同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法

專利名稱：同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法
技術領域：
本發明涉及一種同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，尤其是涉及一種采用液相色譜串聯質譜而同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法。
背景技術：
(Lincomycin, LIN) β Streptomyces lincolnensis/^t白勺一類堿性抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌以及某些厭氧的革蘭氏陰性菌有效，可致轉氨酶升高及黃疸，可引起過敏反應，可引起低血壓或心臟驟停，可引起耳鳴、眩暈等反應。大環內酯類(Macrolides，MALs)是一類具有14元或16元碳內酯環共同化學結構的抗菌藥，主要作用于需氧革蘭氏陽性菌和陰性球菌、厭氧菌，以及軍團菌、胎兒彎曲菌、衣原體和支原體等， 大環內酯類及其代謝產物在動物的組織及器官內蓄積達到一定的濃度后，可造成前庭和耳蝸神經的損害，導致眩暈和聽力減退，嚴重者會造成肝腎的損害。
蜂王漿的主要進口國日本和歐盟對林可霉素和大環內酯類這兩種藥物的最大殘留限量(MRLs) —般以最低檢測限01 )1(^8/1^為標準，檢測方法主要有冗/^5/^5法、 GC/MS法、HPLC-ECD法、微生物杯蝶法；例如SN/T 2062-2008中的進出口蜂王漿中大環內酯類抗生素殘留量的檢測方法，GB/T20762-2006中的畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素殘留量的測定，GB/T 22941-2008中的蜂蜜中林可霉素、紅霉素、螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素殘留量的測定均屬于LC/MS/MS法，由于剛發表在華中農業大學碩士學位論文第2007年版第45-66頁上的動物性食品中大環內酯類和林可胺類多殘留定量與確證方法研究屬于GC/MS法，由劉素英和趙東豪發表在中國動物檢疫第2006年第23卷第12期第 28-30頁中的HPLC-ECD對尿中10種大環內酯類抗生素的多殘留檢測，由劉曄發表在江南大學碩士學位論文第2008年版上的動物性食品中大環內酯類抗生素殘留的HPLC分析均屬于HPLC-E⑶法，SN 0671-1997中的出口肉及肉制品中林可霉素殘留量檢驗方法屬于微生物杯蝶法。
由上可知，液相色譜-串聯質譜方法作為確證方法已經廣泛被國內外政府監督檢驗機構所運用，但由于不同種類的樣品成分不一樣，在使用液相色譜-串聯質譜方法進行檢測時，并非對所有樣品都能夠達到符合要求的檢出限，比如蜂王漿的基質復雜，樣品凈化困難，SN/T 2062-2008中的進出口蜂王漿中大環內酯類抗生素殘留量的檢測方法為蜂王漿中大環內酯類藥物進出口行業檢測標準，其檢測限為10 μ g/kg，但由于目前企業如要出口蜂王漿凍干粉，其所用原料蜂王漿中大環內酯類抗生素殘留量必需控制在3yg/kg以下， 這樣才能夠滿足蜂王漿凍干粉的出口要求，由此導致SN/T 2062-2008中的進出口蜂王漿中大環內酯類抗生素殘留量的檢測方法遠遠不能滿足要求，其他文獻報道的檢測方法有的采用了固相萃取技術，如由岳振峰、陳小霞、謝麗琪等發表在分析化學第2007年第35卷第 9期第1290-1294頁中的高效液相色譜串聯質譜法測定動物組織中林可酰胺類和大環內酯類抗生素殘留，從而提高了檢測成本；而有的單純用乙腈等溶劑作簡單提取，導致樣液中的雜質較多，基質效應大，達不到蜂王漿中對大環內酯類抗生素殘留量的要求檢測限，因此不適用于檢測蜂王漿中大環內酯類抗生素的殘留量。
綜上所述，目前還沒有一種方法簡單，檢測成本低，檢測效率高，檢測限小于1 μ g/ kg的用于同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，在蜂王漿檢測中難以滿足國外對林可霉素、大環內酯類殘留限量的要求。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，而提供一種方法簡單，檢測成本低，檢測效率高，檢測限小于1 μ g/kg的同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法。
本發明解決上述問題所采用的技術方案是該同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法的特點在于該方法所用到的原料包括純度> 99. 5%的林可霉素鹽酸鹽，純度> 92. 2%的紅霉素，純度> 95. 0%的泰樂菌素酒石酸鹽，純度> 96. 5%的竹桃霉素磷酸鹽，純度> 98. 5%的替米考星，純度> 72. 0%的吉他霉素，純度> 96. 0%的螺旋霉素，純度> 97. 5%的羅紅霉素，純度> 98.0%的交沙霉素，為農殘級的乙酸乙酯，為分析純的氨水、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉和無水Na2SO4,為優級純的正己烷，為液相色譜純的乙腈和乙酸銨，磷酸鹽緩沖溶液，初始流動相，水；所述磷酸鹽緩沖溶液通過13. 8g磷酸二氫鈉溶解于950mL水中，再用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值到8. 0，最后用水稀釋至IL制備而成；所述初始流動相中的有機相為乙腈，水相中含有體積濃度為0. 的甲酸和濃度為 0.5mmol/L的乙酸銨，所述有機相與水相的體積比為5 95; 該方法所用到的設備包括三重四極桿串聯質譜儀，配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、數據處理軟件的高效液相色譜儀，旋轉蒸發器；所述三重四極桿串聯質譜儀中的離子源溫度為600°C，輔助加熱氣GSl為70psi，干燥氣GS2為70psi，氣簾氣CUR為20psi，碰撞氣CAD為2psi，電噴霧電壓IS為4700V，離子化法為正離子模式；所述高效液相色譜儀為 Agilent 1200series，色譜柱為 Inertsil C8-3，色譜柱的規格為 2. 1 X 150mm，3 μ m，進樣量為 20 μ 1 ； 該方法包括標準溶液制備工序、蜂王漿樣品處理工序、標準曲線制作工序和蜂王漿樣品檢測工序；所述標準溶液制備工序如下a、混合貯備標準溶液配制步驟各稱取凈含量為IOmg的林可霉素鹽酸鹽、紅霉素、泰樂菌素酒石酸鹽、竹桃霉素磷酸鹽、替米考星、 吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，分別采用乙腈定容至IOml而配制成濃度均為1000mg/L的林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液，將上述林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液置于-18°C以下保存待用；b、混合中間標準液配制步驟 分別取a中的林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液各100 μ 1，分別采用乙腈定容至IOml而配制成濃度均為10mg/L的林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液；c、羅紅霉素內標配制步驟稱取凈含量為IOmg的羅紅霉素并用乙腈定容至IOml而配制成濃度為1000mg/L的羅紅霉素標準混合貯備液，取羅紅霉素標準混合貯備液100 μ 1用乙腈定容至IOml而配制成濃度為10mg/L的羅紅霉素內標中間溶液；d、臨時標準使用液配制步驟取林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒 石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液分別用乙腈配制成濃度為100μ g/kg的一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液，再取林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液分別用乙腈配制成濃度為1000 μ g/kg的二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液，再取羅紅霉素內標中間溶液用乙腈配制成濃度為200 μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液； 所述蜂王漿樣品處理工序中，a、先稱取蜂王漿樣品5g加入IOml水制得蜂王漿樣品液；b、然后將蜂王漿樣品液置于100ml離心塑料瓶中，再向100ml離心塑料瓶中加入濃度為200 μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液100 μ 1并旋渦混合3min，然后靜置15min后再向100ml離心塑料瓶中加入40ml體積濃度為97 %的乙腈氨水提取液并混合均勻，然后對置于100ml離心塑料瓶中的液體進行超聲提取lOmin，再在轉速為3000rpm下離心5min得到一號上清液；吸取25ml —號上清液置于50ml —號離心瓶中，再向50ml —號離心瓶中緩緩加入IOg無水Na2SO4后立即用力振蕩脫水，然后在轉速為3000rpm下離心2min得到二號上清液，將二號上清液置于50ml玻璃離心瓶中，再將5ml體積濃度為97%的乙腈氨水提取液置于50ml —號離心瓶中，然后向50ml —號離心瓶中緩緩加入IOg無水Na2SO4后立即用力振蕩脫水，然后在轉速為3000rpm下離心2min得到三號上清液，將三號上清液置于50ml 玻璃離心瓶中；將50ml玻璃離心瓶中的液體置于旋轉蒸發器上于35°C以下減壓濃縮至干得到殘渣，然后用5ml磷酸鹽緩沖溶液將殘渣移到15ml塑料離心管中，再向15ml塑料離心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取lmin，再對15ml塑料離心管中的液體在轉速為3000rpm下離心5min后分層，然后取乙酸乙酯層置于IOml離心管中并用氮氣吹干，再向 IOml離心管中加入初始流動相Iml并進行超聲溶解，然后加入2ml正己烷并用力手動振搖充分混合去脂，再在轉速為SOOrpm下離心2min而得到下層樣液，將下層樣液過0. 22 μ m濾膜而制得上機檢測樣液； 所述標準曲線制作工序中，先稱取5份重量均為5. Og的陰性蜂王漿樣品分別置于一號試劑瓶、二號試劑瓶、三號試劑瓶、四號試劑瓶和五號試劑瓶中，然后向一號試劑瓶中加入一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液各250 μ 1制得一號陰性蜂王漿液；向二號試劑瓶中加入一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、 一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液各500 μ 1制得二號陰性蜂王漿液；向三號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各250 μ 1制得三號陰性蜂王漿液；向四號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各400 μ 1制得四號陰性蜂王漿液；向五號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各 500 μ 1制得五號陰性蜂王漿液；然后分別用一號陰性蜂王漿液、二號陰性蜂王漿液、三號陰性蜂王漿液、四號陰性蜂王漿液和五號陰性蜂王漿液來代替蜂王漿樣品處理工序中的蜂王漿樣品液，并重復蜂王漿樣品處理工序中的b步驟而分別制得一號標準液、二號標準液、 三號標準液、四號標準液和五號標準液，該一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液的系列濃度為5 μ g/kg、10 μ g/kg、50 μ g/kg、80 μ g/kg和100 μ g/kg ；將一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀得到標準曲線； 所述蜂王漿樣品檢測工序中，將蜂王漿樣品處理工序中制得的上機檢測樣液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀，并結合標準曲線而測得蜂王漿中林可霉素和大環內酯類的殘留量；該方法的檢測限達0. 2-0. 9 μ g/kg。
本發明所述蜂王漿樣品處理工序中所用的蜂王漿樣品為蜂王漿凍干粉，該蜂王漿樣品加入IOml水混合后再靜置12-16h，然后再按照蜂王漿樣品處理工序中的b步驟進行。
本發明所使用的水均為雙重蒸餾水。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果能夠同時測定蜂王漿中的林可霉素、大環內酯類藥物殘留，與固相萃取方法相比不增加溶劑用量，不采用固相萃取小柱，凈化后的樣品無色透明，在質譜圖上無干擾，連續進樣50次后，三重四極桿串聯質譜儀中的離子源氣簾板仍保持干凈，樣品凈化效果良好。
由于基質效應的存在，會給方法定量帶來困難，本發明采用羅紅霉素為內標，用陰性基質樣品添加標準品繪制標準曲線來消除基質的影響，定量結果準確。本方法的檢測限達到0. 2-0. 9 μ g/kg，線性相關系數在0. 9914-0. 9994，回收率在76. 7% -119%，相對標準偏差在6. 7 % -14. 1 %，精密度良好，完全滿足進口國對蜂王漿中林可霉素、大環內酯類藥物殘留限量的要求。本發明也能夠適用于同時測定蜂蜜中林可霉素和大環內酯類殘留量。
本發明充分發揮了質譜的優勢，利用一種樣品凈化方法，同時檢測多種殘留，提高了檢測效率，利于原料收購篩選、及時指導生產加工。本發明的方法簡單，快速，準確，試劑用量少，檢測成本低；能夠節約人力，提高效率。


圖1是本發明實施例中蜂王漿陰性樣品添加80 μ g/kg標準濃度時，蜂王漿LC-MS/ MS測定的八種藥物殘留的總離子流圖； 圖2是本發明實施例中蜂王漿陰性樣品添加80 μ g/kg標準濃度時，蜂王漿LC-MS/ MS測定的八種藥物殘留的提取離子流圖。
具體實施例方式下面結合附圖并通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。
實施例 參見圖1和圖2，本實施例里同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法包括標準溶液制備工序、蜂王漿樣品處理工序、標準曲線制作工序和蜂王漿樣品檢測工序。
本實施例中所用到的原料包括均來自德國Dr. Ehrenstorfer公司的純度 >99. 5%的林可霉素鹽酸鹽(Lincomycin hydrochloride)、純度> 92. 2 %的紅霉素 (Erythromycin)、純度> 95. 0%的泰樂菌素酒石酸鹽(Tylosin tartrate)、純度> 96. 5% 的竹桃霉素磷酸鹽(Oleandomycin phosphate dihydrate)、純度> 98. 5 %的替米考星(Tilmicosin)、純度> 72. O %的吉他霉素(Kitasamycin)、純度> 96.0%的螺旋霉素 (Spiramycin)和純度> 97. 5%的羅紅霉素(Roxithromycin)；來自德國Sigma公司的純度 >98.0%的交沙霉素(Josamycin)；為農殘級的乙酸乙酯；為分析純的氨水、磷酸二氫鈉、 氫氧化鈉和無水Na2SO4 ；為優級純的正己烷；為液相色譜純的乙腈和乙酸銨；磷酸鹽緩沖溶液；初始流動相；水。其中，磷酸鹽緩沖溶液通過13. 8g磷酸二氫鈉溶解于950mL水中，再用 0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值到8.0，最后用水稀釋至IL制備而成；初始流動相中的有機相為乙腈，水相中含有體積濃度為0. 的甲酸和濃度為0. 5mmol/L的乙酸銨，所述有機相與水相的體積比為5 95;所使用的水均為雙重蒸餾水。
本實施例中所用到的設備包括API3200三重四極桿串聯質譜儀；安捷倫1200高效液相色譜儀配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣器、Analyst數據處理軟件；Sartorius BS224S分析天平；PHS-3C雷磁精密pH計；無錫市瑞江分析儀器有限公司制造的 RJ-TDL-40B低速臺式大容量離心機；Organomation N-EVAP 111氮吹儀；上海亞榮生化儀器廠制造的RE-52A旋轉蒸發器；昆山超聲儀器有限公司制造的KQ-100超聲波清洗器。其中，API3200三重四極桿串聯質譜儀中的離子源溫度為600°C，輔助加熱氣GSl為70psi，干燥氣GS2為70psi，氣簾氣CUR為20psi，碰撞氣CAD為2psi，電噴霧電壓IS為4700V，離子化法為正離子模式；高效液相色譜儀為Agilent 1200series，色譜柱為Inertsil C8-3，色譜柱的規格為2. 1 X 150mm, 3 μ m,進樣量為20 μ 1。
本實施例中的標準溶液制備工序如下a、混合貯備標準溶液配制步驟各稱取凈含量為IOmg的林可霉素鹽酸鹽、紅霉素、泰樂菌素酒石酸鹽、竹桃霉素磷酸鹽、替米考星、 吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，可以通過這些標準品說明書中所標示的純度折算實際需要稱取的凈含量值，然后分別采用乙腈定容至IOml而配制成濃度均為1000mg/L的林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液；將上述林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合C備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液置于_18°C以下保存待用。b、混合中間標準液配制步驟分別取 a中的林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液各100 μ 1，分別采用乙腈定容至IOml而配制成濃度均為10mg/L的林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液。C、羅紅霉素內標配制步驟稱取凈含量為IOmg的羅紅霉素并用乙腈定容至IOml而配制成濃度為1000mg/L的羅紅霉素標準混合貯備液，取羅紅霉素標準混合貯備液100 μ 1 用乙腈定容至IOml而配制成濃度為10mg/L的羅紅霉素內標中間溶液；凈含量為IOmg的羅紅霉素可以通過標準品說明書中所標示的純度折算實際需要稱取的毫克數。d、臨時標準使用液配制步驟取b步驟中制備而成的林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液分別用乙腈配制成濃度為100μ g/kg的一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液；再取b步驟中制備而成的林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液分別用乙腈配制成濃度為1000 μ g/kg的二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液；再取c步驟中制備而成的羅紅霉素內標中間溶液用乙腈配制成濃度為200μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液。
本實施例的蜂王漿樣品處理工序中，a、先稱取蜂王漿樣品5g加入IOml水制得蜂王漿樣品液，若本發明中所使用的蜂王漿樣品為蜂王漿凍干粉，則應該將蜂王漿樣品加入 IOml水混合后再靜置12-16h。b、將蜂王漿樣品液置于100ml離心塑料瓶中，再向100ml離心塑料瓶中加入濃度為200μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液100 μ 1并旋渦混合3min，然后靜置15min后再向IOOml離心塑料瓶中加入40ml體積濃度為97%的乙腈氨水提取液并混合均勻，采用體積濃度為97 %的乙腈氨水做為提取液使得整個樣品凈化過程都無需使用固相萃取小柱；然后對置于IOOml離心塑料瓶中的液體采用超聲波儀進行超聲提取 IOmin,再采用離心機在轉速為3000rpm下離心5min得到一號上清液。然后吸取25ml —號上清液置于50ml —號離心瓶中，再向50ml —號離心瓶中緩緩加入IOg無水Na2SO4后立即用力振蕩脫水，然后采用離心機在轉速為3000rpm下離心2min得到二號上清液，將二號上清液置于50ml玻璃離心瓶中；再將5ml體積濃度為97%的乙腈氨水提取液置于50ml —號離心瓶中，然后向50ml —號離心瓶中緩緩加入IOg無水Na2SO4后立即用力振蕩脫水，也就是對殘留在50ml —號離心瓶中的物質進行重復脫水操作，然后采用離心機在轉速為3000rpm 下離心2min得到三號上清液，將三號上清液置于50ml玻璃離心瓶中，從而得到二號上清液和三號上清液的混合物。接下來將裝有二號上清液和三號上清液混合物的50ml玻璃離心瓶置于旋轉蒸發器上并于35°C以下進行減壓濃縮至干而得到殘渣。然后用5ml磷酸鹽緩沖溶液將減壓濃縮而成的殘渣移到15ml塑料離心管中，再向15ml塑料離心管中加入5ml 乙酸乙酯并充分混合，然后提取lmin，再對15ml塑料離心管中的液體采用離心機在轉速為 3000rpm下離心5min后分層，然后取乙酸乙酯層置于IOml離心管中并采用氮吹儀進行氮氣吹干，再向IOml離心管中加入初始流動相Iml并進行超聲溶解，然后加入2ml正己烷并用力手動振搖充分混合去脂，再采用離心機在轉速為SOOrpm下離心2min而得到下層樣液，將下層樣液過0. 22 μ m濾膜而制得上機檢測樣液。
本實施例的標準曲線制作工序中，先稱取5份重量均為5. Og的陰性蜂王漿樣品分別置于一號試劑瓶、二號試劑瓶、三號試劑瓶、四號試劑瓶和五號試劑瓶中，陰性蜂王漿樣品對本領域技術人員來說為公知常識；然后向一號試劑瓶中加入一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液各250 μ 1制得一號陰性蜂王漿液；向二號試劑瓶中加入一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液各500 μ 1制得二號陰性蜂王漿液；向三號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各250 μ 1制得三號陰性蜂王漿液；向四號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各400 μ 1 制得四號陰性蜂王漿液；向五號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各500 μ 1制得五號陰性蜂王漿液。然后分別用一號陰性蜂王漿液、二號陰性蜂王漿液、三號陰性蜂王漿液、四號陰性蜂王漿液和五號陰性蜂王漿液來代替蜂王漿樣品處理工序中的蜂王漿樣品液，并重復蜂王漿樣品處理工序中的b步驟而分別制得一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液，例如用一號陰性蜂王漿液來代替蜂王漿樣品處理工序中的蜂王漿樣品液，并重復蜂王漿樣品處理工序中的b步驟而制得一號標準液。本實施例中的一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液的系列濃度為5 μ g/kg、10 μ g/kg、50 μ g/kg、80 μ g/kg 和100 μ g/kg ；將一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀得到標準曲線。本實施例中的高效液相色譜儀采用液相梯度程序，表1為高效液相色譜儀的液相梯度洗脫程序表，三重四極桿串聯質譜儀對林可霉素、紅霉素、泰樂菌素、竹桃霉素、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素這八種藥物殘留及羅紅霉素內標的質譜參考條件參見表2，表1和表2的內容如下 表1高效液相色譜儀的液相梯度洗脫程序表
表2三重四極桿串聯質譜儀對八種藥物殘留及內標的質譜參考條件表 、
注表中帶下劃線黑體字為定量離子。
需要說明的是，本發明中的高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀均為現有技術，高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀的操作對本領域技術人員來說為公知常，故此處均不再詳述。
本實施例的蜂王漿樣品檢測工序中，將蜂王漿樣品處理工序中制得的上機檢測樣液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀，并結合標準曲線而測得蜂王漿中林可霉素和大環內酯類的殘留量；該方法的檢測限達0. 2-0. 9 μ g/kg。
本發明中對樣品的凈化方法進行了優化，文獻報道的藥物殘留檢測方法和現行標準檢測方法大多采用先液液萃取再固相萃取的方法來達到樣品凈化的目的，有的則只用有機溶劑直接液液萃取來凈化樣品，也有的用酸性溶液來沉淀樣品中的蛋白質。由于林可霉素(Lincomycin，LIN)和大環內酯類(Macrolides，MALs)均為弱堿性化合物，在干燥狀態下相當穩定，易溶于酸性水溶液。林可霉素鹽酸鹽水溶液的PH = 3. 5-5. 5，林可霉素的PKa 是7. 6 ；大環內酯類在酸性條件下(pH < 4)苷鍵水解，在堿性條件(pH > 9)內酯環開裂， 在PH = 6-8的中性水溶液中較穩定，并易溶于乙酸乙酯等有機溶劑。此為液液萃取凈化樣品提供了理論支持，可以不用固相萃取技術，降低檢測成本，而溶劑消耗并沒有增加。
本發明研究了直接用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑提取凈化蜂王漿樣品，結果發現處理后的樣液中雜質多，顏色呈黃色，進樣達到10個以上時，氣簾板(curtain plate) 即染上黃色，說明樣品臟，影響儀器壽命，因而不適宜做大量的樣品。研究了用酸先沉淀蛋白質，達到凈化樣品的目的，結果發現林可霉素和MALs的絕對回收率僅為10. 2% -12. 6%, 這可能是因為蜂王漿的PH值在3. 5-4. 5之間時，其本身性質偏酸，再加入酸溶液，其樣液的 PH值必然小于4，易引起藥物降解，導致回收率偏低。
蜂王漿含有大量的有機酸、蛋白質、氨基酸等物質，呈酸性，因此，本方法采用了乙腈-氨水溶液體系，提取藥物殘留。一方面，可以使樣品溶液呈弱堿性，使藥物呈穩定的分子狀態，易被乙腈所提取；另一方面，可以使蜂王漿中的酸類物質呈鹽，增加極性，從而不會被有機溶劑所溶解，達到凈化目的。采用乙腈_氨水體系同時可以沉淀蛋白質。
研究了乙腈-氨水的混合比例，發現乙腈氨水=97 3(體積比)時，提取液的 PH值最接近6-8，提取離心后分層明顯。蜂王漿經過乙腈-氨水(97+3，體積比)溶液體系提取后，過無水硫酸鈉脫水后蒸干，發現仍有少量雜質，故將蒸干后的試樣用pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液溶解，用極性比乙腈更弱的乙酸乙酯再次反萃取凈化。為了進一步凈化樣品， 我們對進樣前的樣液進行脫脂處理，本方法采用了常用的烴類正己烷作為脫脂溶劑。
通過上述方法對樣品進行凈化，得到了無色澄明的進樣樣液，基質效應低，色譜圖上目標峰無干擾，連續進樣50次以上氣簾板(curtain plate)仍無可見的污染，說明樣品凈化良好。
本發明對高效液相色譜儀的液相色譜條件進行優化，為了保證不同性質的多殘留在色譜柱上的分離效率，在本方法的研究中，我們擬選用Hypersil、Akasil, Venusil MP、 Shim-pack VP、Inertsil, Atlantis、Agilent等型號的色譜柱，尋找分離度及保留時間穩定性好、靈敏度高、峰形窄而對稱、定量離子無干擾、性價比優良的色譜柱，經過試驗，發現 Inertsi 1C8-3色譜柱的靈敏度最好，峰形尖銳，性價比高，故被本方法采用。
本方法的流動相采用了常用的酸性水相和有機相并作梯度洗脫，以提高分離度和靈敏度，常用酸主要有甲酸、乙酸，我們根據實際情況，研究流動相中不同濃度的甲酸或乙酸對分離效果的影響，分別用體積濃度為0. 1%、0.2%、0.4%、1.0% (V/V)的甲酸或乙酸， 并選擇合適的揮發性鹽類，提高離子化效率，以獲得分離良好，峰形對稱、信號強度大、靈敏度高的色譜圖，結果體積濃度為0. 甲酸溶液的色譜峰信號最強。
為了提高被測化合物的離子化效率，研究了流動相中揮發性鹽類乙酸銨的最適濃度，發現流動相水相中含有50mmol/L的乙酸銨時色譜信號得到最大幅度的增強，提高了靈敏度。但是，流動相中高濃度的鹽類對色譜柱、質譜儀均會產生污染，影響設備的使用壽命。 故在樣液中的水相添加50mmol/L的乙酸銨，而流動相中水相仍含0. 5mmol/L的乙酸銨，經過試驗，表明這樣仍能保證足夠的靈敏度。
采用不同的梯度條件，分析色譜柱對多殘留的色譜行為，優選出最佳梯度條件。同時優化流動相流速、柱溫，以取得最優的色譜圖，優化結果參見表1。
本發明對三重四極桿串聯質譜儀的質譜條件進行優化，配制Ippm濃度的各種殘留標準溶液，用針泵以5 μ L/mL的流速進入質譜儀，以正離子模式進行QlMS (Ql)全掃描，確定分子離子峰，調節離子源電壓、DP、EP參數，再以分子離子峰作為母離子，進行子離子掃描，調節CE參數，使母離子的強度占子離子強度的1/3 1/4為最佳，從質譜圖中選擇2-4 個信號較強的子離子作為定性離子，離子豐度最強的子離子為定量離子，采用針泵流動注射標準溶液，手動運行RAMP進行參數優化。
質譜參數確定后，連接液相色譜進樣，由于各種殘留的離子源溫度、輔助加熱氣、 干燥氣、氣簾氣、電噴霧電壓等參數在單純質譜條件下是不一樣的，因此選擇適中的一組參數在液相條件下再進行優化，在液相條件下進樣10μ g/kg的混標，再逐個進行優化與微調，使各種物質的靈敏度、峰形達到最佳。經過多次調整得到目前最佳質譜條件參見表2。
下面來對本發明的線性范圍、檢出限、回收率和精密度進行分析，配制八種殘留的系列陰性樣品基質混合標準溶液，按照本方法設定的色譜條件進樣測定。以y表示峰面積 (A)，χ表示濃度C ( μ g/kg)，運用EXCEL軟件，求得回歸方程和線性相關系數，得到線性范圍，八種殘留線性范圍為5 μ g/kg-100 μ g/kg,線性相關系數為0. 9914-0. 9994，檢出限(以信噪比S/N = 3計)為0. 2-0. 9 μ g/kg,定量限(以信噪比S/N = 10計)為0. 6-2. 6 μ g/ kg。在蜂王漿陰性樣品中，分別添加三個濃度的殘留標準品，每個濃度做三次平行試驗，按本方法進行樣品的處理與測定，確定本方法的回收率和相對標準偏差，結果參見表3。
表3方法的線性范圍、檢出限、回收率、精密度和檢測限表(η = 3)
本發明能夠同時測定蜂王漿中的林可霉素、大環內酯類藥物殘留，與固相萃取方法相比不增加溶劑用量，不采用固相萃取小柱，凈化后的樣品無色透明，在質譜圖上無干擾，連續進樣50次，離子源氣簾板(curtin plate)仍保持干凈，樣品凈化效果良好。
本發明的檢測限達到0. 2-0. 9 μ g/kg,相關系數在0. 9914-0. 9994，回收率在 76.7% -119%，相對標準偏差在6.7% -14. 1 %，精密度良好，完全滿足進口國對蜂王漿中藥物殘留限量的要求。
本發明充分發揮了質譜的優勢，利用一種樣品凈化方法，同時檢測多種殘留，提高了檢測效率，利于原料收購篩選、及時指導生產加工。由于基質效應的存在，給方法定量帶來困難，本方法采用羅紅霉素為內標，用陰性基質樣品添加標準品繪制標準曲線來消除基質的影響，定量結果準確。
本發明的方法簡單，快速，準確，試劑用量少，檢測成本低；能夠節約人力，提高效率；檢測限小于ι μ g/kg，能夠充分滿足目前國外對蜂王漿中林可霉素、大環內酯類殘留限量的要求。
雖然本發明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發明的保護范圍，任何熟悉該項技術的技術人員，在不脫離本發明的構思和范圍內所作的更動與潤飾，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1. 一種同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，其特征在于該方 法所用到的原料包括純度> 99. 5%的林可霉素鹽酸鹽，純度> 92. 2%的紅霉素，純度> 95. O %的泰樂菌素酒石酸鹽，純度> 96. 5%的竹桃霉素磷酸鹽，純度> 98. 5%的替米考 星，純度> 72. O%的吉他霉素，純度> 96. O%的螺旋霉素，純度> 97. 5%的羅紅霉素，純度 >98.0%的交沙霉素，為農殘級的乙酸乙酯，為分析純的氨水、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉和無 水Na2SO4，為優級純的正己烷，為液相色譜純的乙腈和乙酸銨，磷酸鹽緩沖溶液，初始流動 相，水；所述磷酸鹽緩沖溶液通過13. 8g磷酸二氫鈉溶解于950mL水中，再用0. lmol/L的氫 氧化鈉溶液調節PH值到8. 0，最后用水稀釋至IL制備而成；所述初始流動相中的有機相為 乙腈，水相中含有體積濃度為0. 的甲酸和濃度為0. 5mmol/L的乙酸銨，所述有機相與水 相的體積比為5 95;該方法所用到的設備包括三重四極桿串聯質譜儀，配有二元泵、在線脫氣機、自動進樣 器、數據處理軟件的高效液相色譜儀，旋轉蒸發器；所述三重四極桿串聯質譜儀中的離子源 溫度為600°C，輔助加熱氣GSl為70psi，干燥氣GS2為70psi，氣簾氣CUR為20psi，碰撞 氣CAD為2psi，電噴霧電壓IS為4700V，離子化法為正離子模式；所述高效液相色譜儀為 Agilent 1200series，色譜柱為 Inertsil C8-3，色譜柱的規格為 2. 1 X 150mm，3 μ m，進樣量 為 20 μ 1 ；該方法包括標準溶液制備工序、蜂王漿樣品處理工序、標準曲線制作工序和蜂王漿樣 品檢測工序；所述標準溶液制備工序如下a、混合貯備標準溶液配制步驟各稱取凈含量 為IOmg的林可霉素鹽酸鹽、紅霉素、泰樂菌素酒石酸鹽、竹桃霉素磷酸鹽、替米考星、吉他 霉素、螺旋霉素和交沙霉素，分別采用乙腈定容至IOml而配制成濃度均為1000mg/L的林可 霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、 竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺 旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液，將上述林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備 液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合 貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液 和交沙霉素標準混合貯備液置于_18°C以下保存待用；b、混合中間標準液配制步驟分別 取a中的林可霉素鹽酸鹽標準混合貯備液、紅霉素標準混合貯備液、泰樂菌素酒石酸鹽標 準混合貯備液、竹桃霉素磷酸鹽標準混合貯備液、替米考星標準混合貯備液、吉他霉素標準 混合貯備液、螺旋霉素標準混合貯備液和交沙霉素標準混合貯備液各100 μ 1，分別采用乙 腈定容至IOml而配制成濃度均為10mg/L的林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合 中間標準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考 星混合中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合 中間標準液；c、羅紅霉素內標配制步驟稱取凈含量為IOmg的羅紅霉素并用乙腈定容至 IOml而配制成濃度為1000mg/L的羅紅霉素標準混合貯備液，取羅紅霉素標準混合貯備液 100μ 1用乙腈定容至IOml而配制成濃度為10mg/L的羅紅霉素內標中間溶液；d、臨時標準 使用液配制步驟取林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標準液、泰樂菌素酒 石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合中間標準液、吉他 霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標準液分別用乙腈配 制成濃度為100μ g/kg的一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和 一號交沙霉素臨時標準使用液，再取林可霉素鹽酸鹽混合中間標準液、紅霉素混合中間標 準液、泰樂菌素酒石酸鹽混合中間標準液、竹桃霉素磷酸鹽混合中間標準液、替米考星混合 中間標準液、吉他霉素混合中間標準液、螺旋霉素混合中間標準液和交沙霉素混合中間標 準液分別用乙腈配制成濃度為ΙΟΟΟμ g/kg的二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號 紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨 時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉 素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液，再取羅紅霉素內標中間溶液用乙腈配 制成濃度為200 μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液；所述蜂王漿樣品處理工序中，a、先稱取蜂王漿樣品5g加入IOml水制得蜂王漿樣品 液；b、然后將蜂王漿樣品液置于IOOml離心塑料瓶中，再向IOOml離心塑料瓶中加入濃度為 200 μ g/kg的羅紅霉素內標臨時標準使用液100 μ 1并旋渦混合3min，然后靜置15min后再 向IOOml離心塑料瓶中加入40ml體積濃度為97%的乙腈氨水提取液并混合均勻，然后對 置于IOOml離心塑料瓶中的液體進行超聲提取lOmin，再在轉速為3000rpm下離心5min得 到一號上清液；吸取25ml —號上清液置于50ml —號離心瓶中，再向50ml —號離心瓶中緩 緩加入IOg無水Na2SO4后立即用力振蕩脫水，然后在轉速為3000rpm下離心2min得到二號 上清液，將二號上清液置于50ml玻璃離心瓶中，再將5ml體積濃度為97%的乙腈氨水提取 液置于50ml —號離心瓶中，然后向50ml —號離心瓶中緩緩加入IOg無水Na2SO4后立即用 力振蕩脫水，然后在轉速為3000rpm下離心2min得到三號上清液，將三號上清液置于50ml 玻璃離心瓶中；將50ml玻璃離心瓶中的液體置于旋轉蒸發器上于35°C以下減壓濃縮至干 得到殘渣，然后用5ml磷酸鹽緩沖溶液將殘渣移到15ml塑料離心管中，再向15ml塑料離心 管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取lmin，再對15ml塑料離心管中的液體在轉速 為3000rpm下離心5min后分層，然后取乙酸乙酯層置于IOml離心管中并用氮氣吹干，再向 IOml離心管中加入初始流動相Iml并進行超聲溶解，然后加入2ml正己烷并用力手動振搖 充分混合去脂，再在轉速為SOOrpm下離心2min而得到下層樣液，將下層樣液過0. 22 μ m濾 膜而制得上機檢測樣液；所述標準曲線制作工序中，先稱取5份重量均為5. Og的陰性蜂王漿樣品分別置于一 號試劑瓶、二號試劑瓶、三號試劑瓶、四號試劑瓶和五號試劑瓶中，然后向一號試劑瓶中加 入一號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石 酸鹽臨時標準使用液、一號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用 液、一號吉他霉素臨時標準使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標 準使用液各250 μ 1制得一號陰性蜂王漿液；向二號試劑瓶中加入一號林可霉素鹽酸鹽臨 時標準使用液、一號紅霉素臨時標準使用液、一號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、一號 竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、一號替米考星臨時標準使用液、一號吉他霉素臨時標準 使用液、一號螺旋霉素臨時標準使用液和一號交沙霉素臨時標準使用液各500 μ 1制得二 號陰性蜂王漿液；向三號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素 臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準 使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各250μ 1制得三號陰性蜂王漿液；向四號試劑瓶中加入二號林可霉素鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂 菌素酒石酸鹽臨時標準使用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時 標準使用液、二號吉他霉素臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉 素臨時標準使用液各400 μ 1制得四號陰性蜂王漿液；向五號試劑瓶中加入二號林可霉素 鹽酸鹽臨時標準使用液、二號紅霉素臨時標準使用液、二號泰樂菌素酒石酸鹽臨時標準使 用液、二號竹桃霉素磷酸鹽臨時標準使用液、二號替米考星臨時標準使用液、二號吉他霉素 臨時標準使用液、二號螺旋霉素臨時標準使用液和二號交沙霉素臨時標準使用液各500 μ 1 制得五號陰性蜂王漿液；然后分別用一號陰性蜂王漿液、二號陰性蜂王漿液、三號陰性蜂王 漿液、四號陰性蜂王漿液和五號陰性蜂王漿液來代替蜂王漿樣品處理工序中的蜂王漿樣品 液，并重復蜂王漿樣品處理工序中的b步驟而分別制得一號標準液、二號標準液、三號標準 液、四號標準液和五號標準液，該一號標準液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號 標準液的系列濃度為 5μ g/kg、10l·! g/kg、50l·! g/kg、80l·! g/kg 和 100 μ g/kg ；將一號標準 液、二號標準液、三號標準液、四號標準液和五號標準液通過高效液相色譜儀和三重四極桿 串聯質譜儀得到標準曲線；所述蜂王漿樣品檢測工序中，將蜂王漿樣品處理工序中制得的上機檢測樣液通過高效 液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀，并結合標準曲線而測得蜂王漿中林可霉素和大環內 酯類的殘留量；該方法的檢測限達0. 2-0. 9 μ g/kg。
2.根據權利要求1所述的同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，其 特征在于所述蜂王漿樣品處理工序中所用的蜂王漿樣品為蜂王漿凍干粉，該蜂王漿樣品 加入IOml水混合后再靜置12-16h，然后再按照蜂王漿樣品處理工序中的b步驟進行。
3.根據權利要求1所述的同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，其 特征在于該方法所使用的水均為雙重蒸餾水。
全文摘要
本發明涉及一種采用液相色譜串聯質譜而同時測定蜂王漿中林可霉素和大環內酯類殘留量的方法，目前該方法還達不到檢測成本低，檢測限小于1μg/kg的目的。本發明包括標準溶液制備、蜂王漿樣品處理、標準曲線制作和蜂王漿樣品檢測工序；蜂王漿樣品處理工序中使用體積濃度為97％的乙腈氨水做為提取液，將50ml玻璃離心瓶中經減壓濃縮后的殘渣用磷酸鹽緩沖溶液來轉移，再向乙酸乙酯混合進行提取；最后將上機檢測樣液通過高效液相色譜儀和三重四極桿串聯質譜儀測得蜂王漿中林可霉素和大環內酯類的殘留量。本發明檢測成本低，檢測效率高，檢測限達到0.2-0.9μg/kg，線性相關系數在0.9914-0.9994。
文檔編號G01N30/06GK101846661SQ20101018134
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月24日 優先權日2010年5月24日
發明者周萍, 錢志來, 陳建清, 毛增亮 申請人:杭州蜂之語蜂業股份有限公司