專利名稱：測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法的制作方法
技術領域：
本發明涉及體液中尼古丁的測定方法，特別是一種測定體液中尼古丁的新型間接 抑制免疫分析法。
背景技術：
隨著全球性控煙運動的不斷推進，社會公眾對于吸煙與健康問題日益關注。人體 體液中的尼古丁作為生物標記物，被廣泛用以評價吸煙人群和非吸煙人群暴露于煙草煙氣 的程度。目前，對尿液、血液、精液、血漿和唾液中尼古丁的分析方法既有高效液相色譜法、 毛細管氣相色譜_氮磷檢測器法，又有酶聯免疫法、直接抑制免疫分析法、間接抑制免疫分 析法。高效液相色譜法、毛細管氣相色譜-氮磷檢測器法，又有酶聯免疫法需要合適的去雜 或濃縮等樣品前處理步驟，前處理復雜，選擇性、靈敏度較差。對于直接抑制免疫分析法需 要對樣品預培養，預培養的過程冗長，操作復雜，樣品基質影響大。
發明內容
本發明的目的正是針對現有技術中存在的不足之處，提供一種測定體液中尼古丁 的新型間接抑制免疫分析法。該方法首先制備高選擇性的尼古丁分子印記聚合物涂層毛細 管，能夠有效地將體液中尼古丁在線完全萃取和預富集，然后用表面等離子體共振技術進 行間接免疫分析，從而實現體液中尼古丁的快速、準確定量分析。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，依次包括以下步驟(1)將0. 2mmol-0. 5mmol的印記分子尼古丁溶解在烴基取代甲酰胺中，再加入功 能單體，震蕩，然后再加入交聯劑和生孔劑、引發劑，震蕩，混合均勻，通氮氣后用氮氣泵注 射進入硅烷化活化的毛細管內，在水浴下聚合。聚合反應完成后，將毛細管連接到氮氣泵 上，施加壓力除去未反應的溶液并使合成的聚合物壓縮到毛細管內壁上，施壓完成后用有 機酸醇溶液沖洗毛細管以除去印記分子尼古丁和致孔劑。(2)將尼古丁分子用乙基_ 二甲氨基丙基_碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺衍生并 鍵合到SPR裸金芯片上，將制備好的毛細管與生物傳感器聯用。(3)采用磷酸鹽緩沖液稀釋Anti-NIC單克隆抗體，并加入蛋白質，采用有機酸鹽 處理尼古丁樣品和標樣，調節pH。(4)采用在線分子印記聚合物萃取-等離子體共振技術聯用測定體液中的尼古 丁。首先將Anti-NIC單克隆抗體溶液通過毛細管并進入傳感器芯片檢測，響應信號為RU1， 將其作為參照。然后將待測的尼古丁溶液通過毛細管柱，尼古丁分子就被管內的聚合物涂 層選擇性地萃取和富集。最后再將相同濃度的Anti-NIC單克隆抗體溶液通過毛細管進入 Sra芯片表面，Anti-NIC單克隆抗體首先被毛細管涂層上萃取的NIC抑制，使剩下的進入芯 片表面的Anti-NIC單克隆抗體量減少，相應的響應信號也減弱(RU2)。Δ RU = RU1-RU2
Δ RU值直接反映了被NIC抑制的MAbs的濃度，也間接反映出樣品中NIC的含量， 根據該原理制備系列標準溶液，利用外標法定量測定待測物中尼古丁含量。分析條件生物傳感器=BIAcore 3000傳感器(BIAcore AB公司)；生物芯片CM5 傳感器芯片(BIAcore AB公司)；緩沖溶液磷酸鹽緩沖液PBS (lOmmol/L磷酸鹽，137mmol/ L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，pH7. 4，由BIAcore AB公司購買的PBS緩沖液用二次去離子水稀釋 10倍獲得)；流速20 μ L/min ；20 μ L0檢測溫度:25°C。在本發明中，步驟(4)所述體液可為尿液、血液、血漿或吐液。步驟(1)中所述烴基取代甲酰胺為包括一個、二個或三個碳原子取代烷基的甲酰 胺。步驟⑴所述印記分子尼古丁、功能單體、交聯劑物質的量比例為 1 (2-10) (30-60)。所述功能單體為包括一個、二個或三個碳原子取代烯烴基的吡啶。 所述交聯劑為包括一個、二個或三個碳原子取代烷基的烯酸一元醇酯或多元醇酯。所述生 孔劑為包括十一個、十二個或十三個碳原子一元醇或多元醇。引發劑為一個、二個或三個烴 基的一取代或多取代偶氮睛。步驟(1)中所述震蕩為超聲震蕩或機械震蕩；震蕩時間30min-60min。所述通氮 氣時間為5-20min ；水浴溫度為40°C -80°C;水浴時間為3h_6h。毛細管連接到氮氣泵上，施 加壓力為10MPa-20Mpa ；時間持續5min-10min。用有機酸醇溶液沖洗毛細管以除去印記分 子尼古丁和致孔劑中有機酸為一個、二個或三個碳原子的一元有機酸或多元有機酸；醇為 一個、二個或三個碳原子的一元醇或多元醇；有機酸和醇體積比為1 (3-6)；有機酸醇溶 液的量為lmL-10mL。步驟(3)中所述磷酸鹽緩沖溶液pH控制在5-10 ；蛋白質可為牛血清白蛋白；蛋白 質濃度為5-20g/L。有機酸鹽為包含一個、二個或三個碳原子酸銨；調解pH為3-6。本發明的有益效果是高選擇性的尼古丁分子印記聚合物涂層毛細管，能夠有效 地將體液中尼古丁在線完全萃取(SPE)和預富集，然后用表面等離子體共振技術進行間接 免疫分析，從而實現體液中尼古丁的快速、準確定量分析。本發明的方法不僅可以測定諸如 體液這樣的復雜體系中尼古丁含量，而且選擇性強、靈敏度高、準確性好、操作簡便快速。
具體實施例方式本發明以下將結合實施例作進一步描述，但并不限制本發明。實施例1a、采用直接在活化的毛細管內聚合的方法制備尼古丁分子印跡聚合物涂層毛細 管。將0. 25mmol印跡分子尼古丁溶解在0. 5mL隊^二甲基甲酰胺中，再加入111111101 4-乙烯 基吡啶。將所得的混合物超聲振蕩30min，然后再加入5mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，2. 5mL 正十二醇和IOmg偶氮二異丁氰腈。將所得的混合物超聲振蕩30min使其混合均勻。最后 將所得的預聚合溶液通氮氣除氧5min，并用氮氣泵注射進入硅烷化活化的毛細管內。毛細 管兩端用橡皮塞封閉并放置在50°C的水浴中反應4h。聚合反應完成后，將毛細管連接到氮 氣泵上，施加15MPa的壓力除去未反應的溶液并使合成的聚合物壓縮到毛細管內壁上。該 過程持續5min。最后用2mL甲醇和乙酸的混合液(V/V = 4:1)沖洗毛細管以除去模板分 子尼古丁和致孔劑。
b、將尼古丁分子用乙基_ 二甲氨基丙基_碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺衍生并 鍵合到SPR裸金芯片上，將制備好的毛細管與生物傳感器聯用。C、采用磷酸鹽緩沖液 PBS(10mmol/L 磷酸鹽，137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/LKCl, pH 7. 4)稀釋Anti-NIC單克隆抗體(MAbs) 50倍，加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白濃度為 10g/L，采用乙酸銨處理尼古丁樣品和標樣，調節pH為4. 5。d、采用在線分子印記聚合物萃取_等離子體共振技術聯用測定體液中的尼古丁。
權利要求
一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在于依次包括以下步驟(1)將0.2mmol 0.5mmol的印記分子尼古丁溶解在烴基取代甲酰胺中，再加入功能單體，震蕩，然后再加入交聯劑和生孔劑、引發劑，震蕩，混合均勻，通氮氣后用氮氣泵注射進入硅烷化活化的毛細管內，在水浴下聚合，聚合反應完成后，將毛細管連接到氮氣泵上，施加壓力除去未反應的溶液并使合成的聚合物壓縮到毛細管內壁上，施壓完成后用有機酸醇溶液沖洗毛細管以除去印記分子尼古丁和致孔劑；(2)將尼古丁分子用乙基 二甲氨基丙基 碳二亞胺和N 羥基丁二酰亞胺衍生并鍵合到SPR裸金芯片上，將制備好的毛細管與生物傳感器聯用；(3)采用磷酸鹽緩沖液稀釋Anti NIC單克隆抗體，并加入蛋白質，采用有機酸鹽處理尼古丁樣品和標樣，調節pH；(4)采用在線分子印記聚合物萃取 等離子體共振技術聯用測定體液中的尼古丁首先將Anti NIC單克隆抗體溶液通過毛細管并進入傳感器芯片檢測，響應信號為RU1，將其作為參照，然后將待測的尼古丁溶液通過毛細管柱，尼古丁分子就被管內的聚合物涂層選擇性地萃取和富集，最后再將相同濃度的Anti NIC單克隆抗體溶液通過毛細管進入SPR芯片表面，Anti NIC單克隆抗體首先被毛細管涂層上萃取的NIC抑制，使剩下的進入芯片表面的Anti NIC單克隆抗體量減少，相應的響應信號也減弱，為RU2ΔRU＝RU1 RU2。
2.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在 于所述步驟(4)所述體液可為尿液、血液、血漿或吐液。
3.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在 于所述步驟(1)中所述烴基取代甲酰胺為包括一個、二個或三個碳原子取代烷基的甲酰 胺。
4.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法， 特征在于所述步驟(1)所述印記分子尼古丁、功能單體、交聯劑物質的量比例為 1 (2-10) (30-60)。
5.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在 于所述功能單體為包括一個、二個或三個碳原子取代烯烴基的吡啶；所述交聯劑為包括 一個、二個或三個碳原子取代烷基的烯酸一元醇酯或多元醇酯；所述生孔劑為包括十一個、 十二個或十三個碳原子一元醇或多元醇；引發劑為一個、二個或三個烴基的一取代或多取 代偶氮睛。
6.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在 于步驟(1)中所述震蕩為超聲震蕩或機械震蕩；震蕩時間30min-60min ；所述通氮氣時間 為5-20min ；水浴溫度為40°C -80°C ；水浴時間為3h_6h ；毛細管連接到氮氣泵上，施加壓力 為10MPa-20Mpa ；時間持續 5min_10min。
7.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在 于所述有機酸醇溶液沖洗毛細管以除去印記分子尼古丁和致孔劑中有機酸為一個、二個 或三個碳原子的一元有機酸或多元有機酸；醇為一個、二個或三個碳原子的一元醇或多元 醇；有機酸和醇體積比為1 (3-6)；有機酸醇溶液的量為lmL-10mL。
8.根據權利要求1所述的一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，特征在于步驟(3)中所述磷酸鹽緩沖溶液pH控制在5-10;蛋白質可為牛血清白蛋白；蛋白質濃 度為5-20g/L ；有機酸鹽為包含一個、二個或三個碳原子酸銨；調解pH為3-6。
全文摘要
一種測定體液中尼古丁的新型間接抑制免疫分析法，涉及體液中尼古丁的測定方法。依次包括以下步驟(1)以尼古丁為模板，制備分子印跡聚合物涂層毛細管；(2)將制備好的毛細管與生物傳感器聯用；(3)采用有機酸鹽處理尼古丁樣品和標樣，調節pH；(4)采用在線分子印記聚合物萃取-等離子體共振技術聯用測定體液中的尼古丁。本發明的有益效果是能夠有效地將體液中尼古丁在線完全萃取和預富集，可快速、準確定量分析體液中尼古丁。
文檔編號G01N33/53GK101963617SQ201010183989
公開日2011年2月2日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者唐萍萍, 蘇慶德, 蔡繼寶, 鄧宇 申請人:江西中煙工業有限責任公司