專利名稱：安培型檢測苯并芘的生物傳感器及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種安培型苯并芘生物傳感器及制備方法和用途，適用于細胞色素 P4501A1的直接電化學研究及苯并芘的實際檢測。
背景技術：
細胞色素P450是一種含血紅素的酶，可以代謝許多的I相酶反應，細胞色素 P4501A1 (CYPlAl)是苯并芘活化過程中最重要的代謝酶。一直以來，細胞色素P4501A1被 用于體外檢測苯并芘，但都需要加入細胞色素P450還原酶，以提供細胞色素P4501A1氧化 還原反應所需的電子。現在人們感興趣的是第三代生物傳感器的研究，也就是酶的直接電 化學研究，電極能為P450直接提供電子使P450發揮催化作用，不需要其他的供電子體。然 而，在沒有修飾的電極上，P450酶直接的電子傳遞很困難，因為血紅素包埋在蛋白內部很難 與電極表面相互作用， 各種電極修飾技術用來實現P450的直接電化學。納米蒙脫土以其 獨特的結構、電學、力學和光學特性及其在納米技術領域潛在的廣泛應用前景而受到眾多 電分析工作者的青睞，他們一直致力于將納米蒙脫土應用到電分析化學中來。雙十六烷基 磷酸是含有兩條長碳氫鏈的疏水性表面活性劑，基于疏水作用雙十六烷基磷酸可有效地將 雙十六烷基磷酸分散于納米蒙脫土的懸浮液中，而且雙十六烷基磷酸懸浮液有很好的成膜 性，容易固定于電極表面。另外，雙十六烷基磷酸還可形成類生物膜的雙層膜的結構，用來 固定酶可保持酶的生物活性。本發明是將納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸各自的優良特性結 合起來，制備一種混合膜，直接包埋細胞色素P4501A1而實現該生物傳感器的制備。
發明內容
本發明的目的是提供一種安培型苯并芘生物傳感器及制備方法和用途，本發明制 得的基于細胞色素P4501A1的生物傳感器不但能實現細胞色素P4501A1直接的電子傳遞， 還保持其高度的生物活性，能催化其底物一苯并芘的氧化，穩定性和重現性較好，而且本 發明的制備方法本身具有操作簡單、條件易于控制等優點。安培型檢測苯并芘的生物傳感器，其特征在于按重量百分比計，由40-49. 5%的 納米蒙脫土、40-49. 5%的雙十六烷基磷酸和1-20%的細胞色素ρ4501Α1組成，細胞色素 P4501A1直接物理包埋于由納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸組成的混合膜內。所述的由納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸組成的混合膜的制備方法為將10_20mg 納米蒙脫土加入l_2mL蒸餾水中持續攪拌10-15小時，靜置3_5小時后，于每分鐘 3000-5000轉的離心機中離心20-30分鐘取上清液得到納米蒙脫土懸浮液，將0. 5_2毫克雙 十六烷基磷酸加入到0. 5-1毫升納米蒙脫土懸浮液中，在700W超聲儀中超聲分散12-16小 時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將分散液滴涂在基體上，室溫晾干，得到由 納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸組成的混合膜。所述的基體為熱裂解石墨電極、玻碳電極、普 通光譜石墨電極、金電極或鉬電極。所述的安培型檢測苯并芘的生物傳感器的制備方法，其特征在于按以下步驟進行(1)、將10-20mg納米蒙脫土加入l_2mL蒸餾水中持續攪拌10-15小時，靜置3_5小時后，于每分鐘3000-5000轉的離心機中離心20-30分鐘取上清液得到納米蒙脫土懸浮液， 將0. 5-2毫克雙十六烷基磷酸加入到0. 5-1毫升納米蒙脫土懸浮液中，在700W超聲儀中 超聲分散12-16小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；(2)、將Img細胞色素 P4501A1直接溶于ImL的pH5. 0-8. 0的緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；(3)、將分散液 與細胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在基體上，室溫晾干，得到安培型 檢測苯并芘的生物傳感器。所述的緩沖液為磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液。本發明制備的安培型檢測苯并芘的生物傳感器能實現細胞色素ρ4501Α1的直接 電化學并保持酶的生物活性，可用于苯并芘的檢測。本發明具有以下的特點1、能實現細胞色素ρ4501Α1的直接電化學，不需要加入其他的細胞色素ρ4501Α1 供電子體；2、細胞色素P4501A1保持其生物活性，能催化其底物_苯并芘的氧化；3、有較好的重現性和穩定性；4、該發明的操作簡單、條件溫和、操作參數較易控制，這些有利條件將極大地促進 了該生物傳感器的實際應用。
圖1為未固定細胞色素P4501A1納米蒙脫土-雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨 電極和本發明制得的固定有細胞色素P4501A1納米蒙脫土-雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解 石墨電極分別在PH7. 0的磷酸緩沖液(充氮氣30分鐘以除去氧氣)的循環伏安圖；圖2為固定有細胞色素P4501A1納米蒙脫土-雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨 電極對苯并芘的安培檢測圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行詳細的說明實施例1 安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備將IOmg納米蒙脫土加入ImL蒸 餾水中持續攪拌12小時，靜置5小時后，于3500rpm離心機中離心30分鐘取上清液得到納 米蒙脫土懸浮液，將0. 5毫克雙十六烷基磷酸加入到0. 5毫升納米蒙脫土懸浮液，在700w 超聲儀中超聲分散16小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將Img的細胞色 素ρ4501Α1直接溶于ImL的pH7. 0的磷酸緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；將所得的分 散液與細胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在熱裂解石墨電極上，室溫晾 干，得到安培型檢測苯并芘的生物傳感器。將所得的細胞色素ρ4501Α1/納米蒙脫土 -雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電 極放于pH7. 0的磷酸緩沖液(充氮氣30分鐘以除去氧氣)，在-0. 9伏到0. 1伏電位范圍 內以1伏/秒的掃速進行循環掃描，其結果見圖1。圖1中曲線a和b分別為未固定細胞 色素ρ4501Α1/納米蒙脫土 -雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電極和固定有細胞色素 P4501A1/納米蒙脫土-雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電極在pH7. 0的磷酸緩沖液的循 環伏安圖。從圖1中可以很清楚地看到，未固定細胞色素P4501A1/納米蒙脫土-雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電極上沒有任何的氧化還原峰出現(曲線a)，而在固定有細胞色 素ρ4501Α1/納米蒙脫土 -雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電極出現一對峰形很好的氧 化還原峰(曲線b)。說明本發明得到的固定化細胞色素P4501A1能實現其活性中心的直接 電子傳遞。將所得的細胞色素ρ4501Α1/納米蒙脫土 -雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨 電極放于pH7. 0的磷酸緩沖液(充氮氣30分鐘以除去氧氣)于-0. 45伏下進行苯并芘 的安培檢測，其結果見圖2。從圖2中可以很清楚地看到，在細胞色素P4501A1/納米蒙脫 土 _雙十六烷基磷酸修飾的熱裂解石墨電極，連續加入3. 3微摩爾苯并芘后，該電極還原電 流迅速增加并能在較快的時間(50秒)達到穩態。說明本發明得到的基于固定化細胞色素 P4501A1的生物傳感器能催化苯并芘的氧化。
實施例2 安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備將IOmg納米蒙脫土加入ImL蒸 餾水中持續攪拌12小時，靜置3小時后，于3500rpm離心機中離心30分鐘取上清液得到納 米蒙脫土懸浮液，將2毫克雙十六烷基磷酸加入到1毫升納米蒙脫土懸浮液，在700W超 聲儀中超聲分散12小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將Img的細胞色素 P4501A1直接溶于ImL的pH7. 0的Tris-HCl緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；將分散液 與細胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在玻碳電極上，室溫晾干，得到安 培型檢測苯并芘的生物傳感器。實施例3 安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備將15mg納米蒙脫土加入ImL蒸 餾水中持續攪拌10小時，靜置5小時后，于5000rpm離心機中離心20分鐘取上清液得到納 米蒙脫土懸浮液，將1. 0毫克雙十六烷基磷酸加入到0. 5毫升納米蒙脫土懸浮液，在700W 超聲儀中超聲分散15小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將Img的細胞色素 P4501A1直接溶于ImL的pH5. 0的磷酸緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；將分散液與細 胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在普通光譜石墨電極上，室溫晾干，得 到安培型檢測苯并芘的生物傳感器。實施例4 安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備將IOmg納米蒙脫土加入1. 5mL 蒸餾水中持續攪拌15小時，靜置4小時后，于3000rpm離心機中離心30分鐘取上清液得到 納米蒙脫土懸浮液，將1. 5毫克雙十六烷基磷酸加入到1. 0毫升納米蒙脫土懸浮液，在700W 超聲儀中超聲分散14小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將Img的細胞色素 P4501A1直接溶于ImL的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；將分散液 與細胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在金電極上，室溫晾干，得到安培 型檢測苯并芘的生物傳感器。實施例5 安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備將20mg納米蒙脫土加入2. OmL 蒸餾水中持續攪拌12小時，靜置5小時后，于4000rpm離心機中離心25分鐘取上清液得到 納米蒙脫土懸浮液，將1. 0毫克雙十六烷基磷酸加入到1. 0毫升納米蒙脫土懸浮液，在700W 超聲儀中超聲分散16小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將Img的細胞色素 P4501A1直接溶于ImL的pH8. 0的磷酸緩沖液中得到細胞色素ρ4501Α1液；將分散液與細 胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在鉬電極上，室溫晾干，得到安培型檢 測苯并芘的生物傳感器。
權利要求
安培型檢測苯并芘的生物傳感器，其特征在于按重量百分比計，由40-49.5％的納米蒙脫土、40-49.5％的雙十六烷基磷酸和1-20％的細胞色素p4501A1組成，細胞色素p4501A1直接物理包埋于由納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸組成的混合膜內。
2.根據權利要求1所述的安培型檢測苯并芘的生物傳感器，其特征在于所述的由 納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸組成的混合膜的制備方法為將10_20mg納米蒙脫土加入 l-2mL蒸餾水中持續攪拌10-15小時，靜置3-5小時后，于每分鐘3000-5000轉的離心機 中離心20-30分鐘取上清液得到納米蒙脫土懸浮液，將0. 5-2毫克雙十六烷基磷酸加入到 0. 5-1毫升納米蒙脫土懸浮液中，在700W超聲儀中超聲分散12-16小時得到納米蒙脫土和 雙十六烷基磷酸的分散液；將分散液滴涂在基體上，室溫晾干，得到由納米蒙脫土和雙十六 烷基磷酸組成的混合膜。
3.根據權利要求2所述的安培型檢測苯并芘的生物傳感器，其特征在于所述的基體 為熱裂解石墨電極、玻碳電極、普通光譜石墨電極、金電極或鉬電極。
4.根據權利要求1、2或3所述的安培型檢測苯并芘的生物傳感器的制備方法，其特征 在于按以下步驟進行(1)、將10_20mg納米蒙脫土加入l_2mL蒸餾水中持續攪拌10-15小 時，靜置3-5小時后，于每分鐘3000-5000轉的離心機中離心20-30分鐘取上清液得到納 米蒙脫土懸浮液，將0. 5-2毫克雙十六烷基磷酸加入到0. 5-1毫升納米蒙脫土懸浮液中， 在700W超聲儀中超聲分散12-16小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；(2)、 將lmg的細胞色素p4501Al直接溶于lmL的pH5. 0-8. 0的緩沖液中得到細胞色素p4501Al 液；(3)、將分散液與細胞色素P4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在基體上，室溫 晾干，得到安培型檢測苯并芘的生物傳感器。
5.根據權利要求4所述的安培型檢測苯并芘的生物傳感器的制備方法，其特征在于 所述的緩沖液為磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
6.根據權利要求4所制備的安培型檢測苯并芘的生物傳感器在苯并芘的檢測中的應用。
全文摘要
本發明涉及安培型檢測苯并芘的生物傳感器及制備方法和用途，安培型檢測苯并芘的生物傳感器制備方法為將10-20mg納米蒙脫土加入1-2mL蒸餾水中持續攪拌10-15小時，靜置3-5小時后，于每分鐘3000-5000轉的離心機中離心20-30分鐘取上清液得到納米蒙脫土懸浮液，將0.5-2毫克雙十六烷基磷酸加入到0.5-1毫升納米蒙脫土懸浮液中，在700W超聲儀中超聲分散12-16小時得到納米蒙脫土和雙十六烷基磷酸的分散液；將1mg細胞色素p4501A1直接溶于1mL的pH5.0-8.0緩沖液中得到細胞色素p4501A1液；將分散液與細胞色素p4501A1液等體積混合，取5微升混合液涂附在基體上，室溫晾干而得到。本發明制得的生物傳感器不但能實現細胞色素P4501A1直接的電子傳遞，還保持生物活性，穩定性和重現性較好，而且操作簡單、條件易于控制。
文檔編號G01N27/26GK101871907SQ201010195720
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者吳云華 申請人:中南民族大學