一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法

專利名稱：一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法。
背景技術：
豬圓環病毒2型(porcine cirovirus type 2，PCV2)是引起仔豬斷奶多系統衰 竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。自 1991 年在加拿大豬群中暴發以來，PMWS已經波及全球，給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。 PCV2還與增生性壞死性肺炎、母豬繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征和豬呼吸道疾病綜合征 相關。豬圓環病毒相關疾病(PCV2 Associated Disease，PCVD)，主要是PMWS，在2005年給 歐洲造成的損失高達6億歐元。PCV2感染性疾病引起死亡率增高、飼料報酬降低，加上我國 規模化豬場飼養管理水平相對較為落后，因此PCVD也給我國的養豬業造成了巨大的經濟 損失。目前，國際上上市的PCV2疫苗分為滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合滅活苗。PCV2疫 苗效力檢驗方法通常是采用仔豬攻毒實驗的方法。而我國豬群PCV2污染嚴重，對于篩選出 合格的用于PCV2疫苗開發或者疫苗效力檢驗的實驗豬比較困難，而且仔豬攻毒實驗方法 存在費時、費力、費錢及PCV2攻毒模型建立困難、檢驗結果批間差異大等問題。

發明內容
鑒于此，本發明通過豬圓環病毒2型疫苗免疫小白鼠，測定其血清中PCV2特異性 抗體水平，提供了一種簡捷有效的PCV2疫苗效力檢驗方法。包括下述步驟1.小白鼠的免疫將豬圓環病毒2型疫苗經皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途徑和 劑量進行加強免疫一次；2.小白鼠抗體水平的測定加強免疫14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，測定抗體水平；本發明所述的豬圓環病毒2型滅活疫苗效力的檢驗方法中，所述小白鼠的免疫劑 量為0. l-o. 2ml，并且分4點免疫。本發明所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法中，所述小白鼠抗體水平的測定 方法包括如下操作步驟，①將待檢血清用PBS做倍比稀釋；②加入已經包被PCV2 Cap蛋白的ELISA酶標板中；③放入37°C溫箱，作用lh ；④棄去一抗，PBST洗滌；⑤加入PBS稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG(二抗)，放入37°C溫箱，作用lh ；⑥棄去二抗，用PBST洗滌；⑦加入顯色液進行顯色；
⑧加入終止液終止顯色；⑨酶標儀讀取0D45Q，判定疫苗效力；所述稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液均為現有技術的常規用液。最優地，本發明所述的首次免疫小白鼠的時間為14天。最優地，本發明所述的加強免疫小白鼠的時間為21天。本發明具有如下技術效果1.檢測時間短，比豬體內效力檢驗的時間至少減少20天；2.本發明方法操作簡單，可重復性好，結果準確。3.小白鼠遺傳穩定，不會出現實驗動物個體差異而引起的實驗結果差異顯著；4.用疫苗免疫小白鼠操作簡單，同時不需要買大量的實驗豬，大大節約了成本、人 力，提高了疫苗檢測的效率。
具體實施例方式本發明的實施例中利用平行實驗的方法建立了免疫小白鼠抗體水平、免疫豬抗體 水平及仔豬攻毒保護的關系，發現免疫小白鼠抗體水平與免疫后豬的抗體水平及攻毒后淋 巴結感染存在平行關系。應用本發明的方法，可以替代通常采用的PCV2疫苗免疫豬抗體水 平實驗以及仔豬攻毒保護實驗。本發明實施例中還利用本發明檢測方法制定出PCV2疫苗 效力的合格標準，為PCV2疫苗的大規模生產和檢測提供了基礎。實施例1豬圓環病毒2型滅活疫苗效力的檢測1.滅活疫苗來源PCV2滅活疫苗的毒株為PCV2-SH株(保藏號CGMCCNo. 2389)。將PCV2-SH株接種 PK15細胞，5天后收獲病毒抗原液做為滅活疫苗。將制備的滅活疫苗分為三組I、II、111，其抗原含量經測定分別為105_°TCID5(l/ml、 105_ 5TCID50/ml、106_ °TCID50/ml。下面以三組滅活疫苗為樣品，免疫小白鼠測定其血清抗體水平。2.免疫小白鼠抗體檢測(1) BALB/c小白鼠的免疫將5-6周齡健康的BALB/c小鼠隨機分為4組，每組5只，I組采用抗原含量 105 0TCID50/ml的豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫，II組采用抗原含量105 5TCID5(1/ml的豬圓 環病毒2型滅活疫苗免疫，III組采用抗原含量106_°TCID5(l/ml的豬圓環病毒2型滅活疫苗免 疫，IV組為空白組。分四點免疫，每個點免疫0. 05ml，14天后再按照相同的免疫途徑和劑量 加強免疫一次。(2)小白鼠抗體水平的測定加強免疫21天后，通過摘除眼球，采集分離血清，測定其抗體水平。操作步驟如 下①待檢血清用稀釋液做1 50倍稀釋，然后再做2倍系列稀釋，至1 102400;②將稀釋后的血清分別加入已經包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標板中，PCV2Cap蛋 白由大腸桿菌表達系統表達純化獲得，包被量為0. g/孔，步驟①中12個稀釋度每個稀釋度加1孔，每孔100 iU。同時設立小白鼠相同稀釋度的陰性血清對照組；③放入37°C溫箱，作用lh ；④棄去一抗，加入洗滌液，300 u 1/孔，洗滌3次，每次3-5min ；⑤加入用稀釋液作5000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG (二抗)， 100 u 1/孔；放入37°C溫箱，作用lh ；⑥棄去二抗，用洗滌液，洗滌3次，每次3-5min ；⑦加入顯色液100 u 1/孔，進行室溫避光顯色10-15min ；⑧加入終止液100 u 1/孔，終止顯色；⑨酶標儀讀取0D45Q ；⑩結果判定方法待檢血清0D45(/同稀釋度陰性血清0D■彡2. 1判定為陽性結果； 待檢血清OD450/同稀釋度陰性血清OD450彡2. 1判定為陰性結果。以陽性結果的最大稀釋度 做為小白鼠的抗體水平。小白鼠抗體水平檢測結果如下I組5只小白鼠的抗體效價分別為1 200、1 200、1 200、1 200、1 400 ； II組5只小白鼠的抗體效價分別為1 400、1 400、1 400、1 800、1 800 JII組5只 小白鼠的抗體效價分別為1 800、1 800,1 800,1 800,1 1600 ;IV組即空白組5 只小白鼠的抗體效價均彡1 50。所用溶液如下
稀釋液配方
十二水磷酸氫二鈉2. 9克
磷酸二氫鉀0. 2克
氯化鈉8. 0克
氯化鉀0. 2克
加水定容至1000ml。
洗滌液配方
十二水磷酸氫二鈉2. 9克
磷酸二氫鉀0. 2克
氯化鈉8. 0克
氯化鉀0. 2克
吐溫-20 0. 5ml
加水定容至1000ml。
顯色液配方
TMB 底物液(lmg/ml)
TMB 粉末 0. Olg
DMSO 10ml
TMB底物顯色緩沖液(pH5. 0，100ml)
檸檬酸1.02克
十二水磷酸氫二鈉3. 69克
顯色液避光顯色
TMB 底物液 ImlTMB底物顯色緩沖液9ml
30% 雙氧水 10 μ 1終止液配方2mol/L硫酸3.豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫豬抗體水平測定(1)實驗豬的免疫將21日齡健康的PCV2抗原抗體陰性及豬藍耳病抗原抗體陰性斷奶仔豬，隨機 分為4組，每組5只，I組采用抗原含量105_°TCID5(l/ml的豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫， II組采用抗原含量105 5TCID5(1/ml的豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫，III組采用抗原含量 106 0TCID50/ml的豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫，IV組為空白組。每頭免疫lml，14天后再按 照相同的免疫途徑和劑量加強免疫一次。(2)豬抗體水平的測定加強免疫21天后，通過前腔靜脈進行采血，分離血清，測定其抗體水平。抗體測定 方法操作步驟如下①待檢血清用稀釋液做1 50倍稀釋，然后再做2倍系列稀釋，至1 102400;②將稀釋后的血清分別加入已經包被PCV2 Cap蛋白的ELISA酶標板中，PCV2 Cap蛋白由大腸桿菌表達系統表達純化獲得，包被量為0. 5μ g/96孔，每個稀釋度加1孔， IOOy 1/孔，同時設立仔豬陰性血清對照，做同樣的稀釋度；③放入37°C溫箱，作用Ih ；④棄去一抗，加入洗滌液，300 μ 1/孔，洗滌3次，每次3-5min ；⑤加入用稀釋液做10000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗豬IgG(二 抗)，100 μ 1/孔；放入37°C溫箱，作用Ih ；⑥棄去二抗，用洗滌液；洗滌3次，每次3-5min ；⑦加入TMB顯色液100 μ 1/孔，進行室溫避光顯色10-15min ；⑧加入2mol/L H2SO4溶液100 μ 1/孔，終止顯色；⑨酶標儀讀取OD450 ；⑩結果判定方法待檢血清OD45c/同稀釋度陰性血清OD45tl彡2. 1判定為陽性結果； 待檢血清OD450/同稀釋度陰性血清OD450 ^ 2. 1判定為陰性結果。以陽性結果的最大稀釋度 做為小白鼠的抗體水平。豬抗體水平檢測結果如下I 組5 頭豬的抗體效價分別為 1 1600、1 1600、1 800、1 3200、1 6400 ； II 組 5 頭豬的抗體效價分別為 1 3200、1 3200、1 3200、1 3200、1 6400 JII組 5 頭豬的抗體效價分別為1 3200、1 3200,1 6400,1 6400,1 12800 ;IV組即空白 組5頭豬的抗體效價均為< 1 50。4.仔豬攻毒保護試驗目前，PCV2攻毒模型很難建立，是因為它的臨床癥狀不明顯，臨床上主要是因為 PCV2和其它病原混合感染，所以很難通過臨床癥狀檢驗PCV2的感染狀況。而PCV2在豬體 內主要靶組織是淋巴組織。因此，本實施例采用采集攻毒后仔豬的肺門淋巴結或者腹股溝 淋巴結，免疫組織化學(IHC)方法檢測其抗原情況，以此判斷仔豬攻毒保護結果。
將免疫組和空白組中的所有豬進行PCV2-SH株(106_°TCID5Q/ml)的攻毒。每頭豬 滴鼻1ml，頸部肌肉注射2ml，隔離飼養。攻毒后第4、7天分別在兩腋下和兩臀部注射弗氏 不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巰基乙酸培養基10ml。在 第11天和19天腹腔注射巰基乙酸培養基10ml。攻毒后25天進行剖殺，采集肺門淋巴結或 者腹股溝淋巴結進行固定，然后用IHC方法進行抗原檢測，比較空白組和免疫組淋巴結中 感染PCV2抗原情況，以此判斷仔豬攻毒保護結果。試驗結果見表1。將豬圓環病毒2型滅活疫苗3個批次免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平以及 仔豬攻毒保護實驗的結果，進行了比較，結果見表1。表1.小白鼠抗體水平與豬抗體水平以及仔豬攻毒保護實驗的關系 通過將不同抗原含量的3組豬圓環病毒2型疫苗免疫BALB/c小鼠和PCV2抗原抗 體雙陰性的斷奶仔豬，通過比較免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平，發現兩者產生的 PCV2抗體具有平行關系，即免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平呈現正相關的關系。對免疫后的仔豬進行了攻毒保護試驗，通過對淋巴結中PCV2抗原的檢測，發現仔 豬攻毒后淋巴結中感染的PCV2的細胞所占的比例與免疫小白鼠抗體水平具有平行關系， 即免疫小白鼠抗體水平越高，淋巴結中感染的PCV2的細胞所占的比例越小，說明表明保護 性好；相反免疫小白鼠抗體水平越低，淋巴結中感染的PCV2的細胞所占的比例越大，說明 表明保護性差。3批不同抗原含量的疫苗的仔豬免疫攻毒保護試驗結果顯示抗原含量為 105 0TCID50/ml的疫苗可以提供仔豬40%的保護力，抗原含量為105 5TCID5(l/ml的疫苗可以提供80%的保護力，抗原含量為106_°TCID50/ml的疫苗可以提供100%的保護力。我 們也不難看出攻毒保護試驗的結果與小白鼠抗體水平具有平行關系。同時由此可以得出 105 5TCID5(l/ml的抗原為最小保護劑量，此劑量下的疫苗免疫小白鼠抗體水平為1 400或 者1 800。由此，利用本發明檢測方法可以制定出PCV2疫苗效力的合格標準。本實施例 中，采用本發明的方法檢測小白鼠抗體水平大于1 400，做為樣品疫苗檢驗合格的標準， 即可以達到對豬群產生80%保護率，有效防御PCVD的目的。綜上所述，可以得出免疫小白鼠抗體水平和豬的抗體水平及攻毒后淋巴結感染存 在平行關系。應用PCV2疫苗免疫小白鼠，測定其血清中PCV2特異性抗體水平實驗，可以替 代現有豬圓環病毒2型滅活疫苗效力檢驗方法通常采用的疫苗免疫豬抗體水平實驗以及 仔豬攻毒保護實驗。本發明的疫苗效力的檢驗方法，首次免疫與加強免疫的時間間隔并不限于14天， 首次免疫10-21天后再按照相同的免疫途徑和劑量進行加強免疫，其疫苗效力的檢驗的結 果與14天的結果無明顯差異。加強免疫后與處死小鼠采集血樣的時間間隔并不限于21天， 加強免疫14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，其疫苗效力的檢驗的結果與21天的結 果無明顯差異。本發明所述的疫苗效力的檢驗方法，小白鼠的免疫劑量并不限于0.05ml，免疫劑 量為0. l-o. 2ml時，疫苗效力的檢驗的結果與免疫劑量為0. 05ml的結果無明顯差異。本發明的檢測疫苗的方法，不限于應用于PCV2滅活疫苗，因為其他類型的PCV2疫 苗如基因工程疫苗、亞單位疫苗也可以在小白鼠體內引起免疫反應，其他類型PCV2疫苗， 如基因工程疫苗、亞單位疫苗均可以用本發明之方法檢測。豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫小白鼠抗體水平測定方法檢測時間短，操作簡單， 成本低，得到的結果準確，可重復性好，具有很好的應用價值和廣闊的市場前景。
權利要求
一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法，其特征在于步驟如下(1)小白鼠的免疫將豬圓環病毒2型疫苗經皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途徑和劑量進行加強免疫一次；(2)小白鼠抗體水平的測定加強免疫，14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，測定抗體水平；
2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法，其特征在于，步驟1中首 次免疫的最佳時間為14天。
3.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法，其特征在于，步驟1中加 強免疫的最佳時間為21天。
4.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法，其特征在于，所述疫苗的 免疫劑量為0. 1-0. 2ml，并且分4點免疫。
5.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法，其特征在于，所述抗體水 平的測定方法包括如下操作步驟，①將待檢血清用PBS做倍比稀釋；②加入已經包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標板中；③放入37°C溫箱，作用lh ；④棄去一抗，PBST洗滌；⑤加入PBS稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG(二抗)，放入37°C溫箱，作用lh；⑥棄去二抗，用PBST洗滌；⑦加入顯色液進行顯色；⑧加入終止液終止顯色；⑨酶標儀讀取0D45(1，判定疫苗效力。
全文摘要
本發明屬于獸藥生物新醫藥技術領域，涉及一種豬圓環病毒2型滅活疫苗效力檢驗方法。其具體方法為通過豬圓環病毒2型滅活疫苗免疫小白鼠，然后測定其血清中PCV2特異性抗體水平來評價疫苗的效力。使用本發明的疫苗效力檢驗方法克服了傳統豬圓環病毒2型滅活疫苗效力檢驗中試驗豬篩選費時、費力及試驗結果批間差異大等困難。本發明檢測方法具有檢測時間短，并且操作簡單、成本低、得到的結果準確，可重復性好的優點，有很好的應用價值和廣闊的市場前景。
文檔編號G01N33/569GK101871941SQ20101021010
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年1月28日
發明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司