專利名稱：一種基于納米技術的微量蛋白質檢測方法
技術領域：
一種基于納米技術的微量蛋白質檢測方法，屬于分析生物化學技術領域。
背景技術：
測量微量的蛋白質在疾病診斷和生物醫學研究中是必不可少的。但目前所用的測 定方法有靈敏度和線性范圍差的缺點。例如，前列腺特異性抗原(PSA)是一種由hKLK3基 因編碼的，由前列腺上皮細胞分泌的單鏈糖蛋白，具有糜蛋白酶活性，分子量大約34000g/ mol。PSA作為生物標志物，被廣泛應用于疾病的篩選、診斷及治療后的監測。但在人體血清 中PSA的含量極低。因此，對檢測方法的檢測限和靈敏度提出了較高的要求。免疫酶聯吸附實驗是目前廣泛應用于臨床檢測的免疫分析方法，具有很高的特異 性。免疫酶聯吸附實驗的工作原理基于抗原或抗體的固定以及抗原或抗體的酶標記。將抗 原或抗體吸附于固相載體表面，結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性； 抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，這種酶標記的抗原或抗體既保留其免疫 學活性，又保留酶的活性。由酶的催化效率很高，間接放大了免疫反應的結果，使測定方法 達到很高的靈敏度。目前，常用辣根過氧化物酶標記抗體，辣根過氧化物酶不僅能催化化學發光，而且 能在一定條件下，催化biotin-tyramide生成大量的biotin活化分子結合到抗原抗體結合 部位附近的蛋白質的氨基酸殘基上，產生大量的biotin沉積。該技術被稱為酪胺信號放 大。如果利用biotin標記的DNA修飾的金納米顆粒與鏈酶親和素修飾的金納米顆粒發生 的聚集現象應用于該實驗，可實現對信號的進一步放大。本方法通過免疫酶聯吸附實驗實現檢測方法的特異性，通過酪胺信號放大技術及 金納米顆粒聚集現象實現信號的放大，在蛋白質測定中達到了極低檢測限、高靈敏度和較 寬檢測范圍的目的。
發明內容
本發明的目的是提供一種基于免疫酶聯吸附技術，酪胺信號放大技術及金納米顆 粒聚集現象檢測微量PSA等蛋白質，這種方法具有較寬的線性范圍、極低的檢測限以及較 高的精密度。本發明的技術方案一種基于免疫酶聯吸附技術，酪胺信號放大技術及金納米顆 粒聚集現象檢測微量PSA或其它蛋白質的方法，其特征是步驟為(1)在固相上利用雙抗體 夾心法捕捉待測蛋白質；(2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素 沉積；(3)金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗；(4)掃描及數據分析。(1)在固相上利用雙抗體夾心法捕捉蛋白質利用免疫酶聯吸附方法捕捉PSA等 蛋白質并使之結合上有辣根過氧化物酶活性的抗體；例如，將PSA單克隆抗體稀釋成一定濃度的溶液，各取1 μ L點于環氧基基片上，置 于溫箱中，37°C抽真空過夜后，將基片取出，在反應池中加入10%的BSA溶液封閉，室溫封閉5h后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘貼圍欄，用兔血清稀釋PSA標準品，將其濃度 依次稀釋為 5fg/ μ L，2. 5fg/ μ L，125ag/ μ L，6. 25ag/ μ L 和 330. 5zg/ μ L，各取 20 μ L 將一 系列濃度的PBS溶解的PSA標準品加入到圍欄內，于4°C孵育過夜。孵育過夜后，將基片取 出，用PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀釋的PSA另一種具有辣根過氧化物酶活性的單克隆 抗體，孵育一段時間后，用PBST溶液清洗。 (2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積加入 biotin-tyramide溶液，在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積；
在基片上加入biotin-tyramide溶液，對照組不加入biotin-tyramide溶液，反應 一段時間后用PBST溶液清洗。(3)金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗不同生物分子修飾的金 納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集并使用銀染方法進一步放大信號；利用巰基與金納米顆粒的相互作用，將biotin標記的DNA修飾到金納米顆粒表 面，利用蛋白質與金納米顆粒的靜電吸附作用將鏈霉親和素修飾到金納米顆粒表面，從而 制備出兩種不同生物分子修飾的金納米顆粒。在放置有基片的反應池中加入一定量的鏈 霉親和素修飾的金納米顆粒(SA-AuNP)，孵育一段時間。PBST清洗后，再向反應池中加入一 定量的biotin標記的DNA修飾的金納米顆粒(biotin-DNA-AuNP)，孵育一段時間。之后用 PBST清洗，重復上述金納米顆粒孵育過程，孵育結束后對基片進行銀染。將銀染試劑A液 和B液混合，加入到放置有基片的反應槽中，浸泡一段時間，取出，清洗后，加入一定濃度的 硫代硫酸鈉溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)掃描及數據分析；將芯片烘干后，置于掃描儀上掃描，圖像結果使用ImageJ分析其灰度值，然后用 Origin軟件進行數據分析。
圖1金納米顆粒的電子顯微鏡照片。圖2金納米顆粒的紫外可見吸光光譜圖。圖3AuNP，biotin-DNA-AuNP及SA-AuNP的紫外可見吸光光譜圖。圖4基片反相圖片。圖5基片上抗原質量與灰度值之間的線性關系標準曲線。
具體實施例方式其特征是步驟為(1)在固相上利用雙抗體夾心法捕捉PSA或其它待測蛋白質樣 品；(2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積；(3)金納米顆粒 在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗；(4)掃描及數據分析。(1)在固相上利用雙抗體夾心法捕捉PSA或其它待測蛋白質樣品利用免疫酶聯 吸附方法捕捉PSA并使之結合上有辣根過氧化物酶活性的抗體；將PSA單克隆抗體稀釋成一定濃度的溶液，各取1 μ L點于環氧基基片上，置于溫 箱中，37°C抽真空過夜后，將基片取出，在反應池中加入10%的BSA溶液封閉，室溫封閉5h 后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘貼圍欄，用兔血清稀釋PSA標準品，將其濃度依次稀釋為 5fg/ μ L，2. 5fg/ μ L，125ag/ μ L，6. 25ag/ μ L 和 330. 5zg/ μ L，各取 20 μ L 將一系列濃 度的PBS溶解的PSA標準品加入到圍欄內，于4°C孵育過夜。孵育過夜后，將基片取出，用 PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀釋的PSA另一種具有辣根過氧化物酶活性的單克隆抗體， 孵育一段時間后，用PBST溶液清洗。(2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積加入 biotin-tyramide溶液，在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積；在基片上加入biotin-tyramide溶液，對照組不加入biotin-tyramide溶液，反應 一段時間后用PBST溶液清洗。(3)金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗不同生物分子修飾的金 納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集并使用銀染方法進一步放大信號；利用巰基與金納米顆粒的相互作用，將biotin標記的DNA修飾到金納米顆粒表 面，利用蛋白質與金納米顆粒的靜電吸附作用將鏈霉親和素修飾到金納米顆粒表面，從而 制備出兩種不同生物分子修飾的金納米顆粒。在放置有基片的反應池中加入一定量的鏈 霉親和素修飾的金納米顆粒(SA-AuNP)，孵育一段時間。PBST清洗后，再向反應池中加入一 定量的biotin標記的DNA修飾的金納米顆粒(biotin-DNA-AuNP)，孵育一段時間。之后用 PBST清洗，重復上述金納米顆粒孵育過程，孵育結束后對基片進行銀染。將銀染試劑A液 和B液混合，加入到放置有基片的反應槽中，浸泡一段時間，取出，清洗后，加入一定濃度的 硫代硫酸鈉溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)掃描及數據分析；將芯片烘干后，置于掃描儀上掃描，圖像結果使用ImageJ分析其灰度值，然后用 Origin軟件進行數據分析。
權利要求
一種基于納米技術的微量蛋白質檢測方法一種基于納米技術的微量蛋白質檢測方法，其特征是步驟為(1)在固相上利用雙抗體夾心法捕捉待測蛋白質；(2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積；(3)金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗；(4)掃描及數據分析。(1)在固相上利用雙抗體夾心法捕捉PSA或其它目標蛋白質利用免疫酶聯吸附方法捕捉PSA等蛋白質并使之結合上有辣根過氧化物酶活性的抗體；例如，將PSA單克隆抗體稀釋成一定濃度的溶液，各取1μL點于環氧基基片上，置于溫箱中，37℃抽真空過夜后，將基片取出，在反應池中加入10％的BSA溶液封閉，室溫封閉5h后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘貼圍欄，用兔血清稀釋PSA標準品，將其濃度依次稀釋為5fg/μL，2.5fg/μL，125ag/μL，6.25ag/μL和330.5zg/μL，各取20μL將一系列濃度的PBS溶解的PSA標準品加入到圍欄內，于4℃孵育過夜。孵育過夜后，將基片取出，用PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀釋的PSA另一種具有辣根過氧化物酶活性的單克隆抗體，孵育一段時間后，用PBST溶液清洗。(2)利用酪胺信號放大技術在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積加入biotin tyramide溶液，在抗原抗體結合部位產生大量生物素沉積；在基片上加入biotin tyramide溶液，對照組不加入biotin tyramide溶液，反應一段時間后用PBST溶液清洗。(3)金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集及銀染實驗不同生物分子修飾的金納米顆粒在生物素沉積部位相互聚集并使用銀染方法進一步放大信號；利用巰基與金納米顆粒的相互作用，將biotin標記的DNA修飾到金納米顆粒表面，利用蛋白質與金納米顆粒的靜電吸附作用將鏈霉親和素修飾到金納米顆粒表面，從而制備出兩種不同生物分子修飾的金納米顆粒。在放置有基片的反應池中加入一定量的鏈霉親和素修飾的金納米顆粒(SA AuNP)，孵育一段時間。PBST清洗后，再向反應池中加入一定量的biotin標記的DNA修飾的金納米顆粒(biotin DNA AuNP)，孵育一段時間。之后用PBST清洗，重復上述金納米顆粒孵育過程，孵育結束后對基片進行銀染。將銀染試劑A液和B液混合，加入到放置有基片的反應槽中，浸泡一段時間，取出，清洗后，加入一定濃度的硫代硫酸鈉溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)掃描及數據分析；將芯片烘干后，置于掃描儀上掃描，圖像結果使用ImageJ分析其灰度值，然后用Origin軟件進行數據分析。
全文摘要
一種基于納米技術的微量蛋白質檢測方法將免疫酶聯吸附技術、酪胺信號放大技術以及修飾有不同生物分子的金納米顆粒發生聚集現象三者結合起來，建立了一種用于檢測微量前列腺特異性抗原(PSA)等蛋白質的實驗方法。本方法將針對待測蛋白質(如PSA)的一種抗體固定于基片表面，捕捉樣品中的待測蛋白質后，孵育待測蛋白質(如PSA)的另一種帶有辣根過氧化物酶(HRP)活性的抗體。HRP在一定條件下，催化biotin-tyramide產生生物素沉積。利用生物素標記的DNA修飾的金納米顆粒與鏈酶親和素修飾的金納米顆粒發生聚集的現象，進一步放大信號，再經過銀染。最后，使用軟件對實驗結果進行數據分析。該方法具有極低的檢測限和較寬的檢測范圍，能夠在成分復雜的兔血清中實現對抗原的檢測，具有重要的應用前景。
文檔編號G01N33/577GK101943703SQ201010210949
公開日2011年1月12日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者張玉祥, 沈海瀅 申請人:首都醫科大學