專利名稱：用于自動分析樣本的基于離心力的微流體系統和方法
技術領域：
本發明屬于醫療分析領域，并涉及用于自動分析樣本的基于離心力的微流體系統 和方法，所述樣本包含至少一種分析物，其中涉及使用適于專門與分析物相互作用的磁響 應顆粒。
背景技術：
在醫療診斷中，可看到對自動分析體液的強烈需求，這主要是因為對大量臨床分 析持續增加的事實。由于樣本消耗低、分析時間快和樣本產量高，因而近年來已經進行很多 努力以開發用于自動分析具有低至微升的微小用量的樣本的微流體系統，其屬于基于離心 力的微流體系統。通常，基于離心力的微流體系統包括用于接納樣本的多個微流體結構。每個微流 體結構能夠使個體樣本從入口區傳送到反應室，以能夠進行分析物反應并進行反應產物檢 測，從而確定分析物存在與否和可選地確定分析物濃度。基于離心力的微流體系統對于本領域技術人員而言是公知的，并已經在專利文獻 中被大量描述，例如在美國專利公開物US2008/0252905 Al、US 2008/02371151 A1和US 2008/0206110 Al 中描述。本發明的目的在于提供用于自動分析樣本的改進的基于離心力的微流體系統和 方法。這一目的通過根據獨立權利要求的系統和方法得以實現。本發明的優選實施例通過 從屬權利要求的特征給出。
發明內容
根據本發明的第一方案，提供一種新的用于自動分析樣本的基于離心力的微流體 系統，所述樣本包含至少一種分析物，其中，涉及使用適于專門與分析物相互作用的磁響應 顆粒。根據本發明的基于離心力的微流體系統可用于(生物)化學，包括活體外部診斷， 并且適于執行各種測定，通常包括樣本與試劑之間的混合以及檢測這些反應的結果。所述 系統可例如用于診斷測定，例如化學測定和免疫測定。典型的診斷測定例如包括分析物的 定性和/或定量分析，所述分析物例如為清蛋白，ALP (堿磷酸酶)、ALT (丙胺酸轉氨酶)、 氨、淀粉酶、門冬氨酸、轉氨酶、碳酸氫鹽、膽紅素、鈣、心臟標記、膽固醇、肌氨酸酐激酶、 D- 二聚物、乙醇、g-谷氨酰轉移酶、葡萄糖、HBAlc (血色素Ale)、HDL-膽固醇、鐵、乳酸鹽、 乳酸脫氫酶、LDL-膽固醇、脂肪酶、鎂、無機磷、鉀、鈉、總蛋白質、甘油三酸酯、UREA和尿酸。 這一名單并未窮盡。根據本發明，樣本是液態流體，其中可能存在一種或多種所關注的分析物。樣本可 為化學制品，所述系統可適于執行一種或多種化學含量測定，例如藥物相互作用篩分，環 境分析，有機物質辨識，等等。樣本也可為生物制品，例如體液，如血液、血清、奶、唾液、腦脊 髓流體，等等。
根據本發明，術語“試劑”用于表示任何液體，例如，將與樣本和/或其它試劑混合 以例如進行反應或能夠實現檢測的溶劑或化學溶液。試劑可例如為與第一樣本相互作用的 另一樣本。試劑也可為諸如水之類的稀釋液體。試劑可包括有機溶劑或清潔劑。試劑也可 為緩沖劑。在更嚴格的術語意義上，試劑可為包含反應物的液態溶液，反應物典型地為例如 能夠結合到或轉變樣本中存在的一種或多種分析物的化合物或藥劑。反應物的示例為酶 類，酶底物，成對染色體，蛋白結合分子，核酸結合分子，抗體，螯合劑，促進劑，抑制劑，抗原 決定基，抗原，催化劑，等等。可選地，干性試劑可存在于分析裝置中并被樣本、另一試劑或 稀釋液體溶解。根據本發明，試劑與樣本異質地混合，測定為異質測定。異質測定的示例為異質免 疫測定，其中，一些反應物(例如捕獲抗體)在固體支撐物上固定不動。根據本發明，固體 支撐物包括磁響應顆粒。磁響應(S卩，可磁吸引或可磁排斥)顆粒可實現為磁珠或由磁材料制成的微球，其 設置有固定不動的反應物，例如分子結合元素(如抗體)，適于專門結合到樣本中包含的至 少一種分析物。在下文中，給出一些其它應用示例，其僅用于例示目的異質催化，其中磁響應顆粒形成或包含催化表面；通過磁響應珠、片或顆粒捕獲和提純核酸；利用磁響應顆粒捕獲其它生物材料，例如細胞或病毒；化學固相提取。根據本發明的微流體系統包括至少一個可旋轉支撐裝置，其例如可具有盤狀形狀 并可利用諸如電動馬達之類的致動器驅動而圍繞旋轉軸線旋轉。根據本發明的微流體系統包括至少一個微流體裝置，其例如可具有盤狀形狀并被 固定到可旋轉支撐裝置以隨其旋轉。微流體裝置設置有至少一個或多個微流體結構，微流 體結構例如可相對于彼此而沿周向布置。在一個實施例中，微流體裝置被可拆卸地固定到可旋轉支撐裝置，使得微流體裝 置可安裝到支撐裝置而隨其同步旋轉，以自動分析樣本；并且另外，微流體裝置可在樣本分 析之后易于拆下。特別地，微流體裝置可實現為一次性裝置而僅使用一次。每個微流體結構包括至少一個入口區，用于將所述樣本和/或磁響應顆粒和/或 試劑和/或諸如洗滌緩沖劑之類的其它流體供應到與入口區流體連接的至少一個反應室。 反應室包括適于保持磁響應顆粒的至少一個保持區。保持區可實現為在幾何上被限定為室 狀或通道狀的腔，或者實現為在至少一個反應室中包括的空余區，所述保持區被設計為至 少部分地和至少臨時地保持磁響應顆粒。反應室可例如用于實現將可包含在樣本中的分析物結合到設置有分子結合元素 (其適于選擇性地結合到分析物)的磁響應顆粒。反應室可例如用于以諸如熒光標志之類 的可檢測示蹤劑來示蹤顆粒結合分析物。反應室可例如用于洗掉未結合分子可檢測示蹤 劑。反應室可例如用于接納具有示蹤的結合的分析物的顆粒，以進行檢測。特別地，反應室 的至少一個保持區可用于檢測示蹤的顆粒結合分析物。在一個實施例中，微流體結構包括用于接納廢料流體的至少一個廢料區，其流體 連接到至少一個保持區。廢料區可包括廢料儲器，廢料儲器例如利用虹吸管類通道而流體
5連接到至少一個反應室。上述微流體結構能夠使樣本利用微流體裝置旋轉所致的離心力從入口區被傳送 到至少一個反應室并最終被至少部分地傳送到廢料區。入口區可包括流體連接到至少一個 反應室的入口端口和/或入口室。根據本發明的系統進一步包括至少一個磁體，所述磁體對應于反應室的至少一個 保持區而固定到可旋轉支撐裝置而隨其同步旋轉，用于產生適于磁操控反應室中包含的磁 響應顆粒的磁場，特別是適于將磁響應顆粒保持在保持區中。至少一個磁體可在旋轉固定 到支撐裝置的另一微流體裝置中重新使用以操控磁響應顆粒，這樣有利地允許節省微流體 裝置的生產成本。而且，微流體裝置的質量(慣量)可減小。至少一個磁體可例如實現為 永磁體或電磁體，電磁體可包括極靴磁體、可切換磁體或螺旋管磁體。根據本發明的實施例，至少一個磁體的磁場可用于混合和/或洗滌和/或保持磁 響應顆粒以進行檢測。根據本發明的微流體系統的另一實施例，微流體裝置設置有至少一個凹部，適于 容納至少一個磁體，以減小保持區與磁體之間的距離。通過這種措施，用于操控在反應室中 所包含的磁響應顆粒的磁力(例如拉力)可被有利地增大，而不需要增大磁體的磁強度。此 實施例的進一步的優點是，聚集效應增大，從而形成均勻、均質且可能更小的磁響應顆粒部 位，這可有利于檢測目的。根據本發明的微流體系統的另一實施例，微流體結構包括第一保持區和可位于相 同或另一反應室內的第二保持區。第一保持區可位于第一反應室中，第二保持區可位于第 二反應室中。可替代地，第一和第二保持區可位于一個單一反應室中。第二保持區與第一保 持區流體連通，并適于保持磁響應顆粒。在此實施例中，微流體系統包括至少一個第一磁 體，其對應于第一保持區，用于產生適于將磁響應顆粒保持在第一保持區的磁場；和至少一 個第二磁體，其對應于第二保持區，用于產生適于將磁響應顆粒保持在第二保持區的磁場。 至少一個第二磁體被固定到可旋轉平臺而使其隨之(同步)旋轉。第一和第二磁體可例如 為永磁體或電磁體，電磁體可包括極靴磁體、可切換磁體或螺旋管磁體。根據本發明的微流體系統的另一實施例，微流體結構包括第一保持區，和與第一 保持區流體連通的第二保持區。所述系統進一步包括至少一個第一磁體，其對應于所述至 少一個第一保持區而固定到支撐裝置以隨之旋轉，用于產生適于將磁響應顆粒保持在第一 保持區中的磁場。所述系統還進一步包括至少一個第二磁體，其對應于所述至少一個第二 保持區而固定到所述支撐裝置以隨之旋轉，用于產生適于將磁響應顆粒保持在第二保持區 中的磁場。所述系統還進一步包括至少一個第三磁體，其與支撐裝置分離而使得支撐裝置 能夠相對于至少一個第三磁體旋轉。在一個實施例中，至少一個第三磁體布置為對應于第 二保持區，用于產生適于將磁響應顆粒保持在第二保持區中的磁場。至少一個第三磁體可 例如為永磁體或電磁體，電磁體可包括極靴磁體、可切換磁體或螺旋管磁體。根據本發明的微流體系統的另一實施例，可進一步優選的是，微流體裝置設置有 適于容納第一磁體的至少一個第一凹部和適于容納第二磁體的至少一個第二凹部，以分別 減小第一磁體與第一保持區之間的距離和第二磁體與第二保持區之間的距離。通過這種措 施，用于操控在第一和第二保持區中所保持的磁響應顆粒的磁力(例如拉力)可被有利地 增大，而不需要增大第一和第二磁體的磁強度。此實施例的進一步的優點是，聚集效應增大，從而形成均勻、均質且可能更小的磁響應顆粒部位，這可有利于檢測目的。根據本發明的磁流體系統的另一實施例，系統進一步包括至少一個磁通量集中 機構，適于集中一個以上磁體的磁通量以增大與第一和/或第二保持區中的磁響應顆粒的 磁相互作用，其中所述的一個以上磁體從包括所述至少一個第一磁體、至少一個第二磁體 和至少一個第三磁體的組中選出。特別地，至少一個第二磁體可設置有磁通量集中機構，例 如極靴，適于集中磁通量，使得施加于第二保持區的磁場可以被增大。此實施例的進一步優 點是，聚集效應增大，從而形成均勻、均質且可能更小的磁響應顆粒部位，這可有利于檢測 目的。根據本發明的磁流體系統的另一實施例，至少一個第二保持區設置有至少一個引 導面，適于當通過至少一個第二和/或第三磁體而磁操控所述顆粒時將磁響應顆粒局部聚 集(即，集中)在第二保持區內。通過這種措施，用于檢測顆粒結合分析物的檢測信號強度 可有利地被增大。適于將磁響應顆粒保持在第一保持區中的所述至少一個第一(同步旋轉)磁體的 磁場可用于移動反應室中的顆粒，例如通過離心力和磁力的組合進行移動，以在測定或反 應過程中實現更有效的混合和/或洗滌。同樣地，適于將磁響應顆粒保持在第二保持區中 的所述至少一個第二(同步旋轉)磁體的磁場可用于移動反應室中的磁響應顆粒，例如通 過離心力和磁力的組合進行移動，以在測定或反應過程中實現更有效的混合和/或洗滌。特別地，所述至少一個第一磁體的磁場可用于混合和/或洗滌目的，而所述至少 一個第二磁體的磁場可用于保持磁響應顆粒以進行檢測。本發明的微流體系統可進一步包括設置有至少一個移液尖端的移液單元，適于 將流體相對于微流體結構而傳送。微流體系統可更進一步包括檢測單元，適于檢測保持區中包含的顆粒結合分析 物。檢測單元可例如實現為熒光檢測器，其包括光源，用于產生朝向微流體結構的保持區 發射的光；和熒光傳感器，用于感應從熒光標志發射的熒光，其中熒光標志被制成以結合到 磁響應顆粒結合分析物。為了充分地檢測顆粒結合分析物，顆粒結合分析物被結合到可檢測示蹤劑，例如， 能夠實現顆粒結合分析物的選擇性檢測的染料、熒光或輻射性標志。微流體系統可更進一步包括控制器，用于根據預定的處理操作計劃控制對樣本 的自動分析，控制器例如可實現為運行計算機可讀程序的可編程邏輯控制器，所述程序設 置有用于根據過程操作計劃執行操作的指令。在現有技術中已知的包括用于發射光的光源和諸如半導體光檢測器之類的光傳 感器的光學檢測單元，其適合作為微流體系統中的光學檢測單元。光學檢測單元除了包括 用于產生光束的光源以外，還可包括適合的透鏡和孔，以照射第一和/或第二保持區。在此 使用的術語“光”意在包括可用于光學構造的波長范圍，即除了包括可見光范圍以外還包括 紫外光和紅外光。根據本發明的第二方案，提供一種新的用于自動分析樣本的方法，所述樣本包含 至少一種分析物，其中，涉及使用適于專門與分析物相互作用的磁響應顆粒。所述方法包括以下步驟提供微流體系統，微流體系統包括可旋轉支撐裝置和至少一個微流體裝置，微流
7體裝置固定到支撐裝置以隨支撐裝置同步旋轉，其中微流體裝置具有至少一個微流體結 構，微流體結構包括至少一個反應室，反應室包括適于保持磁響應顆粒的至少一個保持 區；將樣本中的一個引入反應室中；將磁響應顆粒引入所述反應室中；將適于磁操控磁響應顆粒的磁場施加于保持區。所述方法可進一步包括以下步驟將其它試劑(其例如包含分子可檢測示蹤劑或 洗滌緩沖劑)引入至少一個反應室中。所述方法可進一步包括以下步驟檢測在至少一個保持區中被保持的顆粒結合分 析物。優選地，至少當執行對顆粒的檢測時，通過磁場將磁響應顆粒聚集在反應室的保持區 中。本發明的方法可例如包括一個或多個以下步驟通過以下方式將磁響應顆粒提供到微流體結構的至少一個反應室中將顆粒供應 到與反應室流體連接的入口區，并且旋轉微流體裝置以由此形成足以將顆粒從入口區傳送 到反應室中的離心力；通過以下方式將樣本提供到反應室中將樣本供應到相同或不同的入口區，并且 旋轉微流體裝置以由此形成足以將樣本傳送到反應室中的離心力，從而能夠在可包含于樣 本中的分析物與顆粒的分析物結合元素之間實現反應；通過可檢測標志(例如，染料或熒光或輻射性標志)示蹤顆粒結合分析物；通過洗滌從顆粒結合分析物中移除未結合示蹤劑分子；將磁場施加于至少一個保持區，例如，通過固定到支撐裝置的至少一個磁體施 加；移動在至少一個反應室中包含的顆粒結合分析物，例如通過離心力和磁力的組合 進行移動，以在測定或反應過程中實現更有效的混合和/或洗滌；特別地，通過旋轉微流體 裝置使得所形成的離心力足以超過磁場的磁力，或者通過旋轉微流體裝置使得所形成的離 心力被磁場的磁力超過，而沿徑向往復移動磁響應顆粒；檢測在保持區中保持的顆粒結合分析物。本發明的方法可替代地可包括一個或多個以下步驟通過以下方式將磁響應顆粒提供到微流體結構的至少一個反應室中將顆粒供應 到與反應室流體連接的入口區，并且旋轉微流體裝置以由此形成足以將顆粒從入口區傳送 到反應室中的離心力；通過以下方式將樣本提供到反應室中將樣本供應到相同或不同的入口區，并且 旋轉微流體裝置以由此形成足以將樣本傳送到反應室中的離心力，從而在可包含于樣本中 的分析物與顆粒的分析物結合元素之間能夠實現反應；通過可檢測標志(例如，染料或熒光或輻射性標志)示蹤顆粒結合分析物；通過洗滌從顆粒結合分析物中移除未結合示蹤劑分子；將第一磁場對應于第一保持區施加于反應室，例如，通過固定到支撐裝置的第一 磁體施加；移動在反應室中包含的顆粒結合分析物，例如通過離心力和磁力的組合進行移動，以在測定或反應過程中實現更有效的混合和/或洗滌；將顆粒結合分析物傳送到至少一個反應室的第二保持區；將第二磁場對應于第二保持區施加于至少一個反應室，例如，通過固定到支撐裝 置的第二磁體施加；檢測在至少一個第二保持區中保持的顆粒結合分析物。所述方法可更進一步包括以下步驟將保持在至少一個第一保持區(其作為第一 反應室的一部分)中的顆粒結合分析物傳送到至少一個第二保持區(其作為第二反應室的 一部分)中。根據本發明的方法的實施例，其包括以下步驟施加相對于微流體系統保持靜止 的磁場，所述磁場適于聚集至少一個保持區中包含的磁響應顆粒。在這種情況下，所述方法 優選地包括以下步驟執行可旋轉微流體裝置相對于磁場的往復旋轉運動，以將磁響應顆 粒局部聚集在保持區中，然后檢測結合到聚集顆粒的分析物。在這種情況下，優選地，微流 體裝置的往復旋轉運動的幅度可從最大幅度減小至最小幅度，最小幅度特別地為零，由此 有利地將顆粒集中在中心位置附近。根據本發明的方法另一實施例，包括另一步驟通過執行旋轉運動而沿徑向往復 移動磁響應顆粒，在所述旋轉運動中，微流體裝置旋轉而使得所形成的離心力足以超過作 用在顆粒上的磁力，或者旋轉而使得所形成的離心力被磁力超過。
通過以下描述，本發明的其它和進一步的目的、特征和優點將更全面地顯示。各附 圖并入申請文件中而構成申請文件的一部分，并例示出本發明的優選實施例，且與以上給 出的概要描述以及以下給出的詳細描述一起用于闡釋本發明的原理。圖1是根據本發明的用于自動分析樣本的微流體系統的示例性實施例的示意性 截面圖；圖2是圖1的微流體系統的示意性立體圖；圖3是圖1的微流體系統的示意性截面圖，其中例示出所述系統的細節；圖4是例示出圖1的微流體系統的變例的示意性截面圖；圖5是例示出用于操作圖1的微流體系統的方法的流程圖；圖6是如圖7中所示的本發明的微流體系統的另一示例性實施例的示例性微流體 結構的示意性俯視圖；圖7是本發明的用于自動分析樣本的微流體系統的另一示例性實施例的示意性 截面圖；圖8是例示出用于操作圖7的微流體系統的方法的流程圖；圖9是圖7的本發明的微流體系統的示例性實施例的變例的示意性截面圖；圖10是圖7的本發明的微流體系統的示例性實施例的另一變例的示意性俯視圖。
具體實施例方式本發明將在下文中參照附圖詳細描述。具體參見圖1至5，闡釋用于自動分析樣 本(例如體液)的基于離心力的微流體系統101的示例性實施例。微流體系統101包括盤形微流體裝置(以下稱為“基片102”)，其由盤形可旋轉支撐裝置(以下稱為“平臺103”) 支撐。平臺103相對于基片102而同心布置并且聯結到電動馬達105的可旋轉地被動軸 104，使得基片102和平臺103圍繞共同旋轉軸線106而旋轉。基片102利用固定元件(未 示出)被可拆卸地固定到平臺103，從而使基片102與平臺103同步旋轉。否則，基片102 可以容易地從平臺103拆下，并例如可被實施為在使用后將被棄置的一次性構件。雖然基 片102和平臺103均被顯示為具有盤狀形狀，不過，根據自動分析樣本的具體需要，基片102 和/或平臺103可具有所希望的任何其它形狀。如圖2中所示，基片102設置有多個微流體結構114，適于接納沿周向布置并相對 于彼此等距的樣本。更具體而言，基片102設置有多個扇形體狀的腔111以容納微流體結 構114。腔111可沿周向規則地布置，例如覆蓋整個基片102。雖然顯示出七個微流體結構 114，其僅用于例示目的，根據自動分析樣本的具體需要，基片102可設置有任意所希望數 量的微流體結構114。每個微流體結構114包括第一入口區(以下稱為“樣本入口區115”)，其包括入 口端口和流體儲器(未進一步詳述)。樣本入口區115與反應室119利用微毛細流體導管 (以下稱為“樣本導管116”)而流體連通。樣本入口區115例如可用于將流體樣本和/或 磁響應顆粒和/或其它試劑供應到微流體結構114。每個微流體結構114包括第二入口區 (以下稱為“顆粒入口區117”)，其包括入口端口和流體儲器(未進一步詳述)。顆粒入口 區117與反應室119利用另一微毛細流體導管(以下稱為“顆粒導管118”)而流體連通。 顆粒入口區117例如可用于將流體樣本和/或磁響應顆粒和/或其它試劑供應到微流體結 構 114。在每個微流體結構114中，反應室119與廢料區121 (例如其形成為室)利用例如 具有虹吸管類結構的另一微毛細流體導管(以下稱為“廢料導管122)流體連通。在微流體 結構114中，如果反應室119中超過特定流體量，則流體可利用由平臺103旋轉所致的離心 力而被從樣本入口區115傳送到廢料區121。廢料區121例如適于接納過量的流體，例如用 于洗去未結合分子(可檢測)示蹤劑的洗滌緩沖劑，而示蹤的磁響應顆粒結合分析物保持 在反應室119中用于檢測。在微流體系統101中，平臺103設置有多個平臺固定磁體123，磁體123以一定方 式布置而使其對應于保持區120而位于反應室119下方，用于保持反應室119內的磁響應 顆粒。磁體123作為平臺103的集成部分而與平臺103同步旋轉。微流體系統101進一步包括移液單元112，其設置有至少一個移液尖端113，例如 金屬針或一次性尖端，適于將流體從流體儲器107傳送到微流體結構114。儲器107(僅示 出其中一個)包含各種流體，例如樣本、磁響應顆粒懸置液、試劑、洗滌溶劑、和類似物。儲 器107位于底板110上。移液單元112被可操作地聯結到自動定位裝置(未示出)以相對 于儲器107和基片102傳送移液尖端113。由于這樣的移液單元112和定位裝置對于本領 域技術人員而言是公知的，因而在此不需要對其進行更多說明。微流體系統101進一步包括檢測單元108，適于檢測反應室119中包含的示蹤的 分析物。檢測單元108可例如實現為熒光檢測器，其包括光源，用于產生朝向微流體結構 114的保持區120發射的光109 ；和熒光傳感器，用于感應從熒光標志發射的熒光，其中熒光 標志被制成以結合到反應室119中所包含的顆粒結合分析物。由于諸如熒光檢測器之類的檢測單元對于本領域技術人員而言是公知的，因而在此不需要對檢測單元108進行更多說 明。微流體系統101更進一步包括控制器(未示出)，控制器例如可實現為運行計算機 可讀程序的可編程邏輯控制器，所述程序中設置有用于執行自動分析樣本操作的指令。控 制器從系統101的不同部件接收信息并產生和發送對應的用于控制部件的控制信號。為了 執行此任務，控制器電連接到需要控制和/或提供信息的系統部件，包括馬達105，移液單 元112和檢測單元108。如圖1中所示，平臺103可設置有多個開口 125，以減小其質量(慣量)和/或從 下方提供至基片102的通路，例如用于檢測被結合到反應室119的保持區120中保持的磁 響應顆粒126的分析物的目的。而且，如圖3和4中所示，基片102被上蓋箔127覆蓋，以 密封微流體結構114。出于光學原因，此蓋箔127有利地為透明的。類似地，基片102的至 少一部分可為透明的。具體參見圖4，圖4例示出圖1所示微流體系統101的詳細部分的截面圖，其中闡 釋其變例。因此，基片102設置有凹部124，凹部124用于容納朝向基片102突出的磁體 123，從而減小磁體123與反應室119的保持區120之間的距離。具體參見例示出流程圖的圖5，其中闡釋使用微流體系統101自動分析樣本的方 法的示例性實施例。步驟I:處理開始。步驟II 將磁響應顆粒126提供到反應室119中。更具體而言，使用移液尖端113 將磁響應顆粒懸置液從包含懸置液的流體儲器107之一傳送到每個顆粒入口區117，然后 以預定旋轉速度旋轉平臺103以利用離心力將預定量的懸置液從顆粒入口區117通過顆粒 導管118而傳送到反應室119。在一個實施例中，磁響應顆粒126承載被附接到其外表面的 固定不動的分子結合元素，分子結合元素可專門結合到分析物，將測試在樣本中的此分析 物的存在與否和可選地測試此分析物的濃度。在另一實施例中，分析物可附到磁響應顆粒 的外表面。磁體123當被傳送到反應室119時磁吸引在反應室119內的保持區120處的磁 響應顆粒126。步驟III 將包含分析物的樣本提供到反應室119中，分析物可專門與顆粒126相 互作用并例如可結合到顆粒126。更具體而言，使用移液尖端113將樣本從包含樣本的另一 儲器107傳送到每個樣本入口區115，然后以預定旋轉速度旋轉平臺103以利用離心力將樣 本從樣本入口區115傳送到反應室119。在反應室119中的有效混合使其中包含的分析物 能夠專門結合到磁響應顆粒126的分子結合元素，這可例如通過磁相互作用和作用在顆粒 126上的離心力的組合而實現。特別地，保持在保持區120中的磁響應顆粒126可通過執行 旋轉運動而沿徑向往復運動，在所述旋轉運動中，基片102可旋轉以形成足以超過磁體123 磁力的離心力或者可旋轉以形成被磁體123磁力超過的離心力。步驟IV 示蹤被保持在反應室119中的顆粒結合分析物。更具體而言，通過使用移 液尖端113將適于專門結合到分析物(在此情況下結合到顆粒結合分析物)的包含可檢測 分子示蹤劑(例如熒光標志)的流體從包含示蹤劑的另一儲器107傳送到樣本入口區115 和/或顆粒入口區117或另一入口區(未示出)中的每一個中，然后以預定旋轉速度旋轉 平臺103以利用離心力將流體從樣本入口區115傳送通過反應室119而朝向廢料區121傳
11送。將包含示蹤劑的流體供應到反應室119并例如重復前述在步驟III中的混合處理，使 得其中包含的示蹤劑能夠專門和有效地結合到顆粒結合分析物。步驟V 移除未結合示蹤劑。更具體而言，使用移液尖端113將洗滌流體從包含洗 滌流體的另一儲器107傳送到每個樣本入口區115，然后以預定旋轉速度旋轉平臺103以 利用離心力將洗滌流體從樣本入口區115傳送到反應室119中，從而使包圍被保持磁響應 顆粒126的流體能夠被沖離至廢料區121中并被洗滌流體所替代，由此移除未結合示蹤劑。 這樣的洗滌步驟可根據需要而重復多次。步驟VI 確定樣本中的分析物存在與否和可選地確定分析物濃度。更具體而言， 利用檢測單120測量示蹤劑強度，例如反應室119的保持區120中保持的示蹤的顆粒結合 分析物的熒光強度，并基于所獲得的結果確定樣本中所含分析物存在與否和可選地確定分 析物濃度。步驟VII:處理停止。在上述方法中，在每個微流體結構114中，不同數量的樣本入口區115和/或顆粒 入口區117，例如僅一個單一樣本入口區115和/或僅一個單一顆粒入口區117，可用于所 有液體添加物。而且，不同的流體在其同時被傳送到反應室119之前可被引入到相同的或 更多個樣本入口區115和/或顆粒入口區117中。具體參見圖6至8，其中闡釋用于自動分析樣本的基于離心力的微流體系統201的 另一示例性實施例。類似于圖1的微流體系統101，微流體系統201包括盤形基片202，其由盤形可旋 轉平臺203支撐并被可拆卸地固定到平臺203，基片202和平臺203相對于彼此而同心布置 并被聯結到電動馬達205的可旋轉地被動軸204，從而圍繞共同旋轉軸線206而旋轉。基片 202設置有多個微流體結構214。每個微流體結構214包括樣本入口區215，樣本入口區215與第一反應室219利用 微毛細流體導管(以下稱為“樣本導管216”)而流體連通。樣本入口區215例如可用于將 流體樣本和/或磁響應顆粒和/或其它試劑供應到微流體結構214。第一反應室219包括 第一保持區220，其可例如用于將承載分子結合元素的磁響應顆粒與包含至少一種分析物 (其結合到分子結合元素)的樣本混合，以及示蹤和洗滌示蹤的顆粒結合分析物。每個微流體結構214進一步包括顆粒入口區217，顆粒入口區217與第一反應室 219利用微毛細流體導管(以下稱為“顆粒導管218”)而流體連通。顆粒入口區217例如 可用于將流體樣本和/或磁響應顆粒和/或其它試劑供應到微流體結構214。每個微流體結構214更進一步包括第二反應室223，第二反應室223與第一反應室 219利用微毛細流體導管(以下稱為“室間導管225”)而流體連通。另外，第二反應室223 與廢料區221利用具有虹吸管類結構的廢料導管222而流體連通。第二反應室223包括第 二保持區224，其可例如用于檢測已經從第一反應室219被傳送到第二反應室223中的示蹤 的顆粒結合分析物。微流體系統201進一步包括移液單元212，其設置有至少一個移液尖端213，適于 將流體從流體儲器207傳送到微流體結構214。儲器207被設置于底板210上。移液單元 212被可操作地聯結到自動定位裝置(未示出)以相對于儲器207和基片202而傳送移液 尖端213。微流體系統201進一步包括檢測單元208，適于檢測第二反應室223的第二保持區224中所包含的示蹤的顆粒結合分析物。檢測單元208可例如實現為熒光檢測器，其包 括光源，用于產生朝向第二保持區224發射的光209 ；和熒光傳感器，用于傳感從熒光標志 發射的熒光，其中熒光標志被制成以結合到第一反應室219中所保持的顆粒結合分析物。微流體系統201更進一步包括控制器，控制器從系統201的不同部件接收信息并 產生和發送對應的用于控制部件的控制信號。具體參見圖7，在微流體系統201中，平臺203設置有多個第一磁體226，第一磁體 226以一定方式沿周向布置而使得第一磁體226對應于第一保持區220而位于第一反應 室219之下，用于將磁響應顆粒保持在第一反應室219內。平臺203進一步設置有多個第 二磁體227，第二磁體227以一定方式沿周向布置而使得第二磁體227對應于第二保持區 224而位于第二反應室223之下，用于將磁響應顆粒保持在第二反應室223內。第二磁體 227相對于第一磁體226布置在沿徑向向外的位置。第一和第二磁體226、227可例如被實現為永磁體或電磁體。第一磁體226適于產 生具有足夠磁強度(例如拉力)的磁場以吸引第一反應室219中包含的磁響應顆粒，從而 至少部分地和至少臨時地將這些磁響應顆粒聚集在第一保持區220處。第二磁體227適于 產生具有足夠磁強度(例如拉力)的磁場以吸引第二反應室223中包含的磁響應顆粒，從 而至少部分地和至少臨時地將這些顆粒聚集在第二保持區224處。由于第一和第二磁體226、227均與基片202同步旋轉，因而在基片202的旋轉過 程中也將恒定磁場施加于第一和第二反應室219、223中的磁響應顆粒上。具體參見例示流程圖的圖8，其中闡釋使用本發明第二實施例的微流體系統201 自動分析樣本的示例性方法。步驟I:處理開始。步驟II 將磁響應顆粒提供到第一反應室219中。更具體而言，使用移液尖端213 將磁響應顆粒懸置液從包含懸置液的流體儲器207之一傳送到每個顆粒入口區217，然后 以預定旋轉速度旋轉平臺203以利用離心力將預定量的懸置液從顆粒入口區217通過顆粒 導管218而傳送到第一反應室219。在一個實施例中，磁響應顆粒承載被附接到其外表面的 固定不動的分子結合元素，分子結合元素可專門結合到分析物，將測試在樣本中的此分析 物的存在與否和可選地測試此分析物的濃度。在另一實施例中，分析物可附到磁響應顆粒 的外表面。磁體226當被傳送到第一反應室219時磁吸引第一反應室219中的保持區220 處的磁響應顆粒。步驟III 將包含分析物的樣本提供到第一反應室219中，分析物可專門與所述顆 粒相互作用并例如可結合到所述顆粒。更具體而言，使用移液尖端213將樣本從包含樣本 的另一儲器207傳送到每個樣本入口區215，然后以預定旋轉速度旋轉平臺203以利用離心 力將樣本從樣本入口區215傳送到第一反應室219。在第一反應室219中的有效混合使其 中包含的分析物能夠專門結合到磁響應顆粒126的分子結合元素，這可例如通過前文中結 合圖5的步驟III所述的方式實現。步驟IV 示蹤被保持在第一反應室219中的顆粒結合分析物。更具體而言，通過 使用移液尖端213將適于專門結合到分析物(在這種情況下結合到顆粒結合分析物)的包 含可檢測分子示蹤劑(例如熒光標志)的流體從包含示蹤劑的另一儲器207傳送到樣本入 口區215和/或顆粒入口區217或另一入口區(未示出)中的每一個中，然后以預定旋轉速度旋轉平臺203以利用離心力將流體從樣本入口區215傳送通過第一反應室219和第二 反應室223而朝向廢料區221傳送。將包含流體的示蹤劑供應到第一反應室219并例如重 復前述在步驟III中的混合處理，使得其中包含的示蹤劑能夠專門和有效地結合到顆粒結 合分析物。步驟V 移除未結合的示蹤劑。更具體而言，使用移液尖端213將洗滌流體從包含 洗滌流體的另一儲器207傳送到每個樣本入口區215，然后以預定旋轉速度旋轉平臺203以 利用離心力將洗滌流體從樣本入口區215傳送到第一反應室中，從而使包圍在第一保持區 220中所保持的磁響應顆粒的流體能夠被沖離至廢料區中并被洗滌流體所替代，由此移除 未結合的示蹤劑。這樣的洗滌步驟可根據需要而重復多次。步驟VI 將磁響應顆粒結合分析物從第一反應室219傳送到第二反應室223并且 在第二反應室223中聚集顆粒結合分析物。更具體而言，平臺203以比將顆粒從顆粒入口 區217傳送到第一反應室219時使用的旋轉速度更高的旋轉速度旋轉，以將顆粒從第一反 應室219中釋放并將其沖入到第二反應室223中。在第二反應室223中，顆粒結合分析物 然后被第二磁體227聚集在第二保持區224中。步驟VII 確定樣本中的分析物存在與否和可選地確定分析物濃度。更具體而言， 利用檢測單元208測量示蹤劑強度，例如第二反應室223的第二保持區224中保持的示蹤 的顆粒結合分析物的熒光強度，并基于所獲得的結果確定樣本中所含分析物存在與否和可 選地確定分析物濃度。步驟VIII:處理停止。具體參見圖9，其中闡釋圖7的基于離心力的微流體系統201的變例。為了避免不 必要的重復，僅闡釋相對于圖7的微流體系統201的差別，其它情況可參照結合圖6至8給 出的描述。因此，在微流體系統201中，一個或多個第三磁體230對應于第二反應室223的第 二保持區224由載架211支撐而設置在底板210上，用于將磁響應顆粒保持在第二反應室 223內。在圖9中，僅顯示出一個單一第三磁體230，這僅用于例示目的。類似地，以下闡釋 適用于多個第三磁體230的情況。定位于底板的第三磁體230相對于固定到平臺203的第 一磁體226布置在沿徑向向外的位置。第三磁體230適于產生具有足夠磁強度(例如拉 力)的磁場以吸引第二反應室223中包含的磁響應顆粒，從而至少部分地和至少臨時地將 這些磁響應顆粒聚集在第二保持區224處。相應地，在此變例中，與轉動基片202同步旋轉的第一磁體226在基片202的旋轉 過程中也可施加作用于第一反應室219中磁響應顆粒上的恒定磁場。另一方面，由于第三 磁體230不與基片202同步旋轉，因而施加于在第二反應室223的第二保持區224中所保 持的磁響應顆粒上的磁場在基片202的旋轉過程中不是恒定的。更具體而言，第三磁體230 對磁響應顆粒的影響在基片202的旋轉速度減小時增加，反之亦然。第三磁體230可例如 具有以下功能在檢測之前聚集第二保持區224中保持的磁響應顆粒。使用圖9中的微流體系統201，在結合圖8闡釋的用于自動分析樣本的前述方法 中，在步驟VI中，在第二保持區224中聚集示蹤的顆粒結合分析物可通過以下方式實現相 對于固定于底板的第三磁體230的磁場而雙向旋轉平臺203以執行基片202的往復旋轉運 動，其中，往復旋轉運動的幅度從預定最大幅度減小至預定最小幅度，例如，零。這樣，基片202的往復旋轉運動被可操作地結合未旋轉的第三磁體230的磁場，以在各第三保持區224 處局部的聚集(即，集中)所述顆粒。雖然在圖9中未示出，不過，如圖7中所示第二磁體227 (如圖7中所示，固定到平 臺203)可與第三磁體230 —起存在。具體參見圖10，其中闡釋圖7的基于離心力的微流體系統201的另一變例。為了 避免不必要的重復，僅闡釋相對于圖7的微流體系統201的差別，其它情況可參照結合圖6 至8給出的描述。相應地，基片202設置有多個微流體結構214，圖10中部分地圖示出其中一個微流 體結構214。微流體結構214與圖6的微流體結構的不同之處在于，其僅包括一個單一反應 室219，反應室219通過如圖6中所示的微毛細流體導管而流體連接到樣本入口區(未示 出)和顆粒入口區(未示出)以及廢料區(未示出)。每個微流體結構214的反應室219包括第一保持區220和相對于第一保持區220 獨立布置的第二保持區224。第一保持區220可例如用于將承載分子結合元素的磁響應顆 粒228與包含至少一種分析物(其結合到分子結合元素)的樣本混合，以及示蹤和洗滌示 蹤的顆粒結合分析物。第二保持區224可例如用于在示蹤的顆粒結合分析物從第一保持區 220被傳送到第二保持區224之后進行對其的檢測。在微流體系統201中，平臺203設置有多個第一磁體226，第一磁體226以一定方 式沿周向布置而使得第一磁體226對應于第一保持區220而位于第一反應室219之下，用 于將磁響應顆粒228保持在第一保持區220內。平臺203進一步設置有多個第二磁體227， 第二磁體227以一定方式沿周向布置而使得第二磁體227對應于第二保持區224而位于 反應室219之下，用于將磁響應顆粒228保持在第二保持區224內。第二磁體227相對于 第一磁體226布置在沿徑向向外的位置。第一磁體226適于產生具有足夠磁強度(例如拉 力)的磁場以吸引磁響應顆粒228，從而至少部分地和至少臨時地將這些磁響應顆粒聚集 在第一保持區220處。第二磁體227適于產生具有足夠磁強度(例如拉力)的磁場以吸引 磁響應顆粒228，從而至少部分地和至少臨時地將這些磁響應顆粒聚集在第二保持區224 處。由于第一和第二磁體226、227均與基片202同步旋轉，因而在基片202的旋轉過 程中也將恒定磁場施加于第一和第二保持區220、224中的磁響應顆粒上。另外，僅第一磁 體可隨基片同步旋轉。如圖10中所示，為使磁響應顆粒228與反應室219的第一保持區220中的包含分 析物的樣本混合，在執行旋轉運動中顆粒228可沿徑向往復移動，在旋轉運動中，平臺203 以一定方式交替旋轉，使得所形成的離心力足以超過第一磁體226的磁場的磁力，或者使 得所形成的離心力被第一磁體226的磁場的磁力超過。另外，通過調整平臺203的旋轉速度，顆粒228可保持在第二保持區224處，第二 保持區224設置有引導面229，引導面229與第二磁體227的磁力相結合可用于將顆粒228 局部地聚集在第二保持區224中。如圖所示，特別地，引導面229可在反應室219內形成較 小的隔間。根據如前所述的本發明，由于當平臺103、203的旋轉運動停止時顆粒結合分析物 因擴散和/或流動擾動和/或松弛效應而通常易于重新布置的事實，因而在執行檢測時將示蹤的顆粒結合分析物固定在保持區內有利地增強測量可靠性。根據如前所述的本發明，由于例如熒光標志的漫射光從包含示蹤的顆粒結合分析 物的保持區的內壁散射而由此降低測量的可靠性的事實和/或由于熒光標志也可并非專 門地結合到保持區內壁的事實，因此，對示蹤的顆粒結合分析物的磁捕集有利地允許所述 顆粒定位而與保持區內壁具有更大距離，并由此有利地增強測量可靠性。顯然，根據以上描述，本發明的許多進一步的修改和變化是可行的。因此，應理解， 在所附權利要求書的范圍內，本發明可通過不同于具體描述的方式實現。
0132]附圖標記列表0133]101系統0134]102基片0135]103平臺0136]104軸0137]105馬達0138]106旋轉軸線0139]107儲器0140]108檢測單元0141]109光0142]110底板0143]111腔0144]112移液單元0145]113移液尖端0146]114微流體結構0147]115樣本入口區0148]116樣本導管0149]117顆粒入口區0150]118顆粒導管0151]119反應室0152]120保持區0153]121廢料區0154]122廢料導管0155]123磁體0156]124凹部0157]125開口0158]126顆粒0159]127蓋箔0160]201系統0161]202基片0162]203平臺0163]204軸
205馬達
206旋轉軸線
207儲器
208檢測單元
209光
210底板
211載架
212移液單元
213移液尖端
214微流體結構
215樣本入口區
216樣本導管
217顆粒入口區
218顆粒導管
219第一反應室
220第一保持區
221廢料區
222廢料導管
223第二反應室
224第二保持區
225室間導管
226第一磁體
227第二磁體
228顆粒
229引導面
230第三磁體
權利要求
一種用于自動分析樣本的基于離心力的微流體系統(101；201)，所述樣本包含至少一種分析物，其中，涉及使用適于專門與所述分析物相互作用的磁響應顆粒(126；228)，所述系統包括至少一個可旋轉的支撐裝置(103；203)；至少一個微流體裝置(102；202)，其固定到所述支撐裝置以隨其旋轉并設置有至少一個微流體結構(114；214)，所述微流體結構(114；214)具有至少一個入口區(115，117；215，217)，和用于接納所述樣本中的一個樣本的與所述至少一個入口區流體連通的至少一個反應室(119；219，223)，至少一個反應室(119；219，223)包括適于保持所述磁響應顆粒(126；228)的至少一個保持區(120；220，224)；至少一個磁體(123；226)，其對應于所述至少一個保持區(120；220，224)而被固定到所述支撐裝置(103；203)以隨所述支撐裝置(103；203)旋轉，用于產生適于磁操控容納在所述至少一個反應室(119；219，223)中的所述磁響應顆粒的磁場。
2.根據權利要求1所述的系統(101；201)，其中，所述微流體裝置(102 ；202)設置有至 少一個凹部(124)，適于容納所述至少一個磁體(123)，以減小所述至少一個保持區(120) 與所述至少一個磁體(123)之間的距離。
3.根據前述權利要求1或2中任一項所述的系統(201)，其中，所述微流體結構(214) 包括第一保持區(220)和與所述第一保持區(220)流體連通的第二保持區(224)，其中，所 述系統進一步包括至少一個第一磁體(226)，所述第一磁體(226)對應于所述至少一個第 一保持區(220)而固定到所述支撐裝置(203)以隨所述支撐裝置(203)旋轉，用于產生適 于將所述磁響應顆粒(228)保持在所述第一保持區中的磁場；和至少一個第二磁體(227)， 所述第二磁體(227)對應于所述至少一個第二保持區(224)而固定到所述支撐裝置(203) 以隨所述支撐裝置(203)旋轉，用于產生適于將所述磁響應顆粒(228)保持在所述第二保 持區(224)中的磁場。
4.根據前述權利要求1或2中任一項所述的系統(201)，其中，所述微流體結構(214) 包括第一保持區(220)和與所述第一保持區(220)流體連通的第二保持區(224)，其中，所 述系統進一步包括至少一個第一磁體(226)，所述第一磁體(226)對應于所述至少一個第 一保持區(220)而固定到所述支撐裝置(203)以隨所述支撐裝置(203)旋轉，用于產生適 于將所述磁響應顆粒(228)保持在所述第一保持區中的磁場；至少一個第二磁體(227)，所 述第二磁體(227)對應于所述至少一個第二保持區(224)而固定到所述支撐裝置(203)以 隨所述支撐裝置(203)旋轉，用于產生適于將所述磁響應顆粒(228)保持在所述第二保持 區(224)中的磁場；和至少一個第三磁體(230)，其與所述支撐裝置(203)分離而使得所述 支撐裝置(203)能夠相對于所述至少一個第三磁體(230)旋轉。
5.根據前述權利要求3或4中任一項所述的系統(201)，其中，所述微流體裝置(214) 設置有至少一個第一凹部，適于容納所述至少一個第一磁體(226)，以減小所述至少一個第 一磁體(226)與所述至少一個第一保持區(220)之間的距離；并設置有至少一個第二凹部， 適于容納所述至少一個第二磁體(227)，以減小在所述至少一個第二磁體(227)與所述至 少一個第二保持區(224)之間的距離。
6.根據前述權利要求3至5中任一項所述的系統(201)，進一步包括至少一個磁通量 集中機構，適于集中一個所述磁體的磁通量以增大與所述磁響應顆粒(126;228)的磁相互作用。
7.根據前述權利要求3至6中任一項所述的系統(201)，其中，所述至少一個第二保持 區(224)設置有至少一個引導面(229)，適于將所述磁響應顆粒(228)聚集在所述至少一個 第二保持區(224)內。
8.根據前述權利要求3至7中任一項所述的系統(201)，其中，所述微流體裝置(214) 具有第一反應室(219)和第二反應室(223)，所述第一反應室(219)包括所述第一保持區 (220)，所述第二反應室(223)包括所述第二保持區(224)。
9.根據前述權利要求1至8中任一項所述的系統(101；201)，進一步包括至少一個廢 料區(121 ；221)，用于接納廢料流體并與所述至少一個反應室(119 ；219,223)流體連通。
10.根據前述權利要求1至9中任一項所述的系統(101；201)，其中，所述微流體裝置 (102 ；202)被可拆卸地固定到所述支撐裝置(103 ；203)。
11.一種用于自動分析樣本的方法，所述樣本包含至少一種分析物，其中，涉及使用適 于專門與所述分析物相互作用的磁響應顆粒(126 ；228)，所述方法包括以下步驟提供微流體系統(101，201)，微流體系統(101，201)包括可旋轉支撐裝置(103 ;203) 和至少一個微流體裝置(102 ；202)，所述微流體裝置(102 ；202)固定到所述支撐裝置以隨 所述支撐裝置旋轉，所述微流體裝置具有至少一個微流體結構(114 ；214)，所述微流體結 構(114 ；214)包括至少一個反應室(119 ;219，223)，所述反應室(119 ；219, 223)包括用于 保持所述磁響應顆粒的至少一個保持區(120;220，224)；將所述樣本中的一個引入所述反應室(119 ；219,223)中；將所述磁響應顆粒(126 ；228)引入所述反應室(119 ；219，223)中；將適于磁操控所述磁響應顆粒(126;228)的磁場施加于所述保持區(120 ;220，224)。
12.根據權利要求11所述的方法，進一步包括以下步驟施加相對于所述微流體系統 (201)保持靜止的磁場，所述磁場適于聚集容納在所述至少一個反應室(223)中的所述磁 響應顆粒(228)。
13.根據權利要求12所述的方法，包括以下步驟執行所述微流體裝置(202)相對于 所述磁場的往復旋轉運動，以將所述磁響應顆粒(228)局部聚集到所述至少一個保持區 (224)中，然后檢測與所述聚集的顆粒(228)相互作用的分析物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述往復旋轉運動的幅度從最大幅度減小至 最小幅度，所述最小幅度特別地為零。
15.根據前述權利要求11至14中任一項所述的方法，進一步包括以下步驟通過執行 旋轉運動而沿徑向往復移動所述磁響應顆粒(126 ；228)，在所述旋轉運動中，所述微流體 裝置(102 ；202)旋轉而使得所形成的離心力足以超過作用在所述顆粒(126 ；228)上的磁 力，或者旋轉而使得所形成的離心力被所述磁力超過。
全文摘要
本發明涉及用于自動分析樣本的基于離心力的微流體系統和方法。該系統中，涉及使用磁響應顆粒，系統包括可旋轉的支撐裝置；至少一個微流體裝置，其固定到所述支撐裝置以隨其旋轉并設置有至少一個微流體結構，所述微流體結構具有至少一個入口區，至少一個反應室，與所述入口區流體連通并包括適于保持所述磁響應顆粒的至少一個保持區；至少一個磁體，其對應于所述至少一個保持區而固定到所述支撐裝置以隨所述支撐裝置旋轉，用于產生適于磁操控在所述至少一個反應室中包含的所述磁響應顆粒的磁場。本發明進一步涉及一種用于自動分析流體的方法。
文檔編號G01N35/00GK101893640SQ20101017949
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月17日 優先權日2009年5月18日
發明者B·尼德伯格, E·烏斯特布羅克, M·庫爾西奧, S·科納 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司