專利名稱：快速檢測甲基毒死蜱的免疫膠體金試紙條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及農藥殘留免疫分析技術領域的一種快速檢測器具，特別是涉及以納米 膠體金顆粒標記抗體的甲基毒死蜱膠體金快速檢測試紙條。
背景技術：
甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)是一種廣譜的有機磷殺蟲劑，用于防治貯藏 谷物中的害蟲和各種葉類作物上的害蟲，也用來防治蚊成蟲、蠅類、水生幼蟲和衛生害蟲， 目前仍在廣泛應用。其作用機理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿是神經遞質，過量 的乙酰膽堿過度刺激乙酰膽堿受體，導致靶生物死亡。然而，一些不是預定目標的生物也遭 到了毒害，包括人、魚等其他生物。目前，對農藥殘留的檢測方法主要是儀器分析方法和酶聯免疫分析方法(ELISA) 等。儀器分析方法包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography, GC)、薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)、液-質串聯法(HPLC-MS)和氣-質串聯法(GC-MS)等，這些儀器分析方法雖然可以達 到較高的檢測靈敏度，但需要復雜昂貴的儀器設備及專業操作人員，加之樣品前處理繁瑣 費時、檢測費用高，難以滿足快速、在線檢測的需要。ELISA方法，法所需要的檢測時間較長， 操作過程仍較復雜，檢測成本較高，而且只能在室內進行檢測等缺陷。因而ELISA方法的應 用受到很大的限制。本發明的甲基毒死蜱膠體金試紙條，無需專業操作人員及任何輔助類儀器，根據 反應所顯現的條帶幾分鐘內即可判定結果，不僅操作簡便、快速、結果直觀準確、成本低，并 且可以在室外進行檢測。
發明內容
本發明的目的是克服上述甲基毒死蜱檢測技術的不足，研制出一種特異、敏感、 快速、簡便的甲基毒死蜱殘留快速檢測試紙條。本發明的技術方案是一種甲基毒死蜱快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上一 次銜接的樣品墊、金標結合墊、纖維素膜、和吸水墊，金標結合墊為吸附甲基毒死蜱金標抗 體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式 隱形檢測線，用兔抗鼠IgG印制的直線式隱形對照線，兩條線平行組合排列為“ 11 ”。所述的襯板為不吸水的韌性材料。所述的韌性材料用硬質塑膠條或不吸水硬紙條制成。所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜。所述的樣品墊用玻璃纖維棉制成。所述的吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙。所述的纖維素膜為硝酸纖維素膜，或為純纖維素膜，或為羧化纖維素膜。所述的保護膜為不透明的膠膜，樣品墊、金標結合墊對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0. 5厘米處。所述的甲基毒死蜱金標抗體為膠體金標記的甲基毒死蜱單克隆抗體，所述的偶聯 甲基毒死蜱半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或為雞卵清白蛋白0VA，或為人血清白 蛋白HAS。
本發明的快速檢測試紙條具有以下優點1.特異性強，敏感性高。本膠體金試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為 基礎制備而成，金標抗體中的膠體金顆粒與抗體分子之間無共價鍵，兩者通過異性電荷間 的范德華力相結合，膠體金的標記對單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，而且有較高 的標記率。因此，試紙條很好的保留了單克隆抗體的特性，具有較強的特異性和較高的敏感 性，檢出最低限量可達到600ppb。2.簡便、快速。在使用本膠體金試紙條時，無需任何其他輔助儀器，可現場操作，只 要將檢測樣加入樣品墊，在10分鐘內即可判定檢測結果。3.結果顯示形象、直觀、準確。膠體金試紙條的檢測結果以纖維素膜上的顯色情況 來判斷。如果樣品中有待測物時，待測物和金標抗體結合形成抗原一金標抗體復合物，并且 繼續上移，遇T線不顯色或者顯色很弱即表示檢測樣品陽性或者弱陽性；如果樣品中沒有 待測樣品時，金標抗體繼續上移，遇T線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品陰性。C線顏色 的有或無表示此試紙條的有效或無效。結果判定形象、直觀、準確、簡單明了。4.節省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用膠體金試紙條進行檢測，比使用儀器和 ELISA試劑盒檢測進行檢測的費用大幅降低。再者，試紙條的使用范圍廣，可滿足不同層次 人員的需要，便于推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟和社會效益。
四
圖1、甲基毒死蜱快速檢測試紙條俯瞰結構示意圖。圖2、甲基毒死蜱快速檢測試紙條剖面結構示意圖。圖中，1 襯板，2 樣品墊，3 金標物結合墊，4 纖維素膜，5 檢測線，6 對照線，7 吸水墊，8-1 樣品浸入端保護膜，8-2 手柄端保護膜，9 標識線。圖3、甲基毒死蜱快速檢測試紙條結果判定示意中，A為陰性樣品檢測結果，B為弱陽性樣品檢測結果，C為強陽性樣品檢測結 果，D和E為試紙條失效。
五具體實施例方式要制備甲基毒死蜱快速檢測試紙條，首先要制備偶聯甲基毒死蜱半抗原的載體蛋 白，用于印制檢測線，進而制備甲基毒死蜱的金標抗體，用于制備金標抗體纖維棉，其次需 要制備兔抗鼠IgG抗體，用于制備對照線。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例一(制備實施例)1.甲基毒死蜱半抗原(0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯) 的合成①0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)硫代磷酰氯的合成。稱取3，5，6_三氯_2_ 口比 啶醇4. 21g(約21. Immol)用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的0-甲基硫代磷酰氯3. 83g(約23. 2mmol)、粉狀K2CO3 8. 7g(約63mmol)混合溶液，滴完后，繼續反 應1小時。反應完畢后真空過濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物。柱層析，用石油醚/ 二氯甲烷 (8 1，體積比)洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體6.88g(產率為72.6%)。②0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N_(丁酸)硫代磷酸酯的合成。稱取4_氨 基丁酸0. 54g(約5. 2mmol)、KOH 0. 78g(約11. 4mmol)，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷卻至 0-10°C，攪拌下緩慢加入溶解于6mL甲醇溶液的(1) 1. 38g(約4. 2mmol)，保溫反應2小時。 反應完畢后，用石油醚/乙醚(7 1，體積比)洗滌，水層調PH= 3.0后用乙醚提取，無水 硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代 磷酸酯1.28g(產率為78%)。2.甲基毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯利用活潑酯法(Active Ester method，簡稱AE法)將具有羧基末端(-C00H)的半 抗原偶聯到大分子的蛋白質上。分別稱取0. Immol半抗原與0. Immol NHS，用600μ1 DMF溶 解于反應裝置中；稱取0. Immol 00，用40(^1 DMF溶解；將DCC/DMF溶液緩慢滴加到上述 反應裝置中。在磁力攪拌下室溫密封反應7小時。反應終液置4°C冰箱冷卻2小時以上，經 SOOOrpm離心5分鐘，取上清活潑酯液十分緩慢的加入到5ml 15mg/ml的BSA蛋白中，反應 在磁力攪拌下室溫攪拌4小時。待反應完成后，將反應液置于透析袋內，于0. 02mol/LpH6. 8 的PB緩沖液中4°C攪拌透析，每四小時換一次透析液，共透析60小時。透析結束后將透析 袋中的液體取出，經4°C 12000rpm離心5分鐘，取上清分裝保存于_20°C冰箱中。同法，用OVA或HAS代替BSA制備人工抗原HAPTEN-0VA或HAPTEN-HAS。3.抗甲基毒死蜱單克隆抗體的制備以50 μ g 100 μ g每只的抗原量免疫6 8周齡健康的雌性BALB/c小鼠。每次 間隔時間為2 3周，最后一次超強免疫后3天，無菌條件下取出小鼠脾細胞，將小鼠脾細 胞與骨髓瘤細胞SP2/0以5 1的細胞數量用PEG介導的方法融合。融合后置于37°C、5% CO2培養箱中培養。培養至細胞長滿培養孔1/3 1/2時，用間接競爭ELISA法選擇強陽性、 抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次優先稀釋克隆，然后擴大培養，建立雜交瘤細胞株。 將特異性的細胞株移入高密度細胞培養器(CELLINE 350)中培養，收集細胞培養液并用 Protein A進行抗體純化，之后用超濾離心管去鹽，冷凍抽干獲得干粉狀抗體，并于-20°C凍 存備用。4、金標抗體和金標結合物墊的制備采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法，制備平均直徑在40nm的膠體金懸浮液。在 回流條件下，把IOOml 0. 01%的氯金酸溶液加熱至沸騰，不停的攪拌，迅速加入1. Iml 1% 的檸檬酸三鈉。當反應溶液顏色變成葡萄紅色時繼續加熱攪拌5min。冷卻至室溫后，加入0. 05%的疊氮化鈉4°C保存。膠體金在與抗體標記前以0. 2mol的K2CO3溶液調到pH為 8. 2左右，采用經典NaCl滴定法確定交易金溶液與甲基毒死蜱抗體的最佳標記量為5 μ g/ ml。然后按最佳標記量進行標記，標記1小時后，攪拌下加入10% BSA(使最終BSA濃度為 1%)，孵育1小時后4°C IOOOOrpm離心25min，并去上清。再用和所用膠體金溶液同體積的 2% BSA溶液重懸后4°C IOOOOrpm離心25min，重復兩次。最后，用1/5膠體金溶液體積的 TB溶液(含3% BSA、3%蔗糖、O.Olmol/L硼酸鈉和0.05%疊氮化鈉)重懸，4°C保存。用 XYZ-3000三維噴膜儀把4%的BSA溶液以8 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，使用干燥箱42°C干燥50min，再把金標記抗體以7 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，干燥箱42°C干燥50min，真空干燥保存。5、兔抗鼠IgG抗體的制備將純化得到的IgG按50 100 μ g/kg體重經皮下和肌肉注射家兔3 4次，末次 注射10天后，以ELISA測定其血清效價達到1 2000以上時，心臟采血，分離收集高免血 清。以飽和硫酸銨法提取兔抗鼠IgG抗體，用于膠體金層析檢測試紙條對照線的制備。6、偶聯抗原和兔抗鼠包被纖維素膜用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為1. 29mg/ml的偶聯抗原以1. 2 μ 1/cm的量噴在纖維素膜的偏下側，作為檢測線。用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為0. 6mg/mL的兔抗鼠IgG 以1. 2 μ 1/cm的量噴在纖維素膜的偏上側，作為對照線，兩線間隔5mm。7、快速試紙條的組裝把纖維素膜粘貼在襯板中間部位上，吸水墊粘貼在纖維素膜上側和纖維素膜重疊 1mm。金標結合物墊粘貼在NC膜下方重疊1mm。樣品墊粘貼在進標結合物墊下方重疊2mm。 組裝好的試紙板用斬切機切成4. 08mm寬的試紙條。8、快速檢測試紙條檢測反應原理當待測樣品溶液加入試紙條或試紙卡測試端后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測 物及金標結合物墊中的金標抗體一起向纖維素膜擴散，并最終滲入吸水墊端。在擴散過程 中，如果樣品中有待測物時，待測物和金標抗體結合，進而占據了金標抗體上的抗原結合 點，阻止金標抗體與纖維素膜上檢測線(半抗原與載體蛋白的結合物)的結合，使檢測線不 顯色或者顯色很弱即表示檢測樣品陽性或者弱陽性；如果樣品中沒有待測樣品時，金標抗 體在上移過程中，遇檢測線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品陰性。同樣，金標抗體也與纖 維素膜上的對照線(兔抗鼠IgG)結合，使對照線顯紅色。對照線顏色的有或無分別表示此 試紙條的有效或無效。實施例二 (應用實施例)1、檢測樣品液的制備1)水檢測樣品溶液的預處理取水樣離心(4000rpm，5min)或用濾紙過濾后，用IM的NaOH調pH至9. 0，NaCl調 鹽離子強度至0. 4M，并加入10%的甲醇，取150 μ 1用于進行檢測。2)蘋果樣品液的制備取待測樣品去皮，用攪拌機勻漿。稱取10. Og樣品加入10. Oml石油醚，漩渦振蕩 2分鐘，加入1. OgNaCl,4. Og MgS04,劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清液 2. 0ml，溫和氮氣吹干。用Iml 0. 02M的硼酸鈉緩沖液(含0. 4M NaCl、10%甲醇)定容，用 漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1. Oml液體12000rpm離心10分鐘，再從上清中取出50 μ 1用于 檢測。注檢測最終結果應除以倍數23)包菜樣品液的制備取待測樣品洗凈，晾干，用攪拌機勻漿。稱取10. Og樣品加入10. Oml石油醚，漩渦 振蕩2分鐘，加入1. OgNaCl,4. Og MgSO4,劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清 液2. 0ml，溫和氮氣吹干。用Iml 0. 02M的硼酸鈉緩沖液(含0. 4M NaCl、10%甲醇)定容，用漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1. Oml液體12000rpm離心10分鐘，再從上清中取出50 μ 1用
于檢測。注檢測最終結果應除以倍數22、檢測及結果判斷如圖所示將甲基毒死蜱試紙條樣品端插入以上預處理的各待檢測樣品中，插 入 深度不超過標記線9，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標結合物墊中的金標抗體一 起向纖維素膜擴散，并最終滲入吸水墊端。在擴散過程中，如果樣品中有待測物濃度大于 5ppm時，阻止金標抗體與纖維素膜上檢測線(半抗原與載體蛋白的結合物)的結合，使檢測 線不顯色即表示檢測樣品為陽性(如圖3C)；如果樣品中待測物在0. 6 5ppm時，阻止部 分金標抗體與纖維素膜上檢測線的結合，使檢測線顯示很弱的紅色即表示檢測樣品為弱陽 性(如圖3B)；如果樣品中待測物濃度小于0.6ppm時，不能阻止金標抗體與纖維素膜上檢 測線的結合，使檢測線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品為陰性(如圖3A)。同樣，金標抗 體也與纖維素膜上的對照線(兔抗鼠IgG)結合，使對照線顯紅色，對照線顏色的有或無分 別表示此試紙條的有效或無效(如圖3A、B、C為有效D、E為無效)。5 10分鐘判定檢測 結果。是實例三(應用實施例)1.特異性試驗按實施例二所述的方法進行試驗，將與甲基毒死蜱結構相似的五種農藥(毒死 蜱、殺螟硫磷、甲基對硫磷、甲基立枯磷、倍硫磷)的標準品配成40ppm，用本發明試紙條進 行檢測，纖維素膜上檢測線與對照線呈“ I I ”排列，即甲基毒死蜱試紙條與毒死蜱、殺螟硫 磷、甲基對硫磷、甲基立枯磷、倍硫磷這五種農藥沒有交叉反應。從而可以斷定此試紙條特 異性很好，在進行檢測時不會受到其他樣品的干擾。2.敏感性和均一性試驗按實施例二所述的方法進行試驗，用本發明試紙條進行檢測0ppm、0.3ppm、 0. 6ppm、l. 25ppm、2. 5ppm、5ppm、IOppm 的甲基毒死蜱標準品，重復 10 次，其中 5ppm、IOppm 的甲基毒死蜱標準品檢測的檢測結果為纖維素膜上的對照線呈一條紅色線，即為陽性； 0. 6ppm、l. 25ppm、2. 5ppm的甲基毒死蜱標準品檢測的檢測結果為纖維素膜上的對照線呈一 條紅色線，檢測線呈一條很弱的紅色線，即為弱陽性；0ppm、0. 3ppm的甲基毒死蜱標準品檢 測的檢測結果為纖維素膜上的檢測線和對照線呈兩條紅色線。因此本發明檢測試紙條的靈 敏度為0. 6ppm。此10檢測顯色深度均一，檢測結果顯示一致。3.穩定性試驗將試紙條放入鋁鉬袋中真空包裝，并且室溫保存，6個月后各項指標均符合上1-2 項指標，即檢測其他相似農藥無交叉反應，靈敏度達0. 6ppm，檢測顯色深度均一，反應結果一致。
權利要求
一種甲基毒死蜱殘留分析的快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上一次銜接的樣品墊、金標結合墊、纖維素膜、和吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護膜，其特征是金標結合墊為吸附甲基毒死蜱金標抗體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用兔抗鼠IgG印制的直線式隱形對照線，兩條線平行組合排列為“||”。
2.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的襯板為不吸水的韌性材料。
3.根據權利要求2中所述的試紙條，其特征是所述的韌性材料用硬質塑膠條或不吸 水硬紙條制成。
4.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或尼龍 膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜。
5.根據權利要求4中所述的試紙條，其特征是所述的樣品墊用玻璃纖維棉制成。
6.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的吸水墊為吸水能力較強的吸水 濾紙或濾油紙。
7.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的纖維素膜為硝酸纖維素膜，或為 純纖維素膜，或為羧化纖維素膜。
8.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的保護膜為不透明的膠膜，樣品 墊、金標結合墊對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0. 5 厘米處。
9.根據權利要求1中所述的試紙條，其特征是所述的甲基毒死蜱金標抗體為膠體金 標記的甲基毒死蜱單克隆抗體，所述的偶聯甲基毒死蜱半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白 BSA，或為雞卵清白蛋白OVA，或為人血清白蛋白HAS。
全文摘要
本發明涉及農藥甲基毒死蜱的快速檢測器具。一種甲基毒死蜱殘留分析的快速檢測試紙條。試紙條含有襯板(1)、樣品墊(2)、金標結合墊(3)、纖維素膜(4)和吸水墊(7)，金標結合墊為吸附甲基毒死蜱金標抗體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線，用兔抗鼠IgG印制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合。本發明試紙條具有特異性強，檢測靈敏度高、快速、簡便、直觀、準確的特點，并且前處理簡單，不需要任何儀器設備，無需專業人員操作。
文檔編號G01N33/543GK101865923SQ20101020494
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者劉鳳權, 華修德, 李剛, 秦娜, 錢國良 申請人:南京農業大學