聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法及試劑盒的制作方法

專利名稱：聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及農業和動物檢疫技術領域，具體涉及一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜 肺炎抗體的方法；此外，本發明還涉及一種液相芯片聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體 的試劑盒。
背景技術：
豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放線 桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，簡稱App)引起的豬的一種呼吸道傳染病，具有 高度傳染性，多呈最急性或急性病程而迅速致死，其發病率和死亡率都在50%以上，最急性 型的死亡率可高達80-100%，慢性型可導致豬生長緩慢，成為僵豬，該病是集約化豬場常見 豬病之一。該病是很多國家進口種豬必檢的豬病之一，我國曾多次從美國、丹麥、英國等進 口種豬中檢出豬傳染性胸膜肺炎。根據胸膜肺炎放線桿菌可溶性抗原莢膜多糖和脂多糖抗 原性的差異，可將其分為15個血清型。血清學抗體檢測是最重要的診斷方法之一。現有的 血清學檢測方法或多或少都存在一定缺陷。App抗體的檢測方法有補體結合試驗、血凝抑制 試驗、ELISA試驗等。補體結合試驗特異性強，但實驗操作很繁瑣，需要有經驗的專業技術 人員。ELISA方法快速、敏感，是最常用的方法。這些檢測方法有的可以單獨分型檢測App 抗體，有的可以檢測包含所有型的App抗體，但都不能同時分型檢測App抗體。由于App各 型之間沒有完全的交叉保護，準確診斷感染血清型是預防和控制該病的基礎。如果對每個 樣本都進行15個血清型的檢測，操作繁瑣，工作量相當大，靈敏度較差，難以實施，不能真 正滿足臨床診斷檢測的需要。而固相生物芯片技術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以及 操作繁瑣的缺點。液相芯片技術(xMAP)是一種可廣泛應用于蛋白質、基因、受體/配體等多種生物 反應的生物芯片技術平臺，主要包括微球、探針分子、被檢測物和報告分子四種成分。在微 球的制造過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據這兩種熒光的比例不同，把球形 基質分為100種，可以標記上100種不同的探針分子，能同時對一個樣品中多達100種不同 的目標分子進行檢測。反應過程中，探針和報告分子都分別與目標分子特異性結合。反應 結束后，使單個的微球通過檢測通道，使用紅、綠雙色激光同時對微球上的紅色分類熒光和 報告分子上的綠色報告熒光進行檢測，可確定所結合的檢測物的種類和數量。本發明基于液相芯片技術的高靈敏度、高通量、檢測迅速等突出優點，對App抗體 進行聯合分型檢測，能夠在臨床檢測上得到更好的應用。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有技術中的不足，提供一種可同時聯合分型 檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，該方法解決了 App分型檢測耗時、成本高、使用血清量 大等問題，該方法的建立可滿足進出口種豬檢疫、快速、準確的要求，同時，為我國養豬業在 預防與控制豬傳染性胸膜肺炎上提供一種新的適用方法。為此，本發明還提供一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的試劑盒。本發明是通過以下技術方案實現的在本發明的一方面，提供一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，具體步驟包括①制備胸膜肺炎放線桿菌(胸膜肺炎放線桿菌簡稱App)多糖抗原；②制備兔抗胸膜肺炎放線桿菌(App)高免血清并純化；③制備陰性血清池；④利用步驟①和②得到的多糖抗原和純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清建 立雙夾心ELISA方法用以初步獲得多糖抗原的工作濃度以及樣本血清稀釋度；⑤使用步驟②純化的兔抗App高免血清與液相芯片的微球偶聯；⑥采用液相芯片分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體；⑦確定豬傳染性胸膜肺炎液相芯片檢測陰性或陽性標準判定的閾值。步驟①中，所述的胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原的制備方法具體為將App標準參 考菌株涂布接種于有0. 1 % NAD的TSCA培養基上，370C，放置5 % CO2培養箱中培養6h，用含 0.5%福爾馬林(甲醛)的生理鹽水洗脫下來收集于瓶中，放置于4°C，過夜；次日，SOOOr/ min，離心15min去上清，沉淀用生理鹽水重懸并調整菌液濃度為101(lCFU/mL。將重新混懸 的菌液放置于100°C水浴中作用lh，冷卻后，20000g，離心20min，保留上清。用0. 22 μ m的 濾膜過濾上清液，濾液即為多糖抗原。分裝，放-20°C保存備用。步驟②中，所述的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的制備和純化方法具體為將 胸膜肺炎放線桿菌6h的培養物加含0.8%福爾馬林(甲醛)的生理鹽水37°C滅活24h，離 心去甲醛，0. OlM PBS (pH7. 4)重懸至2xl05CFU/mL，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，分 點皮下注射健康成年新西蘭兔，每只體重約2kg，ImL/只，2周后靜脈注射活菌0. 5mL，每周 2次，共注射3周。靜脈注射第一次用IX 109CFU/mL的菌液，以后用2X 109CFU/mL的菌液。 最后一次注射1周后心臟采血，分離血清小份量分裝，_20°C保存備用。用改良的辛酸-硫 酸銨提純抗體的方法，純化兔抗App高免血清，并用瓊脂擴散試驗測定免疫后的兔抗胸膜 肺炎放線桿菌高免血清的抗體效價(該抗體效價大于或等于1 32)。步驟③中，所述的陰性血清池的制備具體方法為將不同來源、不同大小的陰性豬 血清混合在一起，混勻分裝，作為陰性標準。步驟④中，所述的雙夾心ELISA方法滴定抗原濃度和待檢樣品的稀釋度具體方法 為提純的兔抗App高免血清經1 100 1 3200倍比稀釋，相應血清型的App多糖抗 原按1 100 1 3200倍比稀釋，標準豬陽性血清按1 100或1 400稀釋，進行方 陣滴定，測定App多糖抗原的最佳稀釋度以及樣本血清稀釋度。步驟⑤中，所述的兔抗App高免血清與微球偶聯，具體為將4°C保存的微球放置 于室溫20 30min，渦旋微球(2 3min為宜)，按需要量(如包被的微球量可做200次檢 測，每次檢測需要2000個微球，則需要4X IO5個微球。微球的商品包裝規格為1.25X 107/ mL，則這次包被需要微球為32 μ L)吸取熒光微球加入到1. 5毫升的離心管中，13000r/min 離心4min去除保護液，用三蒸水洗滌后，用400 μ L 0. IM ρΗ 6. 2磷酸緩沖液重懸微球。加 Λ 10 μ L 50mg/mL Sulfo-NHS禾口 10 μ L 50mg/ml EDC，混勻后 37°C作用 20min。離心去上清， 將微球用900 μ L 0. 05Μ MES重新懸浮，離心去上清，洗滌微球兩次。用400 μ L 0. 05Μ MES重懸微球，加入提純的兔抗App高免血清，混勻后37°C作用2 3h (期間，每隔15min渦旋 混勻一次)。離心去上清，加入 900 ii L PBS-TBN(含有 0. 05% Tween_20、0. 1% BSA.0. 05% 疊氮鈉的0.01M PBS)重懸微球，混勻后離心去上清，洗滌微球兩次。加入200iiL PBS-TBN 重懸微球。用血細胞計數器進行計數。步驟⑥中，所述的采用液相芯片分型聯合檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體方法具體操 作步驟為(a)包被好的微球(偶聯有兔抗胸膜肺炎放線桿菌IgG的微球)放置室溫20 30min,渦旋微球(2 3min為宜)，按每次試驗需要2000個微球的量取微球1 P L，加入App 多糖抗原，總體積為50 u L。37°C振蕩作用45min ；(b) 13000r/min離心3min去上清，用200ii L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球1次，離 心去上清；(c)加入稀釋的待檢豬血清，50 yL，同時設豬陽、陰性血清對照。37°C振蕩作用 45min。離心去上清，用200 u L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球2次，離心去上清；(d)加入生物素標記兔抗豬IgG (5 u g/mL)與PE標記的鏈親和素(7. 5 u g/mL)的 混合物，25 ii L。37°C 作用 30min。(e)加入100 u L純水，將懸液轉移至96孔酶標反應板，通過Bio-plexTM200system 儀器檢測熒光強度值(median f luorescenceintensity, MFI)，并用 Bio-Plex Manager5. 0 軟件分析數據。步驟⑥中，所述的采用液相芯片分型聯合檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體參照在步驟 ④中確定的多糖抗原的工作濃度和樣本血清稀釋度，在此基礎上倍比稀釋上下兩個梯度， 測定胸膜肺炎放線桿菌血清多糖抗原的最佳稀釋度以及樣本血清的最佳稀釋度；可以同時 檢測胸膜肺炎放線桿菌S1-S7型抗體，其反應條件為液相芯片聯合檢測胸膜肺炎放線桿 菌S1-S7型最佳抗原濃度為S1型為1 100，S2型為1 1600，S3型為1 800，S4型為 1 200, S5型為1 200，S6型為1 400，S7型為1 1600 ；待測豬血清的最佳稀釋度 為 1 400。步驟⑦中，所述的液相芯片分型聯合檢測方法確定陽性陰性的判定標準具體為 對已知的陰性豬血清進行測定，對檢測結果進行統計分析，計算標準差。根據統計學原理， 約有99%的觀測值在平均數左右三倍標準偏差(i ±3SD)范圍內。3倍標準差加上陰性血 清池的熒光值即為判定閾值，大于閾值的為陽性，小于閾值的為陰性。在本發明的另一方面，還提供一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的試劑 盒，包括以下主要組成成分(1)偶聯抗體的微球含有分別偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌不同血清型抗體的 各種微球，每種抗體分別抗一種胸膜肺炎放線桿菌血清型并且偶聯于不同編號的微球，形 成“抗體_微球”的二聯復合體；(2)與上述胸膜肺炎放線桿菌不同血清型對應的多糖抗原；(3)生物素標記兔抗豬IgG與PE標記的鏈親和素的混合物；(4)陽性血清對照和陰性血清對照。優選地，所述偶聯抗體的微球分別是偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S1型抗體的 微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S2型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S3型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S4型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿 菌S5型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S6型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎 放線桿菌S7型抗體的微球；所述多糖抗原是胸膜肺炎放線桿菌S1型-S7型多糖抗原。上述聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法使用了液相蛋白芯片技術，該技 術使用了特定的熒光微球，這些微球以聚苯乙烯為基質，根據熒光染料的比例不同，可將微 球分為100種，從而可標記上100種探針分子，不同微球上的探針分子與樣品中需要檢測的 各種目標分子進行特異性結合，報告分子與目標分子特異性結合，即構成了液相芯片系統， 能同時對一個樣品中多達100種不同目標分子進行檢測。與傳統的檢測診斷方法相比，液 相蛋白芯片技術具有如下優點1.靈敏度高、特異性強、穩定性好、重復性好液相蛋白芯 片的靈敏度是常規的ELISA方法的靈敏度10 100倍；液相蛋白芯片雜交發生在準均相 的液體環境中，在反應中液相環境更有利于保持蛋白質的天然構象，不僅有利于探針和被 檢測物的反應，也更能保證反應的特異性和穩定性；檢測系統中的兩束激光同時分別檢測 微球分類熒光(特異性)和報告熒光(敏感性)，只有與分類熒光同時出現的報告熒光信 號才被檢測記錄，更加提高了結果的特異性。液相蛋白芯片技術在對每個指標的檢測中，在 同一個反應體系中有其相對應的1000 5000顆相同的微球。檢測時，抽取其中的100 500顆微球讀數，最終的數據是取其所有值的中位數，這樣可以把誤差減到最小，從而使檢 測結果重復性好。2.樣本需要量小，成本相對較低液相蛋白芯片技術的血清用量較ELISA 法、化學發光法、電化學發光法要少得多。液相蛋白芯片中微球表面積大，單個微球可結合 多達約(1 2) X106個目標分子，因此只需極少量樣品即可同時進行多種成分檢測，便于 臨床采樣分析；同時試劑用量少，所需成本較低，可節約成本，減少人力消耗。3.反應快速， 耗時短液相蛋白芯片技術的反應環境為液相，微球上固定的探針(或抗體)與待檢樣品均 在溶液中反應，其彼此間碰撞幾率與速度相對于固相芯片或ELISA等反應模式可增加10倍 以上，反應時間甚至可縮短到十幾分鐘，因此可提高反應速度。而且微球直徑很小(約5 6um),容易混懸在液體中，為生物分子反應提供近似生理的液相環境，反應快速、充分、需 時短。抗原-抗體等蛋白質分子相互作用的結果可在瞬間經流式細胞檢測系統判定后由電 腦以數據信息的形式記錄下來，更節省了反應過程的時間。4.高通量可進行多元化分析， 適用范圍廣，目前商業化微球采用雙色熒光編碼技術，可同時對100種目標分子進行檢測。 一次可以同時檢測多種指標，這與傳統方法的逐個檢測相比是一個質的飛躍；通過對微球 表面的修飾，微球表面可以包被抗體、抗原、細胞因子、蛋白質或核酸、配體、受體等各種抗 體或受體分子，從而滿足不同檢測和功能的研究需要，可適用于各種分析研究；強大的軟件 分析系統和高通量檢測系統，更方便快捷直觀地獲得更多信息。與現有技術相比，本發明使用高通量的液相蛋白芯片技術，可以同時檢測S1-S7 型App血清抗體，解決了 App分型檢測耗時、成本高、使用血清量大、以及檢測單一血清型容 易出現漏檢其它血清型等問題，也為進一步同時檢測所有15個血清型App奠定了基礎，為 App的檢測提供了理想的方法。且本發明可以根據需要進行靈活組合，聯合檢測，且操作簡 單，用時短，傳統的血清學診斷方法無法做到這點。利用該發明可以快速、廉價、準確地檢測 豬傳染性胸膜肺炎抗體，整個反應可以在3小時內完成，其快速、敏感、特異和同步檢測多 個血清型的特點可以應用于進出境種豬初篩、國內豬場豬傳染性胸膜肺炎的診斷和監測。 該方法的建立可滿足進出口種豬檢疫、快速、準確的要求，同時，為我國養豬業在預防與控制豬傳染性胸膜肺炎上提供一種新的適用方法。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在本發明技術方案為前提下進行實 施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本實施例僅用于說明本發明而不用于限 制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如杜平等在 《醫用實驗病毒學》(北京人民軍醫出版社，1985)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的 條件。實施例11.制備胸膜肺炎放線桿菌S1-S7型多糖抗原將凍干保存的App血清S1-S7型標準參考菌株(丹麥國家獸醫研究所贈送)劃線 接種于涂布有0. 煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD，購自國藥集團化學試劑有限公司)的TSCA 培養基(該TSCA培養基由本實驗室配制取40gTSA(Tryptic Soy Agar，DIFC0 )瓊脂粉， 溶于1000mL去離子水中，攪拌加熱溶解，煮沸lmin至完全溶解后121°C高壓滅菌15min，冷 卻到40°C 50°C，加8% (V/V)的脫纖綿羊血(購自上海閩行區諸翟無菌動物血試劑供應 站)和0. 15%的葡萄糖(W/V)，于80°C 82°C水浴lOmin 12min，培養基顏色由血紅色變 為巧克力色，出現細小顆粒。冷卻到60°C左右，加入10%的(V/V)酵母浸液，混勻倒平皿， 4°C保存備用)上，放置371，5%0)2培養箱中培養。次日，挑取單個菌落，劃線接種于新的 TSCA(含0. 1% NAD)培養基上，放置37°C，5% C02培養箱中培養；次日，用滅菌的生理鹽水 將App洗脫下來，涂布接種于新的TSCA(含0. 1%NAD)上，放置37°C，5% C02培養箱中培養 6h，App菌落用含0.5%福爾馬林(甲醛)的生理鹽水洗脫下來收集于瓶中，放置于4°C，過 夜；次日，8000r/min，離心15min去上清，沉淀用生理鹽水重懸并調整菌液濃度為101(ICFU/ mL。將重新混懸的菌液放置于100°C水浴中作用lh，冷卻后，20000g，離心20min，保留上清。 用0. 22 ym的濾膜過濾上清液，濾液即為多糖抗原。2.兔抗胸膜肺炎放線桿菌S1-S7型高免血清的制備與提純將胸膜肺炎放線桿菌6h的培養物(按照上述1.制備胸膜肺炎放線桿菌S1-S7型 多糖抗原所述的方法培養)加含0. 8%福爾馬林(甲醛)的生理鹽水37°C滅活24h，離心去 甲醛，0. 01M PBS(pH7. 4)重懸至2xl05CFU/mL，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，分點皮 下注射健康成年新西蘭兔(購自上海生旺實驗動物養殖有限公司)，每只體重約2kg，lmL/ 只，2周后靜脈注射活菌0.5mL，每周2次，共注射3周。靜脈注射第一次用lX109CFU/mL 的菌液，以后用2X109CFU/mL的菌液。最后一次注射1周后心臟采血，分離血清小份量分 裝，-20°C保存備用。測量血清總體積(原始體積)，加入2倍原始體積的60mmol/L醋酸緩 沖液(pH 4.0)稀釋，加入正辛酸(75iiL/mL血清)，室溫下邊加邊攪拌30min后，4°C靜置 2h ；4°C,12000r/min離心30min，棄沉淀。上清溶液過濾后轉移至透析袋中，PBS透析過夜。 在透析后的溶液中加入等體積飽和硫酸銨溶液。4°C靜置lh ；4°C,10000r/min離心30min。 棄上清液，收集沉淀并溶于原血清體積30% 50%的PBS中，透析過夜。透析過后的液體 即為純化后的抗體。3.陰性血清池的制備陰性豬血清63份，包括上海小豬、中豬、母豬(上海供港豬場提供)；上海巴馬小
9型豬(上海交大農業與生物學院提供)；美國進口種豬，每份取lOOul，混勻為陰性血清池 (pool)，然后分裝，備用。4.雙夾心ELISA初步測定抗原效價及血清稀釋度提純的兔抗App高免血清與App多糖抗原均用1 100 1 3200倍比稀釋， App豬陽性血清按1 100或1 400稀釋，進行方陣滴定，初步測定提純的兔抗App血清、 多糖抗原以及樣本血清稀釋度。具體操作步驟如下①包被提純的兔抗App高免血清用 0. 01M PBS稀釋后加入到96孔平底酶標板，每孔100 u L，37°C孵育1. 5 2h ；用PBST (含 0. 05%吐溫-20的0. 01M PBS)每孔350 y L洗滌3次；②封閉每孔加入250 y L含10%馬 血清的PBST封閉酶標板，37°C孵育1. 5 2h，洗滌3次；③將App多糖抗原加入到酶標板， 每孔lOOii L，37°C孵育lh，洗滌3次；④將待檢豬血清加入到酶標板，每孔100 y L，同時設 標準豬陰、陽性血清對照，37°C孵育lh，洗滌3次；⑤將HRP-兔抗豬IgG加入到酶標板，每 孔100ii L，37°C孵育lh，洗滌3次；⑥加入鄰苯二胺(0PD，sigma產品)每孔100y L，作用 15min ；⑦加終止液2M H2S04終止反應，每孔50 y L ；于490nm處讀取吸光值(0D)，記錄結 果，并分析。5.純化的兔抗App高免血清與微球偶聯委托上海透景生命科技有限公司偶聯，主要步驟如下將4°C保存的微球(Luminex產品，購自上海透景生命科技有限公司)放置于室 溫20 30min，渦旋微球(2 3min為宜)，按需要量(如包被的微球量可做200次檢測， 每次檢測需要2000個微球，則需要4X 105個微球。微球的商品包裝規格為1. 25X 107mL， 則這次包被需要微球為32 u L)吸取熒光微球加入到1. 5毫升的離心管中，13000r/min離 心4min去除保護液，用三蒸水洗滌后，用400iiL 0. 1M pH 6. 2磷酸緩沖液重懸微球。加入 10 u L 50mg/mL Sulfo-NHS 和 10 ii L 50mg/ml EDC，混勻后 37°C作用 20min。離心去上清， 將微球用900 uL 0. 05M MES重新懸浮，離心去上清，洗滌微球兩次。用400 y L 0. 05M MES 重懸微球，加入提純的兔抗App高免血清，混勻后37°C作用2 3h (期間，每隔15min渦旋 混勻一次)。離心去上清，加入 900 ii L PBS-TBN(含有 0. 05% Tween_20、0. 1% BSA.0. 05% 疊氮鈉的0.01M PBS)重懸微球，混勻后離心去上清，洗滌微球兩次。加入200iiL PBS-TBN 重懸微球。用血細胞計數器進行計數。6.液相芯片分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體取包被好的微球放置室溫20 30min，渦旋微球(2 3min為宜)。按每次試驗需 要每種微球2000個的量分別取七種微球各1 y L，按App各血清型的多糖抗原的初步稀釋濃 度混合抗原并加入微球中，充分渦旋混勻，總體積為50 u L。37°C振蕩作用45min ； 13000r/ min離心3min去上清，用200 u L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球1次，離心去上清；加入稀釋 的待檢豬血清(來源見表5)，5(^1^，同時設豬陽、陰性血清對照(陰性血清的制備見3.陰 性血清池的制備，陽性血清由上海出入境檢驗檢疫局使用App標準菌株(丹麥國家獸醫實 驗室饋贈)免疫豬制備，具體為將App血清S1-S7型標準參考菌株分別接種于TSCA(含 0. NAD)培養基上，放置37°C，5% C02培養箱中培養18h，用生理鹽水洗下，每只豬鼻腔 接種4. 5xl08個菌；第6天取App 6小時培養菌8. 5xl08加等量弗氏不完全佐劑乳化，分三 個部分肌肉注射；第7天取App 6小時培養菌7. 5xl09靜脈注射，第24天取App 6小時培 養菌2. 5xl09靜脈注射，第28天取App 6小時培養菌2. 5xl09靜脈注射，第32天取App 6
10小時培養菌2. 5xl09靜脈注射，最后一次靜脈注射后20天撲殺采血，分離血清-20°C保存備 用)。37°C振蕩作用45min。離心去上清，用200 u L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球2次，離 心去上清；加入g/mL生物素標記兔抗豬IgG(上海出入境檢驗檢疫局制備，具體步驟為 將純化的兔抗豬血清(sigma產品)用0. 1M pH 9. 0 9. 2NaHC03，4°C，透析過夜后，用0. 1M NaHC03調整蛋白的濃度至lmg/ml。同時，用二甲基甲酰胺溶解N-羥基琥珀酰亞胺-生物素 (BNHS，sigma產品)至lmg/ml。按BNHS IgG的質量比為1 8混合，室溫渦旋攪拌反應 4小時，或者4°C過夜。生物素化的IgG裝入透析袋中，用0. 01M PBS pH 7. 2 7. 4 4°C透 析過夜。透析過后的生物素化的IgG測定蛋白濃度，然后加入0. 02%的疊氮鈉，4°C保存。) 與7. 5 ii g/mL PE標記的鏈親和素(購自invitrogen)混合物25 u L。37°C作用30min。加 入100 y L純水，將懸液轉移至96孔可拆卸酶標反應板，通過BiO-plexTM200SyStem儀器檢 測熒光強度值(median fluorescenceintensity，MFI)，并用 Bio-Plex Manager5. 0 軟件分 析數據。確定最佳工作濃度參照在雙夾心ELISA中確定的多糖抗原的工作濃度、樣本(待 測豬血清)的稀釋度，在此基礎上倍比稀釋上下兩個梯度，進行滴定，確定App血清多糖抗 原的最佳稀釋度以及樣本血清稀釋度。液芯聯合檢測App S1-S7型最佳抗原濃度為SI為 1 100，S2 為 1 1600，S3 為 1 800，S4 為 1 200，S5 為 1 200，S6 為 1 400，S7 為1 1600 ；待測豬血清的最佳稀釋度為1 400。7.液相芯片檢測方法陰陽性臨界值一閾值的計算方法對399份陰性豬血清用液相蛋白芯片方法檢測，閾值=陰性血清池MFI值+3 X標 準偏差(SD)。App血清S1型-S7型3*SD見表1。如果大于閾值則為陽性，小于閾值為陰性。表1 App 血清 S1-S7 型 3*SD 實施例2液相蛋白芯片特異性檢測使用液相芯片分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體試驗方法檢測App血清1-7型豬 陽性血清，豬藍耳病陽性血清(歐洲株和美洲株均來自美國國家獸醫實驗室)；豬圓環病毒 陽性血清、豬副豬嗜血桿菌陽性血清、豬弓形體陽性血清、豬支原體肺炎陽性血清(上海動 物疫病預防控制中心饋贈)；豬0型口蹄疫陽性血清(購自中國農業科學院蘭州獸醫研究 所)；豬傳染性胃腸炎陽性血清(svanova biotech ELISA試劑盒)；豬布氏桿菌病陽性血清 (購自中國獸藥監察所)；豬鏈球菌陽性血清(上海交大農學院饋贈)；豬偽狂犬病陽性血 清(IDEXX ELISA試劑盒)、豬乙腦陽性血清(上海出入境檢驗檢疫局保存)。檢測App各 自血清型抗體結果均為陽性，而其它對照血清均為陰性，檢測結果見表2。說明該方法能特 異地檢測出App血清抗體。表2液相蛋白芯片特異性檢測結果(MFI值) 實施例3液相芯片檢測方法與ELISA檢測敏感性比較將App S1-S7型陽性豬血清1 200-1 25600倍比稀釋，用液相芯片檢測豬傳 染性胸膜肺炎抗體試驗方法與商品化ELISA試劑盒(加拿大BI0VET產品)同時進行檢測， 液芯的檢測的滴度普遍高于ELISA 2-4個稀釋度，具體見表3。表3液相芯片(簡稱液芯)與ELISA檢測試劑盒的比較 注+ 為陽性；-為陰性；士 為可疑實施例4液相蛋白芯片檢測的重復性從2009年10月26日至2010年3月30日之間，使用3批試劑，用液相芯片分型 檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體試驗方法對S1型陽性血清進行23次檢測(見表4)，檢測結果 經SPSS檢驗，SI型與其它型之間有顯著差異，SI型不同批次試劑之間無顯著差異、SI型不 同時間檢測無顯著差異。說明試劑穩定性較好，檢測的重復性較好。表4不同時間不同批次試劑檢測S1型陽性血清結果 ***表示未做實施例5液相芯片技術的初步應用及與ELISA比較使用液相芯片分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體試驗方法檢測不同來源的573份 臨床樣品，其中部分使用加拿大ELISA試劑盒(加拿大BIOVET產品)檢測，檢測結果見表 5。由于S3與S6以及S4與S7有部分相似的抗原結構，ELISA將S3/S6、S4/S7同時檢測。 液芯檢測部分樣品也有交叉，因此，比較兩種檢測方法時將S3/S6、S4/S7同時進行比較。兩 種方法的相符率為Sl為94.9% (186/196，可疑作為陰性)或96.4% (189/196，可疑作 為陽性)；S2 為 99. 5% (570/573) ；S3/6 為 99. 2% (504/508，可疑作為陰性)^ 99. 8 % (507/508，可疑作為陽性)；S4/7 為 95. 4% (187/196，可疑作為陰性)^ 96. 9% (190/196, 可疑作為陽性)；35為90.3% (177/196，可疑作為陰性)或91. 3% (179/196，可疑作為陽 性)。這兩種方法檢測App血清1-7型相符率均在90%以上，說明具有較好的相符性。由 于本發明可同時檢測多個血清型，效率高于ELISA檢測方法。
權利要求
一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟①制備胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原；②制備兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清并純化；③制備陰性血清池；④利用步驟①和②得到的多糖抗原和純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清建立雙夾心ELISA方法，以初步獲得多糖抗原的工作濃度以及樣本血清稀釋度；⑤使用步驟②純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清與液相芯片的微球偶聯；⑥采用液相芯片分型聯合檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體；⑦確定豬傳染性胸膜肺炎液相芯片檢測陰性或陽性標準判定的閾值。
2.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟①中，所述胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原的制備方法具體為將胸膜肺炎放線桿菌標準 參考菌株涂布接種于有0. 1 % NAD的TSCA培養基上，37 °C，放置5% C02培養箱中培養6h， 用含0. 5 %甲醛的生理鹽水洗脫下來收集于瓶中，放置于4°C，過夜；次日，8000r/min,離心 15min去上清，沉淀用生理鹽水重懸并調整菌液濃度為101(lCFU/mL ；將重新混懸的菌液放置 于100°C水浴中作用lh，冷卻后，20000g，離心20min，保留上清；用0. 22 ym的濾膜過濾上 清液，濾液即為多糖抗原，分裝，放-20°C保存備用。
3.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟②中，所述的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的制備和純化方法具體為將胸膜肺炎 放線桿菌6h的培養物加含0. 8%甲醛的生理鹽水37°C滅活24h，離心去甲醛，0. 01M PBS重 懸至2xl05CFU/mL，加入等體積弗氏不完全佐劑乳化后，分點皮下注射健康成年新西蘭兔， 每只體重約2kg，lmL/只，2周后靜脈注射活菌0. 5mL，每周2次，共注射3周；靜脈注射第一 次用1 X 109CFU/mL的菌液，以后用2 X 109CFU/mL的菌液；最后一次注射1周后心臟采血，分 離血清小份量分裝，-20°C保存備用；采用正辛酸和硫酸銨提純抗體，純化兔抗胸膜肺炎放 線桿菌高免血清，并用瓊脂擴散試驗測定免疫后的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的抗體 效價。
4.根據權利要求1或3所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在 于，步驟②中，所述用瓊脂擴散試驗測定免疫后的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清的抗體 效價大于或等于1 32。
5.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟③中，所述制備陰性血清池具體為將不同來源、不同大小的陰性豬血清混合在一起， 分裝，作為陰性標準。
6.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟④中，所述的雙夾心ELISA方法具體為步驟②純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血 清經1 100 1 3200倍比稀釋，相應血清型的胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原按1 100 1 3200倍比稀釋，標準豬陽性血清按1 100或1 400稀釋，進行方陣滴定，測定胸膜 肺炎放線桿菌多糖抗原的最佳稀釋度以及樣本血清稀釋度。
7.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟⑤中，所述的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清與微球偶聯，具體為將4°C保存的微球 放置于室溫20 30min，渦旋微球，按需要量吸取熒光微球加入到1. 5毫升的離心管中，13000r/min離心4min去除保護液，用三蒸水洗滌后，用400iiL 0. 1M pH 6. 2磷酸緩沖液重 懸微球；加入 10 ii L 50mg/mL Sulfo-NHS 和 10 ii L 50mg/ml EDC,混勻后 37°C作用 20min ； 離心去上清，將微球用900 uL 0. 05M MES重新懸浮，離心去上清，洗滌微球兩次；用400 u L 0. 05M MES重懸微球，加入提純的兔抗App高免血清，混勻后37°C作用2 3h ；離心去上清， 加入900 u LPBS-TBN重懸微球，混勻后離心去上清，洗滌微球兩次；加入200 u LPBS-TBN重 懸微球，用血細胞計數器進行計數。
8.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟⑥中，所述的采用液相芯片分型聯合檢測豬胸膜肺炎抗體的具體步驟為(a)取偶聯有兔抗胸膜肺炎放線桿菌IgG的微球放置室溫20 30min，渦旋微球，按胸 膜肺炎放線桿菌每個型每次試驗需要2000個微球的量，每個型取微球1 P L，加入相應的胸 膜肺炎放線桿菌多糖抗原，總體積為50P L，37°C振蕩作用45min ；(b)13000r/min離心3min去上清，用200 u L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球1次，離心去 上清；(c)加入1 400稀釋的待檢豬血清，50 yL，同時設豬陽性、陰性血清對照，37°C振蕩作 用45min，離心去上清，用200 u L PBS-TBN重懸微球，洗滌微球2次，離心去上清；(d)加入生物素標記兔抗豬IgG與PE標記的鏈親和素的混合物，37°C作用30min；(e)加入100u L純水，將懸液轉移至96孔酶標反應板，通過Bio-plexTM200system儀 器檢測熒光強度值，并用Bio-Plex Manager5. 0軟件分析數據。
9.根據權利要求1或8所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征 在于，步驟⑥中，所述的采用液相芯片分型聯合檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體參照在步驟④ 中確定的多糖抗原的工作濃度和樣本血清稀釋度，在此基礎上倍比稀釋上下兩個梯度，測 定胸膜肺炎放線桿菌血清多糖抗原的最佳稀釋度以及樣本血清的最佳稀釋度；可以同時 檢測胸膜肺炎放線桿菌S1-S7型抗體，其反應條件為液相芯片聯合檢測胸膜肺炎放線桿 菌S1-S7型最佳抗原濃度為S1型為1 100，S2型為1 1600，S3型為1 800，S4型為 1 200，S5型為1 200，S6型為1 400，S7型為1 1600 ；待測豬血清的最佳稀釋度 為 1 400。
10.根據權利要求1所述的聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，其特征在于， 步驟⑦中，所述的液相芯片分型聯合檢測方法確定陽性陰性的判定標準具體為對已知的 陰性豬血清進行測定，對檢測結果進行統計分析，計算標準差；根據統計學原理，約有99% 的觀測值在平均數左右三倍標準偏差(〒±3SD)范圍內；3倍標準差加上陰性血清池的熒 光值即為判定閾值，大于閾值的為陽性，小于閾值的為陰性。
11.一種液相芯片聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的試劑盒，其特征在于，包括以 下主要組成成分(1)偶聯抗體的微球含有分別偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌不同血清型抗體的各種 微球，每種抗體分別抗一種胸膜肺炎放線桿菌血清型并且偶聯于不同編號的微球，形成“抗 體-微球”的二聯復合體；(2)與上述胸膜肺炎放線桿菌不同血清型對應的多糖抗原；(3)生物素標記兔抗豬IgG與PE標記的鏈親和素的混合物；(4)陽性血清對照和陰性血清對照。
12.根據權利要求11所述的液相芯片聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的試劑盒， 其特征在于，所述偶聯抗體的微球分別是偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S1型抗體的微 球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S2型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S3型抗 體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S4型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌 S5型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放線桿菌S6型抗體的微球，偶聯了兔抗胸膜肺炎放 線桿菌S7型抗體的微球；所述多糖抗原是胸膜肺炎放線桿菌S1型-S7型多糖抗原。
全文摘要
本發明公開了一種聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的方法，包括如下步驟首先制備胸膜肺炎放線桿菌多糖抗原，制備兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清并純化；然后用純化的兔抗胸膜肺炎放線桿菌高免血清偶聯液相芯片微球，根據雙夾心ELISA原理，建立分型檢測豬胸膜肺炎抗體的液相芯片方法，并確定最佳試驗條件；最后通過統計學分析確定液相芯片陰陽判定的閾值。此外，本發明還公開了一種液相芯片聯合分型檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體的試劑盒。本發明可同時分型檢測豬傳染性胸膜肺炎S1-S7型血清抗體，整個反應可在3小時內完成，其快速、敏感、特異和同步檢測多個血清型的特點可用于進出境種豬初篩、國內豬場豬傳染性胸膜肺炎的診斷和監測。
文檔編號G01N21/64GK101858912SQ20101019145
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月3日 優先權日2010年6月3日
發明者張強, 李樹清, 杜軍, 王巧全, 王艷, 陳志飛 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局