗血清滴度已經達到 1 100000，進行終放血，收獲血清，各多肽的免疫血清抗體效價達到1 100000時的P/N 值見表4。
表 4 (3)合成多肽免疫血清中特異性抗體的篩選ELISA實驗的建立利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對免疫兔的多克隆血清抗體進 行篩選。1.實驗材料與試劑HlNl、H3N2、新甲型Hmi流感病毒疫苗株來自長春生物制品所。酶標羊抗兔IgG抗體購自Sigma公司
96孔酶標板購自欣經科公司牛血清白蛋白(BSA)購自Roch公司Tween20 購自 Sigma 公司。包被液稱取Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g,蒸餾水稀釋至 100ml，即為 0. 05mol/L pH9. 6 (包被液)碳酸緩沖液，40C，保存；洗滌液(稀釋液)稱取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液(稀釋液)，4°C，
保存；封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液。2. ELISA 步驟
1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋，反應板每孔加lOOul，4°C冰箱保存 至少12h ；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置2min，反復三次，最后將反應板倒置 在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加封閉液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗滌同 2)；5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋，反應板每孔lOOul，同時作稀釋 液對照，37 °C放置lh；6)洗滌同 2)；7)加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，每孔lOOul，37°C放置Ih ；8)洗滌同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min ；10)加終止液每孔50ul ；11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄490nm讀數。3. ELISA實驗結果見表5表5 結果判讀若P/N> 2. 1時，則可以判定為陽性。從表5中可以看出，免疫血清 KLH-NH1N1-1與新型HlNl反應的P/N值為6. 09，與其它的血清的P/N值相比較，有很大的 差異。同時，血清KLH-NHim-I與病毒HlNl和H3N2的P/N值均小于2. 1，判為陰性。由此 說明，免疫血清KLH-NHmi-1可以特異性的與新型Hmi病毒反應。因此，由合成多肽X2與 KLH偶聯后免疫得到的血清，可以用于特異性檢測新型Hmi流感病毒。
權利要求
一種用于快速檢測新型H1N1流感病毒的特異性合成多肽，其特征在于，所述特異性合成多肽的序列為CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。
2.—種權利要求1所述特異性合成多肽的篩選方法，其特征在于，具體如下(1)從NCBI數據庫中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用已知DNA-STAR進 行序列比對和同源性分析比對，篩選出HA分子中信號肽之后到蛋白酶切位點之間具有良 好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區段和500-520區段作為候選片段；(2)將篩選出的候選肽段與載體蛋白偶聯，獲得免疫抗體，通過特異性抗體的篩選，最 終得到對新型Hmi流感病毒具有特異性的合成多肽，該多肽的位點為322-340，其序列為 CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。
3.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述載體蛋白為KLH血藍蛋白。
4.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為以包被免疫家兔的偶聯多肽檢測免疫血清，當兔多抗血清滴度已經達到1 100000， 進行終放血，收獲血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對免疫兔的多克隆血清抗體進行篩 選，其中，包被液稱取 Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g，蒸餾水稀釋至 100ml，得到 0. 05mol/L pH9. 6 碳酸緩沖液，4°C，保存；洗滌液(稀釋液)稱取 NaCl 8g，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸餾水加至 1000ml,即為 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗滌液，4°C，保存；封閉液5%脫脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；終止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式進行ELISA實驗，并根據實驗結果篩選出對新型Hmi流感病毒具有特 異性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液將病毒作1000倍稀釋，反應板每孔加100ul，4°C冰箱過夜(12h 以上)；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置2min，反復三次，最后將反應板倒置在吸 水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加封閉液200ul，37°C放置Ih；4)洗滌同2)；5)加抗體兔免疫血清用封閉液1 500倍稀釋，反應板每孔加lOOul，同時作稀釋液 對照，37 °C放置lh；6)洗滌同2)；7)加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀釋)，反應板每孔lOOul，37°C放置Ih;8)洗滌同2)；9)加底物加TMBlOOml，室溫暗處放置15min；10)加終止液反應板每孔50ul；11)觀察結果用酶聯免疫檢測儀記錄490nm讀數。
全文摘要
本發明公開了一種用于快速檢測新型H1N1流感病毒的特異性合成多肽，其序列為CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。本發明特異性合成多肽具有抗原制備簡單，不存在生物安全問題，且比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低等優點，綜合流感病毒的診斷方法情況，以及當前全球防控流感的嚴峻形勢，本發明無疑具有較大的市場價值和社會效益。
文檔編號G01N33/569GK101906151SQ20101023301
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月21日 優先權日2010年7月21日
發明者平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 王琳, 胡孔新, 郭雪, 馬雪征 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院