專利名稱：絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法
技術領域：
本發明涉及安培免疫傳感器中的絲網印刷電極，具體涉及絲網印刷電極的癌胚抗 原工作電極的制備方法。
背景技術：
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一種多糖蛋白復合物，屬于非器官 特異性腫瘤相關抗原，是腫瘤診斷和病情監測中最常用的腫瘤標志物之一。分泌CEA的腫 瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。正常情況下，CEA經胃腸道代謝，而腫 瘤狀態時的CEA則進入血液和淋巴循環，引起血清CEA異常增高，如結/直腸癌、肺癌、乳腺 癌、膀胱癌和卵巢癌患者中，血清CEA量會明顯升高，尤其是CEA被臨床認為是結/直腸癌 的特異性腫瘤標志物。目前臨床檢測血清中CEA方法，主要有放射免疫法(RIA)、化學發光 法(CL)、時間分辨免疫熒光分析法(TRFIA)以及酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)。RIA法雖然 有較好的靈敏度，但穩定性欠佳，且有放射性污染之嫌，操作時間長。CL法雖然有較好的靈 敏度和穩定性，但目前試劑和儀器全部為進口產品，成本相對較高。TRFIA法需要稀土離子 標記抗原或抗體，標記物制備復雜，耗時且由于各批次檢測結果均采用同一標準曲線定量， 所以標準曲線要求很高。ELISA法靈敏度及穩定性不夠好，假陽性較高。安培免疫傳感器中的絲網印刷電極(SPCEs)結合了電化學檢測的高靈敏度和免 疫分析的高特異性，具有樣品用量小、檢測快速，結果準確等突出優點，已應用于免疫標志 物檢測。如公開號為CN1908665的發明專利申請，就公開了該傳感器包括反應池、金薄膜的 工作電極、鉬薄膜的對電極和參比電極的絲網印刷電極，該工作電極上固定有“混合自組裝 膜_納米金_蛋白質_抗體”組成的生物分子敏感膜，該生物分子敏感膜制備方法是先在 工作電極表面涂上H2O2和H2SO4混合液，其次涂上巰基化合物，然后涂上納米金溶膠，最后滴 涂有定向固定在蛋白質的待測抗原對應的抗體。另如公開號為CN101532980的發明專利申 請，其公開的絲網印刷電極的工作電極上固定有“酶標記志賀氏菌抗體-碳納米管-殼聚 糖”組成的敏感膜，該敏感膜制備方法是先將碳納米管與殼聚糖溶膠混合，再加入酶標記 志賀氏菌抗體得到酶標記志賀氏菌抗體_碳納米管_殼聚糖混合物，然后將酶標記志賀氏 菌抗體_碳納米管_殼聚糖混合物涂于絲網印刷電極的工作電極表面，涂膜后的工作電極 用含02 %牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液保存。但目前安培傳感器存在以下不足1、在使用時需要外加二茂鐵或鐵氰化鉀等電子 媒介體(eT)于反應池中進行檢測，這增加了免疫分析系統的復雜性，導致工作電極表面的 抗體易失活，靈敏度和使用壽命受到很大影響；2、工作電極多為一次性使用，電極不能再 生，原因是工作電極表面的抗體發生免疫結合反應后，免疫生成物很難除去；3、對背景非常 復雜的具體檢測對象(如血清樣品)，往往需通過一定的樣品提純處理后再進行檢測，增加 了檢測時間、檢測過程，降低了檢測的準確性。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測的血清樣品不必提純處理，使用時無 需外加電子媒介體，每次使用后電極表面可再生的絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制 備方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為絲網印刷電極的癌胚抗原工作電 極的制備方法，包括下述步驟1)將濃度為0. 01 0. Imol · L—1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液 5 IOmL置于離心管中，再加入濃度為Img · ml/1金磁納米微粒(簡稱GMP 以四氧化三鐵 為核納米金為殼，購自美國sigma公司)溶液5 10 μ L和濃度為1 3mg · mL^CEA抗體 溶液10 μ L，在25 37°C下振蕩反應20 30分鐘；2)將上述離心管置于磁性分離器中，在0. 1 0. 3mT的磁場下磁性分離3 10分 鐘，棄上清液，這樣CEA抗體就包被在GMP表面；3)再在離心管中加入pH7. 0濃度為0. 2 Imol化―1的磷酸鹽緩沖液(PBS) 5mL和 濃度為10 15mg -mr1的牛血清蛋白(BSA)溶液5 μ L，室溫下攪拌1小時，在0. 1 0. 3mT 的磁場下磁性分離3 10分鐘，棄上清液，重復本步驟3次，得到金磁納米微粒-CEA抗體 溶液備用；經本步驟3次，進一步封閉包被CEA抗體，同時未包被的CEA抗體被分離；4)在工作電極表面滴涂含有普魯斯藍濃度為2 5mol ·廠1和聚四氟乙烯質量百 分濃度為5%的水溶液2-5μ L，室溫干燥后，得到固定有聚四氟乙烯陽離子交換膜(Nafion 膜)的工作電極；一般干燥5-10分鐘，工作電極表面就形成Nafion膜；上述含普魯斯藍和 聚四氟乙烯的水溶液的用量依工作電極大小而定，以滴涂完工作電極表面為準；5)在20 25 μ L濃度為0. 2 Imol · L—1的磷酸鹽緩沖液中，加入上述金磁納米 微粒-CEA抗體溶液2 5 μ L，然后將固定有聚四氟乙烯陽離子交換膜的工作電極浸入該磷 酸鹽緩沖液中，同時在該工作電極的背面加上0. 1 0. 3mT的磁場，讓金磁納米微粒-CEA 抗體吸附于聚四氟乙烯的陽離子交換膜上，磁場作用10分鐘，得到金磁納米微粒-CEA抗 體-聚四氟乙烯陽離子交換膜的癌胚抗原工作電極。所述的CEA抗體為辣根過氧化物酶標記鼠抗人CEA單克隆抗體、辣根過氧化物酶 標記羊抗人CEA單克隆抗體或辣根過氧化物酶標記羊抗鼠CEA單克隆抗體(這些CEA單克 隆抗體均購自美國sigma公司)。所述金磁納米微粒的直徑為10-50納米。上述GMP溶液、CEA抗體溶液、BSA溶液都為水溶液。與現有技術相比，本發明的優點在于絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方 法，通過CEA抗體和金磁納米微粒的溶液混合，然后經CEA抗體包被在金磁納米微粒表面的 封閉處理，包被的CEA抗體被封閉固定，未包被的CEA抗體被分離，得到金磁納米微粒-CEA 抗體溶液，另外通過工作電極表面形成Nafion膜，然后將得到的金磁納米微粒-CEA抗體吸 附于Nafion膜上，得到金磁納米微粒-CEA抗體-聚四氟乙烯的陽離子交換膜的癌胚抗原 工作電極；該癌胚抗原工作電極可用于定性定量測定血清中的癌胚抗原的免疫傳感器中， 在測定時反應池中無需外加電子媒介體(如二茂鐵或鐵氰化鉀等)，血清樣品也不必提純 處理，直接加入反應池中就可以進行免疫應答反應，使用后只需移去外加磁場，即可將其表 面免疫生成物洗脫而實現電極表面更新，達到工作電極可再生利用；因此本發明是一種檢測的血清樣品不必提純處理，使用時無需外加電子媒介體，每次使用后電極表面可再生的 絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法。
圖1為裝有本發明的癌胚抗原工作電極的安培免疫傳感器示意圖；圖2為CEA抗原濃度與電流下降絕對值的線性關系示意圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1一種絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法，包括下述步驟1)將濃度為0. 01 0. Imol · L^Tris-HCl緩沖液5 IOmL置于離心管中，然后 加入濃度為Img ' ιιΓ1直徑為10-50納米的GMP溶液5 10 μ L和濃度為1 3mg Γ1的 辣根過氧化物酶標記鼠抗人CEA單克隆抗體溶液10 μ L，在25 37°C下振蕩反應20 30 分鐘；2)將上述離心管置于磁性分離器中，在0. 1 0. 3mT的磁場下磁性分離3 10分 鐘，棄上清液，這樣CEA抗體就包被在GMP表面；3)再在離心管中加入pH為7. 0濃度為0. 2 Imol · L—1的PBS緩沖液5mL和濃 度為10 15mg · ml/1的BSA溶液5 μ L，室溫下攪拌1小時，在0. 1 0. 3mT的磁場下磁性 分離3 10分鐘，棄上清液，第二次加相同的PBS緩沖液和BSA溶液、攪拌、磁性分離和棄 上清液，第三次加相同的PBS緩沖液和BSA溶液、攪拌、磁性分離和棄上清液，這樣經3次重 復磁性分離，進一步封閉包被CEA抗體，同時未包被的CEA抗體被分離，最后得到金磁納米 微粒-CEA抗體溶液備用；4)在工作電極表面滴涂含有普魯斯藍濃度為2 5mol ·廠1和聚四氟乙烯質量百 分濃度為5%的水溶液2-5μ L，室溫干燥后，得到固定有聚四氟乙烯陽離子交換膜(Nafion 膜)的工作電極；一般干燥5-10分鐘，工作電極表面就形成Nafion膜；5)在20 25 μ L濃度為0. 2 Imol · L—1的PBS緩沖液中，加入上述金磁納米微 粒-CEA抗體溶液2 5 μ L，然后將固定有Nafion膜的工作電極浸入該磷酸鹽緩沖液中，同 時在該工作電極的背面加上0. 1 0. 3mT的磁場，讓金磁納米微粒-CEA抗體吸附于Nafion 膜上，磁場作用10分鐘，得到金磁納米微粒-CEA抗體-聚四氟乙烯陽離子交換膜的癌胚抗 原工作電極。上述Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、BSA溶液的濃度大小，用量多少與GMP溶液濃 度和CEA抗體溶液的量成正相關。實施例2與實施例1基本相同，所不同的只是辣根過氧化物酶標記鼠抗人CEA單克隆抗體 由辣根過氧化物酶標記羊抗人CEA單克隆抗體或辣根過氧化物酶標記羊抗鼠CEA單克隆抗 體替代。應用例首先將本發明的癌胚抗原工作電極制成如圖1所示的安培免疫傳感器，該安培免疫傳感器包括絲網印刷電極、電極接頭e、絕緣層d和連接導線f，連接導線f可與電化學工 作站相連，該絲網印刷電極包括癌胚抗原工作電極a、參比電極b和碳對電極c，然后用該 安培免疫傳感器檢測添加有不同CEA抗原濃度(0，0. 1,0. 5,1. 5,3. 5,5. 0，10，20，40，60和 80ng/mL)的血清樣品，檢測方法為在反應池中先加入pH 6. 5含有H2O2的磷酸鹽緩沖溶 液，再加入3 20 μ L血清樣品，并在25 35°C下溫育10 15min，采用示差脈沖伏安法 (DPV)測定還原峰電流。由于溶液中CEA抗原與電極表面CEA抗體發生免疫反應，如圖2所 示當被測CEA抗原濃度越高時DPV響應電流也越小。這是因為CEA抗原濃度提高后，溶液 中恒量的CEA抗體與電極表面CEA抗原結合形成免疫復合物機會增大，對電子媒介體電子 傳遞阻礙增加，因此DPV還原峰電流隨著CEA抗原濃度的增加不斷下降。
權利要求
絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法，其特征在于包括下述步驟1)將濃度為0.01～0.1mol·L 1的三羥甲基氨基甲烷 鹽酸緩沖液5～10mL置于離心管中，再加入濃度為1mg·mL 1的金磁納米微粒溶液5～10μL和濃度為1～3mg·mL 1的CEA抗體溶液10μL，在25～37℃下振蕩反應20～30分鐘；2)將上述離心管置于磁性分離器中，在0.1～0.3mT的磁場下磁性分離3～10分鐘，棄上清液；3)再在離心管中加入pH7.0濃度為0.2～1mol·L 1的磷酸鹽緩沖液5mL和濃度為10～15mg·mL 1的牛血清蛋白溶液5μL，室溫下攪拌1小時，在0.1～0.3mT的磁場下磁性分離3～10分鐘，棄上清液，重復本步驟3次，得到金磁納米微粒 CEA抗體溶液備用；4)在工作電極表面滴涂含有普魯斯藍濃度為2～5mol·L 1和聚四氟乙烯質量百分濃度為5％的水溶液2 5μL，室溫干燥后，得到固定有聚四氟乙烯陽離子交換膜的工作電極；5)在20～25μL濃度為0.2～1mol·L 1的磷酸鹽緩沖液中，加入上述金磁納米微粒 CEA抗體溶液2～5μL，然后將固定有聚四氟乙烯陽離子交換膜的工作電極浸入該磷酸鹽緩沖液中，同時在該工作電極的背面加上0.1～0.3mT的磁場，讓金磁納米微粒 CEA抗體吸附于聚四氟乙烯的陽離子交換膜上，磁場作用10分鐘，得到金磁納米微粒 CEA抗體 聚四氟乙烯陽離子交換膜的癌胚抗原工作電極。
2.如權利要求1所述的絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法，其特征在于所 述的CEA抗體為辣根過氧化物酶標記鼠抗人CEA單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗人 CEA單克隆抗體或辣根過氧化物酶標記羊抗鼠CEA單克隆抗體。
3.如權利要求1所述的絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法，其特征在于所 述的金磁納米微粒的直徑為10-50納米。
全文摘要
本發明公開了絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法，通過CEA抗體和金磁納米微粒的溶液混合，然后經CEA抗體包被在金磁納米微粒表面的封閉處理，包被的CEA抗體被封閉固定，未包被的CEA抗體被分離，得到金磁納米微粒-CEA抗體溶液，另外通過工作電極表面形成Nafion膜，然后將得到的金磁納米微粒-CEA抗體吸附于Nafion膜上，得到金磁納米微粒-CEA抗體-聚四氟乙烯的陽離子交換膜的癌胚抗原工作電極；本發明是一種檢測的血清樣品不必提純處理，使用時無需外加電子媒介體，每次使用后電極表面可再生的絲網印刷電極的癌胚抗原工作電極的制備方法。
文檔編號G01N33/543GK101923092SQ20101021652
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者余淑萍, 周瑾, 姜晶晶, 干寧, 楊欣 申請人:寧波大學