專利名稱：：基于熒光共振能量轉移的多組分同時檢測的均相免疫分析方法
技術領域：
：本發明屬于熒光免疫分析
技術領域：
。
背景技術：
：免疫分析法是一種微量生物分析方法，它利用抗原抗體間的高親和性以及作為探針的標記物的高度可測性，能夠對生物體內微量物質進行準確的定量分析，具有操作簡單、特異性好、靈敏度高等優點，已成為生物學、醫學、化學等學科領域研究的重要手段。免疫分析法根據其標記物的不同可分為放射免疫分析法(RIA)、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、熒光免疫分析法(FIA)和化學發光免疫分析法(CLIA)等。RIA靈敏度高但存在放射性污染，已逐漸退出市場。ELISA是目前國內外應用最為廣泛的免疫分析方法，但靈敏度較低，一般僅用于定性或半定量分析。CLIA是上個世紀90年代發展起來的一種新的免疫分析方法，但成本較高，且靈敏度并未達到RIA的水平，目前并未廣泛應用。常規熒光免疫分析法(FIA)因無放射性、無酶試劑的不穩定性及效期限制，在超微量免疫分析領域引起人們更大的關注。在FIA領域中，最重要的改進之一是發展了時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)，具有靈敏度高、線性范圍寬等優點。免疫分析根據其反應系統的物理狀態的不同可以分為均相免疫分析和非均相免疫分析。在現有的免疫分析方法中，非均相免疫分析法以RIA、ELISA和CLIA應用最為廣泛，但非均相免疫分析需要進行抗原抗體復合物與游離抗原抗體的分離步驟，從而提高信噪比和分析的靈敏度，所以操作相對繁瑣。分離抗原抗體復合物與游離抗原抗體是關鍵，也最容易產生誤差。而且由于非均相免疫分析包括了包被(抗原或抗體)、封閉、多次溫育、洗滌以及檢測等過程，一般需要2小時以上。均相免疫分析因其具有不需要分離抗原抗體復合物與游離抗原抗體即可直接以及均相反應比固相、半固相反應更為簡便迅速等特點，成為目前免疫分析方法研究中的重要方向。其中均相熒光免疫分析在抗原抗體特性性反應完成之后，無需將抗原抗體復合物與游離的抗原抗體進行分離，可以直接進行測定，操作簡單快捷，易于實現自動化，得到了廣泛應用。熒光共振能量轉移(FRET)是一種非輻射的能量轉移，其產生需滿足以下4個條件1)能量供體的發射光譜與能量受體的激發光譜有效重疊；2)能量供體的量子產率較高；3)供體受體間滿足一定的耦極取向；4)供體受體間的距離小于10nm。供體與受體之間發生FRET將會使能量供體的熒光強度降低，受體發射的熒光強度增強，同時伴隨它們的熒光壽命的相應縮短和延長。FRET技術作為一種高效的光學“分子尺”，在于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應用。FRET屬于一種比較簡便的均相免疫分析法，由于其操作簡單，反應速度較快，越來越引起人們的關注。以FRET為基礎的均相免疫分析法可分為夾心法和競爭法。夾心法就是能量轉移的供體和受體分別標記同一個抗原相結合的兩種抗體，形成D-Abl:Ag:Ab2-A形式的抗原抗體復合物，使供體和受體之間的距離減小，發生FRET，從而可以判斷免疫反應的發生。競爭法就是能量轉移的供體和受體分別標記抗原和抗體中的一種。由于抗原、抗體之間的特異性結合，使供體和受體之間發生能量轉移，當加入未標記的抗原或抗體時，由于與標記的抗原或抗體發生競爭，產生無FRET現象的抗原抗體復合物，從而可以檢測抗原或抗體。基于熒光共振能量轉移的均相免疫分析方法是由1976年UlIman等人首先提出的，實現了抗原抗體的均相免疫分析的定量測定(UllmanEF，SchwarzbergM，RubensteinKE.JBiolChem,1976,251(14):4172_4178)。目前基于熒光共振能量轉移的均相免疫測定已應用于檢測抗原。Ueda等(UedaH,KubotaK,WangY，etal.Biotechniques，1999，27(4):738_742)用琥珀酰亞胺脂和熒光黃-X分別標記抗體的重鏈和輕鏈，兩者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗體的特異結合，使琥珀酰亞胺脂與熒光黃-X靠近，用490nm波長激發琥珀酰亞胺脂，檢測到520nm發射光減弱，605nm的發射光增強，隨著抗原量的增加，605nm的熒光亦增強。在檢測中只能對一種抗原進行定量分析。量子點是一種寬激發的熒光染料，相對于有機染料有很多優點，自2001年起就被應用于FRET中。首先，激發量子點的激發波長范圍很寬，可以從紫外到遠紅外區，因此可以用同一波長的光激發不同大小的量子點，并且可以通過選擇合適的激發波長來避免對受體分子的直接激發。其次，量子點的大小不同，所發射的熒光顏色不同，可以通過改變量子點的大小來調節量子點的發射光譜與受體分子吸收光譜的重疊程度，從而可以調節FRET的效率。再次，量子點的熒光譜峰狹窄而對稱，半高峰寬通常為2545nm；量子點的發光強度可達有機熒光染料羅丹明6G的數十倍，且熒光量子產率較高，對光漂白有強烈的抵制作用。由于這些獨特的量子優勢，近來對其應用于FRET的研究更為深入，范圍不斷擴展。本發明致力于利用寬激發的熒光材料激發波長范圍寬且發射光譜可調的特性，建立一種基于熒光共振能量轉移的多組分同時檢測的均相免疫分析方法。
發明內容本發明的目的在于建立一種多組分同時檢測的均相熒光免疫分析方法，以克服現有技術在多組分檢測中存在的步驟繁瑣、靈敏度低等不足，達到快速、靈敏的檢測目標。FRET技術主要用于液相反應中，將FRET應用于免疫分析即可根據標記物熒光信號的變化達到檢測的目的，無需洗滌分離的步驟，即均相免疫分析，從而實現快速檢測。寬激發的熒光材料具有激發波長范圍寬且發射光譜可調的特性，為多組分同時檢測提供了可能性。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種基于熒光共振能量轉移(FRET)的多組分同時檢測的均相免疫分析方法，是以高量子產率的熒光物質或化學發光物質為能量供體，以兩種或兩種以上寬激發的熒光染料為能量受體，按下列步驟操作步驟一用同一種所述的能量供體標記兩種或兩種以上待測抗原，用不同的能量受體分別標記相應的兩種或兩種以上的抗體，或用所述的兩種或兩種以上的能量受體分別標記兩種或兩種以上的待測抗原，用一種所述的能量供體標記相應的兩種或兩種以上抗體，得到標記組分，且所述的作為能量供體和能量受體的熒光物質為符合FRET特征的試劑對；步驟二配制五個已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測抗原溶液，令步驟一得到的標記組分與該已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測抗原溶液進行均相競爭免疫反應，反應過程如下將步驟一得到的標記組分與待測抗原溶液在PH6-8的緩沖液中混合均勻，25°C溫育30分鐘，得到混合體系；步驟三免疫反應完成后，以所用能量供體的最大激發波長為激發光，以所用的不同能量受體的發射波長檢測混合體系的熒光強度，得到各種能量受體的熒光光譜數據；步驟四依據各種能量受體的熒光光譜數據，采用去卷積法參見=EllenR.Goldman,AaronR.Clapp,GeorgeP.Anderson,etal,AnalyticalChemistry,2004(76)684-688，計算得到所用能量受體的相對熒光強度；步驟五制作待測抗原的標準曲線，進行公式擬合，分別得到各種待測抗原濃度的計算公式；步驟六令未知濃度的兩種或兩種以上待測抗原與標記組分重復以上步驟二、步驟三、步驟四，將最終得到的相對熒光強度代入上述步驟五得到的擬合公式中計算即得到各待測抗原的濃度。本發明方法中作為能量供體的熒光物質是熒光素、熒光蛋白或稀土元素；作為能量供體的化學發光物質是發光蛋白或魯米諾；作為能量受體的是寬激發的熒光染料，所述的寬激發的熒光材料是量子點、雙光子試劑或熒光蛋白。本發明方法中作為能量供體的稀土元素離子是Tb3+、Dy3+、Sm3+或Eu3+。在本發明方法所述的混合體系中，所用的能量供體是同一種，所用的能量受體是不同種，所用的能量受體與能量供體能組合成符合FRET特征的試劑對。本發明方法所述的待測的兩種或兩種以上抗原可以是病毒、細菌、真菌、衣原體、支原體、腫瘤相關抗原或具有抗原決定簇的物質。本發明將高量子產率的熒光物質或化學發光物質作為能量供體的前提下，將寬激發的熒光染料作為熒光共振能量轉移的受體，因寬激發的熒光染料熒光壽命很短(一般僅為315ns)，在時間分辨模式下，寬激發的熒光染料自身被儀器光源激發所發射的熒光信號被消除，而具有高量子產率的熒光物質或化學發光物質將能量轉移至能量受體的熒光信號就能被記錄，這樣就能解決其寬激發的問題，并且在時間分辨模式下能消除背景熒光的影響，大大提高分析方法的靈敏度。本發明是用于檢測樣本中兩種或兩種以上待測抗原濃度的方法，先進行抗原抗體的標記，當抗原標記上能量供體時，抗體標記能量受體；當抗體標記上能量供體時，抗原標記能量受體；在將檢測待測樣本與標記的抗原抗體相互接觸前后受體的相對熒光強度的變化，對待測樣本中的多種目標抗原濃度進行定量分析。具體是將兩種或兩種以上的待測抗原和分別特異識別這幾種抗原的單克隆抗體分別標記熒光特性能夠滿足發生FRET的能量供受體對，由于抗原抗體的特異性結合，將能量供受體的距離拉近，達到發生FRET的距離要求以內，即1lOnm，而發生FRET現象。加入幾種待測抗原后，待測抗原分別與熒光標記的抗原競爭而減弱了FRET現象，相應的能量供體的發射光增強，而能量受體的發射光減弱。分別測定幾種能量受體發射光熒光強度的變化，可以對待測樣本中的多種目標抗原濃度進行定量分析。本發明建立了一種基于熒光共振能量轉移(FRET)的均相時間分辨熒光免疫分析(FIA)的方法，有效解決了免疫分析方法中存在的操作步驟繁瑣、靈敏度低等缺點，保證了方法的快速靈敏，實現了多組分同時檢測。圖1為本發明原理示意圖，圖中1、2代表兩種不同發射波長的能量受體，3、4代表兩種待測抗原，5、6代表與3、4對應的單克隆抗體，7代表能量供體，8代表發生熒光共振能量轉移的過程。該原理示意圖中相同的圖形代表相同的內容。圖2是AFP濃度的標準曲線。圖3是HCGβ濃度的標準曲線。具體實施例方式實施例1制作標準曲線選用稀土元素離子Tb3+為能量供體，寬激發的熒光材料——兩種量子點為能量受體，以甲胎蛋白(AFP)和人絨毛膜促性腺激素(HCGii)為兩種待測抗原，闡述具體實施方式。1.使用的儀器多標記分析儀PerkinElmer1420；紫外-可見分光光度計(北京普析TU1901)2.使用的試劑氧化鋱購自國藥集團；碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，購自sigma試劑；稀土元素配體BBCAP購自sigma試劑；兩種量子點(發射波長為分別565nm、655nm)，購自美國Invitrogen公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，碳酸鹽，磷酸鹽，二甲基亞砜(DMSO)等為分析純。3.條件和步驟由以下三個步驟組成①稀土元素配體BBCAP標記抗原配制溶液稀土元素離子Tb3+溶液稱取50mg氧化鋱，溶于50mL6M的鹽酸溶液中，得到TbCl3溶液，即為Tb3+溶液；偶聯緩沖液0.05M(pH9.5)NaHCO3緩沖液；活化緩沖液0.OlM(pH7.4)磷酸鹽緩沖液；透析緩沖液0.01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.9%(w/v)NaCl；C存緩沖液0·01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.05%(w/v)NaN3。標記方法稱取BBCAP6.Omg，溶于0.5mL偶聯緩沖液中，加入9.OmgEDC.HCl，冰水浴中攪拌30分鐘，得到BBCAP與EDC·HCl混合液；稱取AFP抗原1.Omg,溶于0.3mL偶聯緩沖液中，逐滴滴入BBCAP與EDC-HCl混合液中，繼續冰水浴攪拌20小時；·4°C透析過夜，換液三次。產物用S印hedex650柱層析(0.01MpH8.OTris-HCl平衡)，取集第一峰，加0.05%NaN3(w/v)于4°C保存；用同樣的方法標記HCGβ。②量子點標記抗體；以DMSO為溶劑，配制IOmM的SMCC溶液。在125μL量子點溶液中加入14μLSMCC溶液，充分混勻后室溫下反應1小時，得到活化的量子點；·以活化緩沖液為溶劑，分別配制IM的DTT溶液和lmg/mL的AFP單抗溶液。在300μL單抗溶液中加入6.1μLDTT溶液，迅速混勻后室溫下反應30分鐘，得到活化的AFP單抗；分別將上述活化的量子點和活化的AFP單抗經S印hadex625柱層析純化，再將純化的產物混合，室溫下反應1小時，得到偶聯反應物；用蒸餾水配制IOmM的2_巰基乙醇溶液，在上述偶聯反應物中加入10μL2_巰基乙醇溶液，室溫下反應30分鐘，得到偶聯產物；偶聯產物用Superdex200柱層析純化(0.OlMpH7.4PBS溶液平衡)，取集第一峰，加0.05%NaN3(w/v)于4°C保存。③進行基于熒光共振能量轉移的均相時間分辨熒光免疫分析試劑準備稀釋液0·01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.9%(w/v)NaCl,0.2%(w/v)BSA；AFP抗原已知濃度的溶液0·lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、l.Ong/mL；HCGβ抗原已知濃度的溶液0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.5ng/mL、2.Ong/mL；AFP-BBCAP1.2μg/mL；HCGβ-BBCAP:2·0μg/mL；QD565-AbAFP0.3μMQD665-AbHCG00.5μM分析方法將AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP分別稀釋500倍，QD565_AbAFP、QD665-Ablirae分別稀釋100倍；在熒光微孔板中每孔加入兩種抗原標準點各30μL，再加入AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP各35μL，最后加入QD565_AbAFP、QD665-Ablirae各35μL，37°C溫育1小時;多標記分析儀在時間分辨模式下分別檢測565nm和655nm的熒光強度，結果如下QD565的熒光強度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>QD665的熒光強度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>依據兩種量子點的熒光光譜數據，采用去卷積法參見EllenR.Goldman,AaronR.Clapp,GeorgeP.Anderson,etal,AnalyticalChemistry,2004(76):684_688，計算得到各種能量受體的相對熒光強度，制作AFP與HCGi3的標準曲線，見圖2和圖3。AFP與HCGβ的標準曲線的計算公式分別為=Y=-1.84Χ+3.52，Y=-0.718Χ+4.23。血清中AFP與HCGβ濃度的測定將待測血清按照上述分析方法進行操作，測得565nm和655nm處的熒光強度分別為1356和2237，通過去卷積法計算得到的相對熒光強度分別為2.35和3.85，分別代入AFP與HCGβ的標準曲線公式，計算得到AFP與HCGβ的濃度分別為0.63ng/mL和0.53ng/mL。用時間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)測得的結果與上述結果一致。權利要求基于熒光共振能量轉移的多組分同時檢測的均相免疫分析方法，其特征在于，以高量子產率的熒光物質或化學發光物質為能量供體，以兩種或兩種以上寬激發的熒光染料為能量受體，按下列步驟操作步驟一用同一種所述的能量供體標記兩種或兩種以上待測抗原，用不同的能量受體分別標記相應的兩種或兩種以上的抗體，或用所述的兩種或兩種以上的能量受體分別標記兩種或兩種以上的待測抗原，用一種所述的能量供體標記相應的兩種或兩種以上抗體，得到標記組分，且所述的作為能量供體和能量受體的熒光物質為符合FRET特征的試劑對；步驟二配制五個已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測抗原溶液，令步驟一得到的標記組分與該已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測抗原溶液進行均相競爭免疫反應，反應過程如下將步驟一得到的標記組分與待測抗原溶液在pH6-8的緩沖液中混合均勻，25℃溫育30分鐘，得到混合體系；步驟三免疫反應完成后，以所用能量供體的最大激發波長為激發光，以所用的不同能量受體的發射波長檢測混合體系的熒光強度，得到各種能量受體的熒光光譜數據；步驟四依據各種能量受體的熒光光譜數據，采用去卷積法，計算得到所用能量受體的相對熒光強度；步驟五制作待測抗原的標準曲線，進行公式擬合，分別得到各種待測抗原濃度的計算公式；步驟六令未知濃度的兩種或兩種以上待測抗原與標記組分重復以上步驟二、步驟三、步驟四，將最終得到的相對熒光強度代入上述步驟五得到的擬合公式中計算即得到各待測抗原的濃度。2.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的熒光物質是熒光素、熒光蛋白或稀土元素。3.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的化學發光物質是發光蛋白或魯米諾。4.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量受體的是寬激發的熒光染料。5.按照權利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述的寬激發的熒光材料是量子點、雙光子試劑或熒光蛋白。6.按照權利要求2所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的稀土元素離子是Tb3+、Dy3+、Sm3+或Eu3+。7.按照權利要求1至6中任一項所述的分析方法，其特征在于，在所述的混合體系中，所用的能量供體是同一種，所用的能量受體是不同種，所用的能量受體與能量供體能組合成符合FRET特征的試劑對。8.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的待測的兩種或兩種以上抗原可以是病毒、細菌、真菌、衣原體、支原體、腫瘤相關抗原或具有抗原決定簇的物質。全文摘要本發明提供了一種基于熒光共振能量轉移的多組分同時檢測的均相免疫分析方法，該方法利用作為能量受體的熒光物質的多色性建立了一種基于熒光共振能量轉移(FRET)的均相熒光免疫分析(FIA)的新方法，實現了對多組分抗原的同時檢測。本發明將作為能量供體的熒光物質或化學發光物質以及作為能量受體的熒光物質分別標記需要檢測的幾種抗原和相應的抗體，抗原抗體的特異性結合使得能量供體和受體之間距離縮短，從而發生從能量供體到受體的FRET，根據受體的熒光強度變化得出樣品中抗原濃度，是一種快速、靈敏、多組分同時檢測的均相免疫分析新方法。文檔編號G01N33/577GK101806802SQ201010160060公開日2010年8月18日申請日期2010年4月29日優先權日2010年4月29日發明者劉振世,楊海,楊祥良,胡珊,金偉申請人:華中科技大學;武漢百仕康生物科技有限公司