熱反應設備及使用其的方法

專利名稱：熱反應設備及使用其的方法
優先權聲明
本申請要求各個下面申請的優先權2005年2月14日提出的美國專利申請No.11/058,106；2005年1月25日提出的美國專利申請No.11/043,895；2004年6月23日提出的No.10/876,046；以及2004年5月2日提出的美國專利申請No.10/837,885；各個申請通過引用以用于所有目的的其全文被結合。
相關申請的交叉引用
本申請還涉及2004年4月5日提出的美國專利申請No.10/818,642；2003年4月3日提出的美國臨時專利申請No.60/460,634；2004年4月5日提出的美國專利申請No.10/819,088；2004年4月5日提出的美國專利申請No.10/818,642；2002年11月27日提出的美國專利申請No.10/3063,798；2002年6月24日提出的美國臨時專利申請No.60/391,529；以及美國臨時申請No.60/335,292；各個申請通過引用以用于所有目的的其全文被結合。
背景 近來，為了實施提供用于準備和分析應用的各種化學和生化分析及合成，已經進行開發和制造微流體系統的嘗試。因為相對于在宏大規模上實施的分析及合成根據微型化可以實現大量的優點，因此出現制造這種設備的目標。這種優點包括利用這種設備實施分析或合成所需要的時間、成本及空間的真正的減少。另外，微流體設備具有適用于使用自動系統的可能，從而因人為干擾減少而具有進一步成本降低和減少操作者失誤的額外優點。微流體設備已經被提出用于各種應用，包括例如毛細管電泳、氣相色譜和細胞分離。
然而，這些優點的實現因與迄今為止已經被制造的微流體設備相關的各種錯綜復雜而經常受到阻礙。例如，許多目前微流體設備由基于硅石的基底制造；這些材料難于加工且是復雜的，并且由這些材料制造的設備是易碎的。另外，在許多現有微流體設備中的流體運輸要求以使用所述設備的可控制方式對復雜電場的調節。
因此，除了現有設備的目前限制之外，考慮到使用微流體設備可以實現的前述優點，仍舊存在對被設計用于實施各種化學和生化分析的微流體設備的需要。因為其在現代生物化學中的重要性，具體需要可被利用實施各種核酸擴增反應的的設備，該設備同時還具有用于各種類型分析中的足夠的通用性。
具有實施核酸擴增作用的設備將具有多種用途。例如，這種設備可能被用作分析工具，以確定在樣本中是否存在或缺少感興趣的具體目標核酸。因此，該設備可能被利用測試具體病原體(例如，病毒、細菌或真菌)的存在，以及識別用途(例如，父權(paternity)和法庭應用)。這種設備還可以被利用檢測或特征化先前與具體疾病或基因紊亂相關聯的特殊核酸。在用作分析工具時，該設備還可能被用于實施基因類型分析和基因表達分析(例如，不同基因表達研究)。可替換地，可以制備方式使用該設備以擴增足夠核酸用于進一步分析，譬如擴增產物、細胞類型、DNA指紋等。在各種基因工程應用中還可使用擴增產物，例如插入在然后可被使用以轉換細胞的向量中，用于想要的蛋白質產物的生產。
概述 在這里提供了用于實施微流體分析的多種設備和方法，包括可被利用以實施例如核酸放反應的熱循環反應的設備。該設備不同于常規微流體設備在于它們包括彈性部件；在某些例子中，許多或全部設備由彈性材料組成。
具體設備被設計以實施熱循環反應(例如，PCR)，所述設備包括一或多個彈性閥門，以調整流過設備的溶液。因此，還提供了使用這種設計的設備實施擴增反應的方法。
一些設備包括盲流動通道，所述盲流動通道包括起到反應點作用的區域。具體這種設備包括形成在彈性材料內的流動通道，以及多個與流動通道流體相通的盲流動通道，各個盲流動通道的區域限定反應區域。所述設備還包括重疊和相交于各個盲流動通道的一個或多個控制通道，其中彈性隔膜在各個交叉點將一個或多個控制通道與盲流動通道隔開。在這種設備將彈性隔膜設置偏斜入盲流動通道或從盲流動通道收回，響應于激勵作用力。所述設備可理想地進一步包括多個保護通道，其形成在彈性材料中和重疊流動通道和/或反應點中一個或多個。保護通道被設計具有貫通其間的流體流，以減少從所述設備中的流動通道和反應點的蒸發。另外，所述設備可理想地包括沉積在各個反應點內的一個或多個試劑。
在某一設備中，流動通道是多個流動通道中之一，各個流動通道與從那里分支的多級盲流動通道相流體連通。在這種設計的設備中，在一些例子中，多個流動通道互相內部連接，以致于流體可經由單入口被導入各個反應點。在其它設備中，然而，多個流動通道互相隔離，以致于導入一個流動通道的流體不能流入另一流動通道，以及各個流動通道包括在流體可被導入的一端或兩端處的入口。
其它設備包括具有至少50個點/cm2的密度的反應點陣列，反應點典型地形成在彈性材料內。其它設備具有更高密度，例如至少250、500或1000個點/cm2。
另一其它設備包括形成在彈性基底內的反應點，在彈性基底處用于實施反應的試劑為非共價固定的。試劑可以是一種或多種試劑，用于實質上實施任意類型反應。在一些實施例中，試劑包括用于實施核酸擴增反應的一種試劑。因此，在一些設備中，試劑包括引物、聚合酶和一種或多種核苷酸。在其它設備中，試劑是核酸模板。
還提供了各種矩陣或基于陣列的設備。這些設備中的某些包括(i)第一多個流動通道，其形成在彈性基底內，(ii)第二多個流動通道，其形成在彈性基底內，與第一多個流動通道相交叉，以限定反應點陣列，(iii)可被激勵的多個隔離閥門，其被設置在第一和第二多個流動通道內，以將各個反應點內的溶液與在另一反應點處的溶液相隔離，以及(iv)多個保護通道，其重疊一個或多個流動通道和/或一個或多個反應點，以阻止溶液從那里的蒸發。
前面設備可以被利用以實施大量不同反應，包括涉及溫度調整的那些(例如，核酸分析的熱循環)。使用某些盲道性設備實施的方法涉及提供包括形成在彈性材料內的流動通道的微流體設備；以及與流動通道相連通的多個盲流動通道，各個盲流動通道的末端區域限定反應點。至少一種試劑被引入各個反應點，然后反應在一個或多個反應點處被檢測。方法可優選擇地包括在反應點內對至少一種試劑加熱。因此，例如，方法可涉及引入用于核酸擴增反應的部件，以及然后對部件進行熱循環以形成擴增的產物。
其它方法涉及提供包括一個或多個反應點的微流體設備，各個反應點包括用于實施分析的第一試劑，所述試劑被非共價地沉積在彈性基底上。然后，第二試劑被導入一個或多個反應點，從而第一和第二試劑混合以形成反應混合物。在一個或多個反應點處在第一和第二試劑之間的反應隨后被檢測。
另一其它方法涉及提供微流體設備，所述微流體設備包括形成在基底內的反應點陣列且具有至少50個點/cm2的密度。至少一個試劑被引入各個反應點。然后，檢測在一個或多個反應點處的反應。
又一其它方法涉及提供微流體設備，所述微流體設備包括形成在彈性基底內的至少一個反應點以及還有多個保護通道形成在彈性基底內。至少一個試劑被引入各個反應點，然后在反應點內被加熱。在加熱之前或期間流體流過保護通道，以降低從至少一個反應點的蒸發。在至少一個反應點內的反應隨后被檢測。
還提供了被設計降低流體從設備蒸發的另外設備。一般地，這種設備包括腔體，所述腔體是形成在彈性基底中的微流體網絡的部分；以及多個保護通道，其重疊腔體且通過隔膜與腔體相分離。在這種設備的保護通道被制成合適大小，(i)允許溶液流過其中，以及(ii)以致于因隔膜在激勵作用力對保護通道的作用而偏轉，流入、流出或流過腔體的溶液基本上沒有減少。其它設備包括(i)一個或多個流動通道和/或一個或多個反應點；以及(ii)多個保護通道，其重疊微流體設備且通過彈性體與那里相分離，其中保護通道之間的間隔在1μm至1mm之間。在其它設備中，間隔在5μm至500μm之間，在其它設備中，在10μm至100μm之間，在另一其它設備中，間隔在40μm至75μm之間。
還提供了在某些微流體設備的反應點中實施核酸分析的合成物。某些這些合成物包括下面中的一種或多種阻滯蛋白質結合在彈性材料上的試劑和洗滌劑。阻滯劑典型地由包含蛋白質的組中選擇(例如明膠或清蛋白，例如牛血清清蛋白(BSA))。洗滌劑例如可以是SDS或Triton。
附圖簡要說明

圖1A是示例設備的示意表示，具有交叉垂直和水流動通道的矩陣設計。
圖1B-E顯示圖1A中所示設備的部分的擴增視圖，并示出其操作。
圖1F是另一示例矩陣設計設備的示意表示，其利用保護通道減少樣本蒸發。
圖2是示例盲道設備的平面圖。
圖3A是另一示例盲道設備的平面圖。
圖3B是更復雜盲道設備的示意表示，基于圖3A中所示的通用設計的單元。
圖4是利用混合設計的設備的平面圖。
圖5是顯示實施熱循環反應的上升(ramp up)和下降時間的圖標。
圖6顯示在盲道型設備中的反應點內點樣試劑的位置(spotted reagent)的位置，示出試劑在設備拐角處反應點內正確的排列。
圖7A和7B分別是另一混合型微流體設備的橫截面圖和示意圖，并且表示被用于實施例1-4中所述試驗的這種設備。
圖8是條形圖，在其中繪出用于六種不同β肌動蛋白TaqMan反應的平均FAM/PRI/控制比率。這些反應在微流體設備(芯片)中和Macro(宏)TaqMan反應中被熱循環。所述控制為沒有DNA的第一和第四條形集合。誤差條是這些比率的標準偏差。
圖9是描繪示例針點樣工藝的圖。從源(例如微量滴定板(microtiterplate))中汲取試劑，然后通過使加載針接觸基底被印刷。洗刷步驟包括在真空干燥之后在去離子水中的攪動。
圖10是條形圖，描繪基于例2中所述試驗的用于例1(見圖7B)中所述微流體設備(芯片)的FAM信號強度。數據為由標準線道的FAM/PRI比率衡量的(FAM信號/PRI信號)形式。誤差條線為沿線道的標準偏差。“1.3X”和“1X”指示指代點樣極和探針相關于其標稱值的集中度。
圖11是條形圖，顯示在微流體設備(實心條)中用于Macro TaqMan(條圖)和TaqMan反應的9-10孔的平均VIC/PFI/控制比率。兩個負控制(控制)和具有100pg/nl基因組DNA的兩個樣本被熱循環，如上所述的反應部件具有4倍的標準極/探針。誤差條線表示平均比率的標準偏差。
圖12是條形圖，顯示用于從微流體設備的單流通通道(見圖7B)中分支的各個10-1nl孔的FAM/PRI/控制比率。基因組DNA的數量為0.25pg/nl，這產生每個孔的一個目標備份的平均。
圖13是條形圖，描繪使用圖7B中所示的微流體設備的用于CYP2D6SNP的平均VIC/PRI/控制比率。Allele 1(Al-1)是針對基準或野生型等位基因CYP2D6*1的用于VIC探針的位置控制。Allele 2(Al-2)是針對變型或突變等位基因CYP2D6*3的用于FAM探針的位置控制。控制沒有DNA模板。以100pn/pl或20pn/pl使用基因組DNA。誤差條線是這些比率的標準偏差。
圖14是條形圖，顯示在圖7B中所示的微流體設備中用于CYP2D6SNP的平均FAM/PRI/控制比率。樣本與相關于圖13及例3中所述的相同。
圖15是用于例4中試驗的微流體設備的示意圖。
圖16是包含來自圖7B中所示的微流體設備中Macro PCR和PCR反應的PCR產物的聚丙烯酰胺凝膠。在左側上結果示出不同DAN基對長度的近似漂移。包含散布帶的線道為分子量標示。標示“Macro”的線道是來自不同稀釋液的Macro反應的PCR產物。標示“In chip(芯片中)”的線道是在芯片中產生的PCR產物。包含貫通凝膠的許多條帶線道非特異性背景信號。
圖17a-17d描繪在閥門關閉和閥門閉合狀態中隔離微流體設備的兩個優選設計。
圖18a和18b描繪在執行熱循環反應之后隔離微流體設備的圖像。圖18a描繪兩個彩色圖像，以及圖18b描繪減少控制紅色信號的之后的剩余信號。
圖19描繪每孔復制的平均數量與正極性孔數量比較的圖表。
圖20描繪等溫擴增配置-SCORPION。
圖21描繪示例矩陣微流體設備平面圖。
圖22A描繪根據本發明實施例的具有整體壓力累積井(well)的微流體設備的基底； 圖22B描繪圖8A中所示的微流體設備的展開圖，進一步包括彈性塊； 圖22C是圖22B中所示的微流體設備的整體圖； 圖22D是圖22B中所示的微流體設備的平面圖； 圖22E是圖22B中所示的微流體設備的橫截面圖； 圖23是在本發明微流體設備中某些實施例中使用的通路(via)的橫截面圖。
圖24是根據本發明實施例的用于激勵微流體設備的情形的透視圖。
圖25描繪被推向根據本發明實施例的微流體設備的上表面的壓盤的剖視圖； 圖26A是根據本發明實施例的系統的簡化整體圖； 圖26B是圖26A的系統中接收臺的透視圖； 圖26C是在根據本發明另一實施例的板接口或壓盤內流體選擇路線(routing)的后平面圖； 圖27A和27B是顯示根據本發明實施例的界面壓盤的橫截面側視圖，所示界面壓盤被匹配到載體上； 圖28A是根據本發明實施例的整體載體的透視圖； 圖28B是根據本發明中另一實施例的使用PCR的整體載體的透視圖； 圖29A是用于約束圖28A中載體的系統的簡化橫截面圖； 圖29B是用于約束圖28B中載體的系統的簡化橫截面圖； 圖29C是圖28B中載體部分的簡化平面圖； 圖29D是使用圖28B中系統的真空卡盤(vacuum chuck)的簡化平面圖；以及 圖30是使用圖28B中系統的真空卡盤的簡化整體圖。
詳細說明 I.定義 如果沒有特定限定，這里使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的技術人員共同理解的含義。下面參考將本發明所使用的眾多術語的一般性定義提供給技術人員Singleton等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed.1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS，5TH ED.，R.Rieger等(eds.)，Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY(1991).如這里所使用的，下面術語歸若沒有特定限定則屬于它們的含義。
“流動通道”通常指的是溶液通過其可流動的流通路徑。
若沒有特定指示，術語“閥門”指的是在其中內插入流通通道和控制通道且由彈性膈膜分隔開的結構，所述彈性膈膜響應激勵力可被偏轉入流動通道或從流動通道收回。
“盲道”或“死胡同通道”指的是流動通道，其具有入口單沒有單獨的出口。因此，進出盲道的溶液流出現在同樣位置。充填一個或多個盲道的填充過程有時被簡稱為“盲目填充(blind fill)”。
“隔離反應點”通常指的是沒有與設備上存在的其他反應點流體連通的反應點。在相關于盲道被使用時，隔離反應點為盲道末端的區域，所述區域可以由與盲道相關聯的閥門堵塞。
“通孔(via)”指的是形成在彈性材料設備中的通道，以提供流體在設備的外部端口和一個或多個流動通道之間進出。因此，通孔可用作樣本輸入或輸出，例如。
術語“彈性材料體”和“彈性材料”具有本領域所使用的通常含義。因此，例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry，第二代Ed)描述了通常作為存在于其玻璃轉化溫度和液化溫度之間溫度處的聚合物的彈性材料體。彈性材料展示彈性性能，因為聚合物鏈容易受到扭轉運動以響應于作用力而使主鏈伸直，在沒有作用力下主鏈重新纏繞呈現先前形狀。一般地，在施加作用力時彈性體變形，但然后在去除作用力時回復至其初始形狀。由彈性材料展示的彈性可以由楊氏模量具體化。在這里公開的的利用在微流體設備中的彈性材料典型地具有在大約1Pa-1Tpa的楊氏模量，在其它例子中在大約10Pa-100Gpa之間，在另一其他例子中在大約20Pa-1Gpa之間，在又一其他例子中在大約50Pa-10Mpa之間，以及具體例子中在大約100Pa-1Mpa之間。取決于具體應用的需要，還可以利用具有這些范圍之外的楊氏模量的彈性材料。
這里所述的某些微流體設備由彈性體聚合物制造，例如，GE RTV 615(配方)、乙烯-硅烷交聯(型)硅酮彈性體(族)。然而，本微流體系統不限于這一種配方、型號或這族聚合物；而是，幾乎任意彈性體聚合物均是使用的。給定聚合物化學的差異性、母體、合成方法、反應條件和可能的添加劑，有大量可能彈性體系統，其可被使用制造單片彈性微閥門和泵。對材料的選擇典型地取決于被實施應用所要求的具體材料參數(例如，耐溶劑性(solvent resistance)、硬度、可透氣性和/或溫度穩定性)。在這里公開的相關于在微流體設備部件的制造中可被使用的彈性體材料類型的另外細節被闡述在Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO02/43615及WO01/01025中，其在此通過引用以其用于所有目的的全文被結合。
術語“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”在這里被使用用于包含任意長度的核苷酸的聚合體形式，包括但不限于核糖核苷酸(ribonucleotide)或脫氧核糖核苷酸。在這些術語之間在長度上沒有想要的差別。另外這些屬于僅僅指的是分子的主要結構。因此，在具體實施例中，這些術語可以包含三個、雙個和單個絞合DNA，以及三個、雙個和單個絞合RNA。它們還包括變更，例如通過甲基化和/或壓蓋(capping)，以及多核苷酸的未變化的形式。尤其是，術語“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”包括多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)、為嘌呤或嘧啶堿的N-或C-糖苷的任意類型多核苷酸，以及包含非核苷酸主鏈(nonnucleotidic backbone)的其他聚合物，例如聚酰胺(譬如肽核酸(PNA))和聚嗎啉代(polymorpholino)(與Neugene一樣可以從Corvallis Oregon(康瓦利斯城俄勒岡州)Anti-Virals有限公司買到)聚合物以及其他合成序列特定核酸聚合物，假定聚合物在允許堿基配對和堿基堆積的結構中包含核酸基鹽(nucleobases)，例如在DNA和RNA的構造中。
“探針”是一種核酸，其使用一種或多種化學鍵能夠結合互補序列的目標核酸，通常使用互補基對，通常使用氫鍵構成，從而形成復式結構。探針結合或雜交“探針結合點”。探針可由可檢測標示來標示，以允許探針的輕易檢測，具體地曾經探針雜交至其互補目標。例如，附連到探針的標示可包括任意本領域已知的各種不同標示，它們可以通過化學或物理手段來檢測。可被附連到探針的適當標示包括但不限于放射性同位元素、熒光團、發色團、質量標示、電子密度顆粒、磁顆粒、自旋標示、發射化學螢光的分子、電化學活性分子、酶、輔助因子和酶基片。探針能夠在大小上明顯改變。一些探針是相當的端。通常，探針為至少7至15個核苷酸長。其它探針為至少20、30或40個核苷酸長。另一探針略微更長，為至少50、60、70、80、90個核苷酸長。又一探針更長，為至少100、150、200個或更多個核苷酸長。探針還可以為落入前面范圍內的任意特定長。
“引物(primer)”是單旋多聚核苷酸，其在合適條件(也就是，四種不同三磷酸核苷和用于聚合的試劑例如或DNA或RNA聚合酶或反轉轉錄酶的情況下)下在合適緩沖物基在適當溫度處能夠起到模板導向的DNA合成中的起始點作用。引物的合適長度取決于引物所要的長度，但是典型地為至少7個核苷酸長，以及更典型地在10至30個核苷酸長之間變化。短引物分子一般要求較低溫度，以與模板形成足夠穩定的復合聯合體。引物不必反應模板的特定序列，但必須足夠互補以與模板雜交。術語“引物點”或“引物結合點”指的是引物雜交的目標DNA的節段。“引物對”標示包括5′“上游引物”和3′“下游引物”的一序列引物，5′“上游引物”與將被擴增的DNA序列的5′端的補充物雜交，3′“下游引物”與將被擴增的DNA序列的3′端的補充物雜交。
“完美互補的”引物具有在引物整個長度上的完全互補的序列，并且沒有失諧。引物對目標序列的部分(子序列)典型地是完美互補的。“失諧”指的是引物中的核苷酸和與其對齊的目標核酸中的核苷酸不是互補的點。參照引物使用時的術語“基本上互補”表示引物與其目標序列不是完美互補的；代替之，引物僅僅充分互補的，以在理想的引物結合點處選擇地雜交至各自的螺旋。
術語“互補”表示一個核酸與另一個核酸分子是一致的或選擇性雜交的。相比總的特異性缺失，更多選擇性的雜交選擇性出現在雜交發生時。典型地，在至少14-25個核苷酸的拉伸上有至少大約55％相同時，，選擇性雜交將發生，優選至少60％，更優選至少75％，進而最優選至少90％。優選地，一個核酸專門雜交至其余核酸。參見M.Kanehisa，Nucleic AcidsRes.12203(1984)。
術語“標示”指的是可以通過物理、化學、電磁和其它相關分析技術檢測的分子或分子方面。可被利用的可檢測標示的例子包括但不限于放射性同位元素、熒光團、發色團、質量標示、電子密度顆粒、磁顆粒、自旋標示、發射化學螢光的分子、電化學活性分子、酶、輔助因子、鏈接至核酸探針的酶和酶基片。術語“可檢測標示”表示與標示共軛結合的試劑或具有某些固有特征(例如，大小、形狀或顏色)的試劑，所述特征允許其沒有共軛結合至分離標示而被檢測。
“多形態標記”或“多形態點”為擴散發生處的地點。優選的標記具有至少兩個等位基因，各個等位基因以大于所選擇群體的1％的頻率出現，更優選地以大于10％或20％。多形態地點可以與一基對一樣小。多形態標記包括限制酶斷片長度多晶型、可變數量銜接重復(VNTR′s)、超變量區域、小隨體(minisatellite)、二核苷酸重復、四核苷酸重復、單序列重復和例如Alu的插入元素。第一可識別等位基因形式被任意設計為參考形式，以及其它等位基因形式被設計為替代的或可變的等位基因。在選擇的基團中最頻繁出現的等位基因形式有時被稱為野生型形式。二倍有機體可以是等位基因形式的同型結合或雜合的。二對等位基因多形態具有兩種形式。三對等位基因多形態具有三種形式。
“單核苷酸多形態”(SNP)出現在由單核苷酸所占據的多形態點，所述多形態點為等位基因序列之間變化的位置。該部位之前或之后通常有等位基因的高度保守序列(例如，在小于人群1/100或1/1000的成員中改變)。單核苷酸多形態通常由于在多態位點一個核苷酸代替另一個而產生。轉換是一個嘌呤被另一嘌呤代替或一個嘧啶被另一嘧啶代替。顛換是嘧啶代替嘌呤或反之。單核苷酸多形態也可由核苷酸缺失或核苷酸關于參考等位基因的插入而產生。
“試劑”廣義地指任何在反應中應用的藥劑。試劑可包含自身可被監測的單一試劑(例如，當其被加熱時被監測的物質)或兩者或更多試劑的混合物。試劑可以是有生命的(例如，細胞)或無生命的。用于核酸擴增反應的可仿效的試劑包含但不局限于緩沖液、金屬離子、多聚酶、引物、模板核酸、核苷酸、標記、染料、核酸酶以及諸如此類。用于酶反應的試劑包含，例如，底物、輔助因子、聯結酶、緩沖液、金屬離子、抑制劑和催化劑。用于基于細胞的反應的試劑包含但不局限于細胞、細胞特異性染料和結合至細胞受體的配基(例如，激動劑和拮抗劑)。
“配基”是指任何分子，對于該分子存在另一特異性或非特異性結合至該配基的分子(即，抗配基)，所述結合由于抗配基對配基某部分的識別。
II.概述 在這里提供具有獨特流動通道構造的大量不同微流體設備(有時成為芯片)，還有使用這些設備實施各種高吞吐量分析的方法。這些設備被設計用于需要溫度控制的分析中，尤其涉及熱循環的分析中(例如，核酸擴增反應)。微流體設備結合具體設計特征假定具有明顯小于許多常規微流體設備的足跡的設備，使該設備將容易地與其他儀器相結合以及用于自動分析。
某些微流體設備使用了典型地在這里被稱為“盲道”或“盲填充”的設計，其部分特征在于具有大量盲道，如在限定部分中所指示的，所述盲道是具有死端或封閉端的流動通道，以使溶液可以僅僅在一端進出盲道(也就是，沒有分離的盲道的進口和出口)。這些設備僅僅需要用于各個盲道的單一閥門，以封閉盲道區域形成封閉的區域點。在這種設備的制造期間，將用于實施分析的一個或多個試劑沉積在反應點，從而導致輸入和輸出數量的明顯減少。另外，盲道被連接到相互連接的通道網絡，以使可以從單一或有限數量的樣本輸入填充所有反應點。因為輸入和輸出的復雜度的降低以及基金單一閥門被用于封閉各個反應點，所以增加了可用于反應點的空間。因此這些設備的特點意味著各個設備可包括大量反應點(例如，直至數千個)且可以實現高反應點密度(例如，超過1000-4000反應點/cm2)。單獨地和共同地，相比于傳統微流體設備，這些特點還直接轉變為這些設備大小的明顯減小。
在這里公開的其他微流體設備使用矩陣設計。一般地，這種類型的微流體設備使用大量相互交叉的水平和垂直流動通道，以在交叉點處限定反應點陣列。因此，這種設計的設備還具有反應點陣列；然而，使用這種設計，為了調節大量樣本而有大量樣本輸入和對應的輸出。被稱為可轉換流動陣列結構的閥門系統使溶液能夠選擇性地僅僅流過水平流動通道，從而允許矩陣中的各種流動通道的可轉換封閉。因此，盡管盲道設備被設計以在不同狀況下使用有限數量樣本實施大量分析，然而矩陣設備被構造以在有限數量狀況下對大量樣本進行分析。另一其他設備使這輛中通常設計類型的組合。
被描述的微流體設備其另外特征部分在于，使用各種部件，例如由彈性體材料制造的流動通道、控制通道、閥門和/或泵。在一些例子中，實質上，整個設備由彈性體材料制造。因此，這種設備在形式和功能上明顯不同于由基于硅的材料制造的常規微流體設備的主要特點。
所述設備的設計使它們能夠與大量不同加熱系統相組合而被利用。因此，所述設備在實施要求溫度控制的各種分析中是有用的。另外，在加熱應用中使用的這些微流體設備可結合另外的設計特征，以是從反應點的樣本蒸發最小化。這種類型的設備通常包括形成在彈性設備內的大量保護通道，水可以通過所述保護通道流入以增加形成所述設備的彈性材料內的水蒸氣壓力，從而降低從反應點的樣本蒸發。
在另一實施例中，可以使用溫度循環設備以控制微流體的溫度。優選地，微流體設備可能適于與微流體設備實現熱接觸。其中微流體設備由例如載玻片的基底材料或例如塑料載體的載體板底部支承，可以在載體或載片的區域中形成窗口，以使微流體設備優選具有彈性塊的設備可以直接接觸溫度循環的加熱/制冷塊。在優選實施例中，加熱/制冷塊具有在其中的凹槽，以與供給微流體設備吸力的真空源相連通，優選在其中發生反應的部分。可替換地，可將剛硬熱傳導板粘結到微流體設備，所述微流體設備然后與加熱和制冷塊相匹配，用于實施熱傳導效應。
某些設備的陣列格式意味著該設備能夠實現高吞吐量。共同地，高吞吐量和溫度控制能力使這些設備對執行大量核酸擴增(例如，聚合酶鏈反應-PCR)是有用的。這種反應在這里將被詳盡地描述為所述設備效用的指示，尤其它們在需要溫度控制的任意反應中的用途。然而，應當理解的是，所述設備不限于這些具體應用。所述設備可被用于多種其他類型分析或反應中。多個例子包括對蛋白質配合基相互作用和多個單元和各種化合物之間相互作用的分析。在下文中提供了另外的例子。
III.微流體設備的一般結構 A.泵和閥 這里公開的微流體設備通常至少部分由彈性體材料構造和使用單一或多層柔軟平版印刷(MSL)技術或犧牲層封裝方法(參見，例如Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO01/01025中，其兩者在此通過引用以其用于所有目的的全文被結合)構造。使用這種方法，微流體設備可被設計，在其中控制流過所述設備流動通道的溶液，至少部分地使用由彈性隔膜或扇形體與流動通道分離的一個或多個控制通道。這個隔膜或扇形體可被偏轉進入流動通道或從流動通道中縮回，通過將激勵力作用到控制通道使控制通道與流動通道相關聯。通過控制隔膜被偏轉進入流動通道或從流動通道中縮回的程度，溶液流動可以被減緩或完全被堵塞流動通道。使用這種類型的控制通道和流動通道的組合，人們可以制備各種不同類型的閥門和泵，用于調節溶液流動，如在Unger等(2000)Science288113-116，和PCT公開WO/02/43615和WO01/01025中詳細地所述的一樣。
這里所提供的設備結合了這種泵閥，以選擇地隔離允許試劑發生反應處的反應點。反應點可被定位在設備內任意不同位置。例如，在一些矩陣型設備中，反應點被定位在一套流動通道的交叉處。在盲道設備中，反應點被定位在盲道的末端。
如果在溫度控制反應(例如，熱循環反應)中使用該設備，然后，如在下文中更詳細所述的，彈性體設備典型地被固定到支承上(例如，載玻片)。然后，可將得到的結構放置在溫度控制板上，例如，以控制在各種反應點處溫度。在熱循環反應的情況中，可將該設備放置在任意數量的熱循環板上。
因為該設備由是相對光透明的彈性材料制造，使用各種不同檢測系統可以容易地監控實質上在微流體設備上任意位置處的反應。然而，大多數檢測典型地發生在反應點自身處(例如，在包含流動通道的交叉點或在流動通道的盲端的區域內)。該設備由基本上透明材料制造的事實還意味著對常規基于硅的微流體設備沒有用途的當前設備可以使用具體檢測系統。使用被結合進所述設備或與所述設備分離但與將被檢測設備的區域對齊的檢測器，可以實施檢測。
B.保護通道 為了減少樣本和試劑從這里提供的彈性微流體設備的蒸發，大量保護通道可以被形成在所述設備中。保護通道與控制通道類似之處在于典型地它們被成形在彈性體層中，所述彈性體層覆蓋在流動通道和/或反應點上。因此，與控制通道一樣，保護通道與下方流動通道和/或反應點由彈性材料的膈膜或扇形體分離開。與控制通道不一樣，保護通道的橫截面積是相當小的。一般地，具有較小面積的膈膜比具有較大面積的膈膜在同樣施加的壓力下將更小偏斜。設計保護通道，以將被壓縮以使溶液(典型地是水)流入保護通道。源于保護通道的水蒸氣可散布入鄰近流動通道或反應點的彈性體孔徑中，從而增加鄰近流動通道或反應點的水蒸氣密度，并且減少從那里的溶液蒸發。
一般地，保護通道是足夠小的，以使在壓縮分離保護通道與下方流動通道或反應點的膈膜時，基本上不會限制溶液流入、流出或流過流動通道或保護通道重疊的反應點。術語“基本上限制”或其他類似術語在這個上下文中被使用時意味著與在相同條件下進、出或通過流動通道或反應點的溶液流相比，在進、出或通過流動通道或反應點的溶液流沒有減少多于40％，典型地少于30％，通常少于20％，以及在一些例子中少于10％，在保護通道沒有被壓縮以得到通過其中的溶液流時。通常這意味著保護通道具有在100μm2和50,000μm2之間的橫截面積，或者在其間的任意整體或非整體橫截面積。因此，例如，在某些例子中，橫截面積小于50,000μm2，在其它例子中小于10,000μm2，在另一例子中小于1000μm2，以及在又一例子中小于100μm2，保護通道可以具有任意各種形狀，包括但不限于圓形、橢圓形、正方形、矩形、六邊形和八面體形狀。
保護通道被設計以在它采用實施熱循環反應的期間和條件下減少來自所述設備的樣本和試劑的蒸發至小于50％，在其它例子中小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％。因此，例如，包含40循環的典型PCR反應可以在120分鐘內被實施。保護通道系統被設計以在近似這個時間框架期間將蒸發減少至前述限制。為了達到這個蒸發減少的水平，保護通道典型地呈現在至少10線/cm2至1000線/cm2的密度，或者在其間的任意整數密度值。尤其是，保護通道一般為至少25線/cm2，在其他例中至少50線/cm2，在另一例中至少100線/cm2，以及在又一例中至少500線/cm2。為了達到蒸發減少的這個水平，保護通道典型地呈現如從一線的外邊沿至相鄰線最近外邊沿被測量的在1mm至1μm之間間隔處，或者在其間的任意整數密度水平。尤其是，保護通道一般地間隔500μm至5μm之間，在其他例子中在100μm至10μm之間，在另外例子中在75μm至40μm之間。因此，間隔典型地為至少μml，而小于1mm，在其他例子中小于500μm，在另外例子中小于400μm，在又一例子中小于300μm，在其他例子中小于200μm，在另一例子中小于100μm、50μm或25μm。
保護通道可被形成為分離的通道網絡，或者可是分支控制通道的較小通道。保護通道可伸展過所述設備或者僅有所述設備的具體區域或多個區域。典型地，保護通道被鄰近和在流動通道和反應點上方設置，與這些是蒸發主要涉及的主要位置處。保護通道在具體矩陣設備上的示例位置被示出在圖1C中，以及保護通道在具體盲道設備上的示例位置被示出在圖3B和3C中，并且在下文中被詳細說明。
流過保護通道的溶液包括能夠減少水蒸發的任意物質。所述物質可是增加鄰近流線和/或反應點的水蒸氣濃度的一種，或是盡管沒有增加水蒸氣濃度但是阻礙從流線和/或反應點的水蒸發的一種(阻塞劑)。因此，一種選擇是實質上利用任意水溶液，在這種情況中合適的溶液包括但不限于水和緩沖溶液(例如，TaqMan緩沖溶液和磷酸緩沖鹽水)。合適的阻塞劑包括例如礦物油。
保護通道典型地被成形在彈性體中，利用上面引證的MSL技術和/或犧牲層封裝方法。
下面部分更詳細地描述大量具體結構，其可被利用實施各種分析，包括需要溫度控制的分析(例如，核酸擴增反應)。應當理解的是，然而，這些結構是示例性的且對這些系統的改型對于本領域技術人員將是顯而易見的。
IV.矩陣圖 A.概述 利用矩陣圖的設備一般具有多個垂直和水平流動通道，所述多個垂直和水平流動通道相互交叉形成連接點陣列，因為不同樣本和試劑(或成套試劑)可被導入各個流動通道，因此大量樣本可在相當多的反應條件下以高吞吐量格式被測試。因此，例如，如果不同樣本被導入M個不同垂直流動通道中的每個，并且不同試劑(或成套試劑)被導入N個不同水平流動通道中的每個，然后可以同時實施M×N個不同反應。典型地，矩陣設備包括用于垂直和水平流動通道的可轉換隔離的閥門。所述不同地，使閥門定位以允許選擇僅僅穿過垂直流動通道或僅僅穿過水平流動通道的流動。因為這種類型的設備允許相關于樣本的類型和數量、以及試劑數量和類型的選擇的彈性，所以這些設備非常好地適于實施分析，在其中人們試圖在相當多的反應條件下篩選大量樣本。矩陣設備可優選地結合保護通道以有助于阻止樣本和試劑的蒸發。
本發明提供用于高密度矩陣設計，所述設計利用微流體設備中層間流體連通通孔，以構造貫通設備的控制線和流體線。例如，通過使流體線位于兩層彈性體阻塞的各層中，更高密度反應單元布置是可能的。圖21描繪了示例矩陣設計，其中各個具有流體通道的第一彈性層2110(第一層)和第二彈性層2120(第二層)形成在其間。例如，第一層2110中的試劑流體通道通過通孔2130被連接到第二層2120中的試劑流體通道，盡管第二層2120在其中也具有樣本通道，樣本通道和試劑通道分別終止在樣本和試劑腔2180中。樣本和試劑腔2180通過接口通道2150互相連通，所述接口通道2150具有與其相關聯的接口閥門2140以控制反應單元2160中各個腔2180之間流體流通。使用中，接口被首先關閉，然后將試劑從試劑入口導入試劑通道，以及將樣本通過樣本入口導入樣本通道，然后容器閥門2170被閉合，以將各反應單元2160與其它反應單元2160隔離。一旦反應單元2160被隔離，則打開接口閥門2140以使樣本腔和試劑腔處于互相連通之中，以使可以發生想要的反應。
因此，本發明的優選方面提供用于M數量不同樣本與N數量不同試劑反應的微流體設備，所述微流體設備包括多個反應單元、各個反應單元包括樣本腔和試劑腔，樣本腔和試劑腔通過接口通道處于流體連通中，所述接口通道具有在其間關聯的接口閥，用于控制樣本腔和試劑腔之間樣本連通；多個試劑入口，各個處于與試劑腔的流體連通中；其中樣本入口或試劑入口中之一通過通孔分別處于與樣本腔之一或試劑腔之一相流體連通。具體實施例包括使反應單元形成在彈性塊內，所述彈性塊由結合在一起的多層形成，以及接口閥是可偏轉隔膜；使樣本入口通過樣本通道與樣本腔相連通，以及試劑入口通過試劑通道與試劑腔相連通，樣本通道部分和試劑通道部分被大約彼此平行地定位，并且各個具有相互關聯的容器閥，用于控制貫通的流體連通；使與樣本通道相關聯的閥門以及與試劑通道相關聯的閥門互相是可操作地連通的，通過公共容易控制通道；使容器公共控制通道沿大約垂直樣本通道或試劑通道之一的線被定位。
本發明的另一方面提供用于實現彈性材料塊中特征的方法，所述方法包括步驟提供第一彈性材料層；在第一彈性材料層表面上施加光致抗蝕劑層；對光致抗蝕劑層施加光圖案以形成反應的光致抗蝕劑材料的圖案；去除未反應的光致抗蝕劑材料，在第一彈性材料層表面上剩下已反應的光致抗蝕劑圖案；對第一彈性材料層施加蝕刻試劑以蝕刻沒有由已反應光致抗蝕劑材料的圖案覆蓋的第一彈性材料層表面，從而去除沒有由已反應光致抗蝕劑材料的圖案覆蓋的第一彈性材料層區域，而剩下對應于已反應光致抗蝕劑材料圖案的彈性材料層圖案。在本方法的具體優選實施例中，所述方法包括去除已反應光致抗蝕劑材料圖案的步驟；通過將粘接帶應用到彈性材料層和已反應光致抗蝕劑材料圖案的表面，引起實施去除，然后從彈性材料層分離粘接帶，同時一些或全部已反應光致抗蝕劑材料圖案被從彈性材料的表面去除；使光致抗蝕劑為SU8；使蝕刻劑包括四丁銨氟化物-三水合物；使特征為通孔；使彈性材料塊包括粘接在一起的多個彈性材料層，其中兩個或多個彈性材料層具有形成在其中的進出口，并且一個彈性材料層中的一個進出口通過通孔與另一彈性材料層中的進出口相連通。
本發明的微流體設備可被進一步集成入載體設備，所述載體設備被描述在由Unger于2004年3月29日提出的待審及共有的US專利申請序列號60/557,715中，其在這里用于所有目的而被結合。Unger載體提供板上連續流體壓力，以使遠離流體壓力源的閥門保持閉合，例如家庭氣壓。Unger另外提供用于自動系統，用于對如這里所述的本發明的閥門進行裝料(charge)和激勵。另一優選實施例，用于對累積器裝料和對閥門激勵的自動系統采用具有壓盤的設備，所述壓盤匹配在微流體設備的一個或多個表面上，其中壓盤具有于控制真空或壓力源向流體連通的至少兩個或多個口，以及可包括用于操縱微流體設備部分的機械部分，例如，但不限于止回閥。
本發明的另一方面提供用于使用基底用于使彈性材料塊、載體穩定，優選具有一個或多個下面特征井(well)或蓄積槽，其與彈性材料塊通過形成在載體中或使用載體的至少一個通道相流體連通；累積器與彈性材料塊通過形成在載體中或使用載體的至少一個通道相流體連通，以及流體口與彈性材料塊相流體連通，其中流體口對于自動真空或壓力源優選是可訪問的，譬如上述的自動系統，其中自動源進一步包括端口的壓盤，所述端口與流體口相匹配，以形成自動系統之間封閉流體連接，用于將流體壓力或真空施加給彈性材料塊。在具體實施例中，自動源還可實現與相關聯于載體的一個或多個激勵器的流體連通，用于充斥和釋放保持在積累器上的壓力。在具體實施例中，載體可進一步包括定位在接觸微流體設備的載體區域中的區域，其中區域有不同于載體另一部分的材料制造，被選擇用于改進熱傳導和散布參數的區域材料不同于載體的其他部分。用于改進熱傳導和散布參數的優選材料包括，但不限于硅，優選地硅被高度拋光，例如在半導體場中可利用的硅類型，如從晶片切割拋光晶片或部分，例如芯片(芯片)。
本發明的另一方面提供用于使用熱源，例如，但不限于PCR熱循環器，其可從其原始制造狀態被改變，熱源具有可以匹配載體部分的熱調節部分，優選地，載體的熱傳導和散布部分用于對彈性塊載體提供通過熱傳導和散布部分的熱控制。在優選實施例中，通過將真空源應用至被形成在熱源的熱調節部分內一個或多個通道，改進熱接觸，其中通道被形成以接觸載體的熱傳導和散布部分的表面，以施加吸引和保持載體的熱傳導和散布部分的位置。在優選實施例中，載體的熱傳導和散布部分沒有實際與載體相接觸，而是與載體和彈性材料塊相關聯，通過僅僅將熱傳導和散布部分粘結至彈性材料塊，以及剩下圍繞熱傳導和散布部分中邊沿的間隙，以減小由載體引起的寄生熱效應。應當理解的是，在這里所述的本發明的許多方面中，優選彈性材料塊可能被取代，使用在這里沒有描述的現有技術的任意已知的微流體設備，例如由美國加利福尼亞圣克拉拉的Affymetrix(R)或由美國加利福尼亞芒廷維尤的Caliper所制造的設備例如GeneChip(R)(基因芯片)。受讓給Soane、Parce、Fodor、Wilding、Ekstrom、Quake或Unger的美國專利描述微流體或中等規模流體設備，所述設備可被取代本發明的彈性材料塊以利用熱優點和改進，例如吸引定位，減少至流體設備的其他區域的寄生熱傳遞，這在上面使用彈性材料塊的上下文中被描述。
B.示例設計和用途 圖1A提供一種示例矩陣設備的圖示。這種設備100包括七個垂直流動通道102和七個水平直流動通道104，它們交叉形成49個不同交叉或反應點106的陣列。這種具體設備因此使七種樣本能夠與其中七種不同試劑或套試劑起反應。在垂直方向中調節溶液流量的列閥門110可以由控制通道118控制，所述控制通道118可以在單一入口114處被全部激勵。
類似地，行閥門108調節水平方向中的溶液流量；這些由控制通道116所控制，所述控制通道116由單一控制入口112所激勵。如圖1A所顯示，調節行閥門108的控制通道116取決于位置在寬度上變化。在控制通道116交叉垂直流動通道102時，控制通道116是足夠窄的，以使在它被激勵時它不會偏轉入垂直流動通道102，從而基本上減少貫穿其中的溶液流量。然而，控制通道116的寬度在它重疊水平流動通道104時被增加；這使控制通道的膈膜足夠大以阻塞穿過水平流動通道104的溶液流動。
在操作中，試劑R1-R7被引入它們各自的水平流動通道104和樣本S1-S7被噴射入它們各自的垂直流動通道102。在各個水平流動通道104中的試劑因此與在各個垂直流動通道102樣本在交叉106處混合，所述交叉106在具體設備中為井或腔的形狀。因此，在核酸擴增反應的具體情況中，例如，擴增反應必需的試劑被導入各個水平流動通道104。不同核酸模板被導入垂直流動通道102。在某些分析中，被導入作為試劑混合物部分的引物(primer)可能在流動通道之間不同，所述試劑混合物被導入各個水平流動通道104中。這使將起反應的各個核酸模板具有大量不同引物。
圖1B-E顯示圖1A中所述設備中的鄰近反應點的放大平面圖，以更具體地說明設備如何在分析中操作。用于簡明目的，沒有顯示反應孔形式的交叉106，以及控制通道116、118被省略，僅僅行及列閥門110、108被顯示(矩形盒子)。如圖1B中所示，通過閉合列閥門110和打開行閥門108開始分析，以允許溶液流過水平流動通道104，同時阻塞流過垂直流動通道102。試劑R1然后被導入水平流動通道104進而完全流過水平流動通道104的長度，以使所有反應點106被填充。通過外部泵可以得到穿過水平流動通道104的溶液流，但是更典型地通過將蠕動泵結合進彈性材料設備自身而得到。如在例如Unger等(2000)Science 288113-116，和PCT公開WO01/01025中中詳細所述的。
一旦R1被導入，則關閉行閥門108及打開列閥門2(見圖1C)。這使樣本S1和S2被導入垂直流動通道102以及流過其各自流動通道。當樣本流過垂直流動通道102時，它們從反應點106排出R1，從而在反應點106剩下樣本。然后，如圖1D中所示，打開行閥門108允許S1和S2散布且與R1混合。因此，在各個交叉點或反應點106區域中獲得樣本和試劑(R1S1和R1S2)的混合物。在使S1和S2與R1散布持續足夠時間之后，所有行及列閥門108、110被閉合以將S1和S2隔離在其各自反應點106之內且阻止S 1和S2的相互混合(參見圖1E)。然后允許混合物起反應，并且通過監測交叉部106或包含交叉部106的交叉形狀區域檢測反應。用于需要加熱的分析(例如，在擴增反應的熱循環中)，設備被放置在加熱器上，并且在加熱同時樣本保持被隔離。
圖1A中所示設備的修改版本顯示在圖1F中。通常結構具有與圖1A中所述的許多類似之處，以及兩圖中的共同部分共用相同參考標記。圖1F中所示的設備150不同之處在于水平流動通道104對被連接到公共入口124。這實質上使用進入入口124的唯一單一注射口，使雙套試劑被導入兩相鄰流動通道。公共入口的使用相對于垂直流動通道102進一步被擴展。在這個具體例子中，使用進入樣本入口120的單一注射口，各個樣本被導入五個垂直流動通道102。因此，使用這個具體設備，實質上有用于樣本和試劑的各個具體組合的十個重復反應。當然，重復反應的數量可以理想地通過改變連接到公共入口120、124的垂直和/或水平流動通道102、104的數量而被改變。
圖1F所示的設備還包括調節控制通道130的分離控制通道入口128和調節控制通道134的另一控制通道入口132，所述控制通道130可被用于支配流向出口132的溶液流，所述控制通道134調節至出口136的溶液流。另外地，設備150結合保護通道138。在具體設計中，保護通道138被形成為控制通道116的部分。如前所述，保護通道138小于行閥門108；因此，保護通道138的隔膜沒有被轉轉進入下面的水平流動通道104中，以使溶液流被中斷。
最后，圖1F中所示設計不同之處在于在水平和垂直流線交叉處的孔中沒有發生反應，而是在交叉自身中。
V.盲道設計 A.概述 利用盲道設計的設備具有具體特點。首先，設備包括一個或多個流動通道，一個或多個盲道從所述一個或多個流動通道分支出來。如上所述，這種通道的末端區域可用作反應點。由重疊流動通道形成的閥門可被激勵以隔離盲道末端處的反應點。閥門提供用于可轉換地隔離反應點的機構。
第二，與盲道相連通的流動通道網絡被配置，以使反應點的所有或大多數可以使用單個或有限數量入口(例如，小于5個或小于10個)來填充。填充盲流動通道的能力是可能實現的，因為所述設備由彈性材料制造。彈性材料是足夠多孔的，以使當溶液被導入通道時流動通道和盲道內的空氣可以通過這些孔逃逸。在其他微流體設備中利用的材料的孔隙缺乏排除了盲道的使用，因為在容也被注入時如果在沿流體路徑某處沒有提供通孔則盲道中的空氣不再溢出。
第三特點在于，在反應點內制造期間，一個或多個試劑被非共價地沉積在彈性體的地層上(見下文的關于制造工藝的另外細節)。試劑被非共價地粘附，因為試劑被設計以在樣本被導入反應點時被溶解。為了使分析數量最大化，不同試劑或成套試劑被沉積在各個不同反應點處。
設計具體盲道設備，以使反應點以陣列形式被布置。
因此，在被設計用于實施核算擴增反應的那些盲道設備中，例如，實施擴展反應所需要的一個或多個試劑在該設備被制造期間被沉積在各個反應點處。這種試劑包括例如下面的一些或全部引物、聚合酶、核苷、輔助因子、金屬離子、緩沖劑、添加的染料等。為了使高吞吐量最大化，被選擇擴增DNA中不同區域的不同引物被沉積在各個反應點。因此，當核酸模板經由入口被導入反應點時，大量擴展反應可以在模板的不同區段處被執行。通過將設備放置在熱循環板上和在各種所要求溫度之間循環設備，可以完成必須用于擴增反應的熱循環。
可以以各種方法穩定試劑。例如在一些例子中，一種或多種試劑被非共價地沉積在反應點，而在另外例子中，一個或多個試劑被共價地在反應點粘附到基底。如果被共價粘接，試劑可被經由鏈接物(linker)鏈接至基底。各種鏈接物型號可以被利用，例如光化學/對光不安定的鏈接物、對熱不安定連接物以及可由酶化作用裂開的鏈接物。某些鏈接物是雙功能的(也就是，鏈接物包含在各端的功能基團，其與被定位在鏈接物將被附著的元素上基團是有反應的)；在各端的功能基團可以是相同的或不同的。在某些測定中可以被使用的合適鏈接物的例子包括直鏈或支鏈碳鏈接物、雜環鏈接物和肽鏈接物。各種型號鏈接物是可以從Rockford，Illinois(伊利諾斯州羅克福德)的Pierce Chemical Company得到，并且被描述在EPA188256；US專利No.4671958、4659839、4414148、4669784、4680338、4569789和4589071，并且由Eggenweiler，H.M，Pharmaceutical AgentDiscovery Today 1998，3，552所描述。NVOC(6硝基藜蘆氧基碳酰基)鏈接物和其它NOVC相關鏈接物是合適的光化學鏈接物的例子(見，例如WO90/15070和WO92/10092)。例如在US5382513中討論了具有蛋白酶劈裂點的肽。
圖2是一種利用盲道設計的示例設備的簡化平面圖。設備200包括形成在彈性材料基底202中的流動通道204和從那里分支的一套分支流動通道206。各個分支流動通道206終止于反應點208，從而形成反應點陣列。重疊分支流動通道206的是控制通道210，其由隔膜212與分支流動通道206相分離。對控制通道210的激勵使隔膜212偏轉入分支流動通道206(也就是起到閥門的作用)，從而使各個反應點208與其余反應點相分離。
這種設備的操作包括將測試樣本注入流動通道204，然后溶液流入各個分支通道206。一旦樣本填充各個分支通道206，則激勵控制通道210引起閥門/隔膜212啟動以偏轉入分之同道206，從而封閉各個反應點208。當樣本流入和保持在反應點208時，它溶解預先被點樣在各個反應點208的試劑。一旦被溶解，則試劑可與樣本起反應。閥門212通過擴散防止在各個反應點208溶解的試劑互相混合。在樣本和試劑之間反應然后被檢測到，典型地在反應點208內。反應可以優選被加熱，如在下文的溫度控制部中所述的。
圖3A顯示某種程度更復雜盲流通通道設計的例子。在這個具體設計300中，各個水平流動通道304套在其末端被連接直兩個垂直流動通道302。多個分支流動通道306從各個水平流動通道304伸展出去。在這個具體設計的分支流動通道304是隔行交替的，以使附連到任意給定水平流動通道304的分支流動通道306被定位在被直接連接到相鄰水平流動通道304的兩個分支通道306之間，或者被定位在直接連接到相鄰流動通道304的分支流動通道306和一個垂直流動通道302之間。當使用圖3A所述的設計時，各個分支流動通道306終止于反應點308。還與圖3A中所示設計相一致，控制通道310重疊各個分支通道且與下面分支通道由隔膜312相隔離。在端口316處啟動控制通道。垂直和水平流動通道302、304相交叉，以使樣本對入口314的諸如允許溶液流過水平和垂直流動通道網絡，并且最終經由分支流動通道306進入各個反應點308。
因此，在操作中，樣本被注入入口以將溶液導入各個反應點。一旦反應點被填充，則通過在端口擠壓控制通道啟動閥門/隔膜以將溶液俘獲在反應點內。預先沉積在反應點的試劑被重新懸浮在反應點內，從而允許在沉積試劑和樣本之間的反應在各個反應點內。反應點內的反應由檢測器來監控。再者，反應可優選地可控制加熱的，根據在下面溫度控制部中所闡述的方法。
在圖3A中顯示的通常設計的更復雜的復制品被顯示在圖3B中。圖3B中所示設備是一種圖3A中所示的水平和分支流動通道302的單元組織被重復多次的設備。圖3B中所示設備進一步顯示了保護通道320在將被使用在涉及加熱(例如，熱循環)的應用中的這些設備的包含。保護通道320相對于流動通道304和分支通道306的示例定位以在圖3B右平面中所述的擴增視圖被顯示。保護通道320重疊分支流動通道306和反應點308。如上所述，在對設備300的加熱期間水流過保護通道320，以增加設備中水的局部濃度，從而減少從流動通道306和反應點308中的溶液中水的蒸發。
在這部分開始論述的盲通道設備的特征使設備的痕跡最小化，以及使大量反應點將被形成在設備上以及用于將被獲得高密度。例如具有2500個反應點的這種類型的設備可被容易地制造以裝配在標準顯微鏡玻片上(25mm×75mm)前述特征還能夠使用利用盲道設計的設備獲得反應點中的非常高的密度。例如，可以輕易地獲得至少50、60、70、80、90或100個反應點/cm2的密度或在其間的任意整數密度值。然后，具體設備具有更高密度范圍，例如在100至4000個反應點/cm2，或在其間的任意整數密度值。例如，一些設備具有100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個反應點/cm2的密度。也可以獲得具有至少2000、3000或4000個反應點/cm2的非常高密度的設備。這種高密度直接轉變為設備上的非常多的反應點。利用盲道結構的設備典型地具有至少10-100反應點，或者在其間的任意整數點。更具體地，設備具有至少100-1000反應點，或者在其間的任意整數點。較高密度設備可以具有更多反應點，例如至少1000-10000反應點，或者在其間的任意整數點。因此，取決于設備的整個尺寸，具體設備具有至少100；500；1000；2000；3000；4000；5000；6000；7000；8000；9000；10000；20000；30000；40000；50000或100000反應點。
大量反應點和可以得到的密度還是制造非常小的井(well)或腔的能力的結果。例如，腔或井典型地具有小于50nL的容積；在另外例子中，小于40nL、30nL、20nL或10nL；以及在又一例子中，小于5nL或1nL。作為具體例子，具體設備具有300微米長、300微米寬和10微米深的井。
在這里提供的盲道設備可以利用具體設計特征和在PCT申請PCT/US01/44549(公告為WO02/43615)和PCT/US02/10875(公告為WO02/082047)中所述的方法論，包括例如用于填充死端通道、液體起動(priming)、壓縮除氣起動的手段，以及用于在微流體通道的填充期間置換氣體的各種手段。這兩個PCT公開在此通過標準以其全文被結合用于所有目的。
VI.混合設計 又一設備使矩陣和盲填充設計的混合體。這種類型設備的設計類似于圖3A中所示的盲道設備，除了各個水平流動通道被連接到其自身樣本入口和水平流動通道經由垂直流動通道沒有相互連接之外。因此，導入任意給定水平流動通道的樣本僅僅填充水平流動通道和附連到那里的反應點。然而，在圖3A所示的盲流動通道中，樣本可經由垂直流動通道302在水平流動通道304之間流動。
這種通常設備的設備例子被顯示在圖4中。設備400包括多個水平流動通道404，各個水平流動通道具有從它或自身樣本入口414伸展的多個分支流動通道406。控制通道410重疊各個分支流動通道406，并且膈膜(閥門)412將控制通道410與下面分支流動通道406分離。當使用盲流動通道設計時，在入口416對控制通道的起動引起使膈膜412偏轉向分支流動通道406，以及隔離反應點408。在這種設計的變化中，各個水平流動通道404可包括在各端的入口414，從而允許從兩端導入樣本。
在一些例子中，試劑在設備制造期間被沉積在反應點。在相當多的反應狀況下，這使大量樣本以短時間被測試，無需如矩陣設備所要求的試劑額外的時間消耗。可替換地，在注射在芯片之前可以制備反應混合物。一旦注入混合物，它們可以被分析或進一步處理(例如，被加熱)。
通過將不同樣本注入各個水平流動通道，大量樣本可以被快速分析。假定試劑已經被預先沉積在反應點。與任意給定水平流動通道相關聯的在各個反應點處相同試劑存在提供了容易的方法，以使用各個通道實施大量重復反應。如果替換，則在反應點處的試劑不同于任意給定的流動通道，然后各個樣本實質上同時接受各種不同反應條件。
因此，這里提供的設備被調整用于各種不同類型的研究。如果研究包括在用戶控制條件下相當多的不同樣本的篩選(例如，100樣本對100種用戶選擇試劑)，則矩陣設備提供有用的溶液。然而如果研究包括對一種或有限數量樣本在大量反應條件下的分析(例如，一個樣本對10000個反應條件)，則盲道設計是有用的。最后，如果人們針對限定反應條件想檢驗相當多數量樣本，不必注入試劑(例如，100樣本對100種預先限定的試劑)，則混合設備是有用的。
VII.溫度控制 A.設備和部件 大量不同選擇的變化復雜度(sophistication)是可以利用的，用于控制微流體設備或整個設備中選擇區域內的溫度。因此，如這里所使用的，術語溫度控制器被廣泛地意味著指代可以調節整個微流體設備或微流體設備部分內的溫度的設備或部件(例如，在具體溫度區域內或在盲道型微流體設備矩陣中的一個或多個連接點處)。
通常地，將該設備放置在熱循環板上以熱循環該設備。大量這種板是容易通過商業渠道可以得到的，包括例如ThermoHybaid Px2(Franklin，MA)，MJ Research PTC-200(South San Francisco，CA)，Eppendorf Part#E5331(Westbury，NY)，Techne Part#205330(Princeton，NJ)。
陣列設備與熱控制設備相接觸，以致于熱控制設備與熱控制源相連通，以使至少一個反應腔中的反應溫度隋若控制源溫度的改變而改變。
在不同實施例中，熱傳遞設備可以包括例如硅的半導體，可以包括反射材料和/或可以包括金屬。
熱控制設備可以適于將作用力施加給熱傳遞設備以將熱傳遞設備推向熱控制源。作用力在不同實施例中可以包括磁的、靜電的或真空作用力。例如，在一個實施例中，作用力包括通過通道施加向熱傳遞設備的真空作用力，所述通道形成在熱控制設備或熱傳遞設備的表面。在熱控制設備的表面和熱傳遞設備的表面之間得到的真空度可以被檢測到。這種檢測可以使用真空度檢測器被執行，所述真空度檢測器被定位在沿通道的位置或遠離真空源位置的通道處。在真空沒有超過預先設定值時，可以顯示警報或可以符合重新排列協議。
陣列設備可以與熱控制設備相接觸，通過一個或多個機械或電機械定位設備的使用。該方法的執行可以是自動控制的和監控的。例如，這種自動控制和監控可以使用自動控制系統來執行，所述自動控制系統可操作的與機器人控制系統相通訊，用于引入熱控制設備或從熱控制設備去除陣列設備。還可以監控反應的進程。
可以提供包括熱控制設備的單元。可以提供包括陣列設備和熱控制設備的系統。
為了確保熱循環步驟的精確度，在具體設備中，有用的是將檢測溫度的傳感器結合在設備的各個區域處。用于檢測溫度的一種結構是熱電偶。這種熱點偶可能如圖案化在下面基底材料上的薄膜導線或者如直接結合進微制造彈性材料自身的導線一樣被制造。
還可以通過電阻變化來檢測溫度。例如，熱電阻器中的電阻變化可以被校準為給定的溫度變化，利用常規技術可將所述熱電阻器制造在下面半導體基底上。可替換地，熱電阻器可能被直接插入微制造彈性材料。通過電阻檢測溫度的另一方案被描述在Wu等“MEMS Flow Sensors forNano-fluidic Applications”，Sensors and Actuators A89152-158(2001)，該文因此通過引用以其全文被結合。這篇論文描述了摻雜多晶硅結構對控制和檢測溫度的用途。用于多晶硅和其它半導體材料，電阻的溫度系數可以通過特性和雜質數量精確控制，從而優化用于給定應用的傳感器的性能。
熱色(thermochromatic)材料是可用于檢測擴增設備中區域上溫度的另一類型結構。尤其是，具體材料當其經過不同溫度時動態地和可再生地改變顏色。這種材料在其經過不同溫度時可能被添加至溶液。熱色材料可以被形成在下面基底上或被結合在彈性材料內。可替換地，熱色材料可以顆粒形式被添加至樣本溶液。
檢測溫度的另一方法是通過紅外照相機的使用。與顯微鏡連接的紅外照相機可被用于確定整個擴增結構的溫度曲線。彈性體材料對射線的滲透將會有助于這樣分析。
檢測溫度的另一方法是通過熱電物質的使用。尤其是，某些水晶材料，具體地這些材料還展示壓電行為，展示壓電效應。這種效應描述了材料晶體點陣的極化以及材料兩端電壓高度依賴于溫度的現象。這種材料可被結合在基底或彈性體上，以及被用于檢測溫度。
其它電現象，例如電容和電感，根據本發明的實施例可被展示以檢測溫度。
B.精確熱循環的校驗 如在下文制造部分詳細所描述的，盲道設備具有基底層，試劑被放置在所述基底層上。包括包含流動通道和控制通道的兩層的結構被重疊在基底層上，以使流動通道與沉積試劑相對齊。然后將基底層的外側放置在基底(例如玻璃)上。通常，反應在其上發生的反應點為在基底/玻璃界面上面的大約100-150微米。使用已知熱擴散率方程及設備中所使用的彈性體和玻璃的近似值，人們可計算在反應點內溫度到達控制器試圖保持的溫度所要求的時間。在表1中示出的計算出的數值說明可以快速達到溫度，即使使用比反應點為近似100-150微米的設備中所使用的厚許多的彈性體和玻璃(也就是，用于這里所述設備的典型距離)。
表1計算出的在指示時間處通過PDMS和玻璃層的熱擴散長度。
圖5顯示使用盲道設備到達理想溫度的速度。
在另一實施例中，通過使用具有已知溶解溫度(tm)的雙旋低聚核苷酸聚合物可以測量溫度，其中可將其內部對照指示低聚核苷酸是否是雜交的或變性的內部對照染色劑(例如SYBR Green(TM)或溴化乙錠)用于確定各個腔體在陣列上是恒定的范圍，其中通過將包含帶有染色劑的低聚核苷酸的溶液導入微流體設備的腔體，所述微流體設備的腔體具有反應腔陣列。在這個實施例中，當溫度升高到溶解溫度之上時，內部對照染色劑將其對低聚核苷酸的關系變性(denataturation應為denaturation)改變為單線低聚核苷酸。可替換地，如果溫度高于tm或被降低，則染料進入現有淬光低聚核苷酸的內部對照可以被監測。實質上染料的使用提供用于“低聚核苷酸溫度計”，所述“低聚核苷酸溫度計”相應于相對低聚核苷酸的溶解溫度的溫度改變而改變特性，例如熒光性。通過設計或使用選擇的溶解溫度的低聚核苷酸，以類似方式可以確定反應腔陣列改變溫度的范圍。
VIII.檢測 A.概述 在這里提供的微流體設備可以利用大量不同監測手段。對合適系統的選擇部分上是關于被選擇的事件和/或試劑的類型的信息。可以設計檢測器以檢測大量不同信號類型，包括但不限于來自放射性同位元素、熒光基團、發色團、電子密顆粒、磁顆粒、自旋標示、發射化學螢光的分子、電化學活性分子、酶、輔助因數、連接到核酸探針和酶基底的酶的信號。
適于本發明微流體設備使用的圖示的檢測技術包括但不限于光散射、多通道熒光檢測、UV和可見波長吸收、冷光、不同反射率和共焦激光掃描。在具體應用中可以使用的另外檢測方法包括閃爍接近測定技術、輻射化學檢測、熒光極化、熒光關聯能譜法(FCS)、時間分辨能量轉移(TRET)、熒光諧振能量轉移(FRET)和例如生物熒光諧振能量轉移(BRET)的變型。另外的檢測選擇包括電阻、電阻率、阻抗和電壓檢測。
檢測發生在“檢測部分”或“檢測區域”。這些術語和其它相關術語指代發生檢測的微流體設備部分。如上所指示，使用利用盲道設計的設備，檢測部分通常是如由與各個反應點相關聯閥門所隔離的反應點。用于基于矩陣的設備的檢測部分通常在鄰近交叉點的流動通道的區域、交叉點自身或包圍交叉點的區域和圍繞區域內。
檢測部分可以與一個或多個顯微鏡、光激勵設備(例如激光器)、光倍增管、處理器及前述的組合相連接，它們合作檢測與具體事件和/或試劑相關聯的信號。被檢測的信號經常是光信號，其在檢測部分由光檢測器檢測。光檢測器可包括一個或多個光二極管(例如雪崩二極管)、光纖光導導管，例如光倍增管、顯微鏡和/或攝像機(例如CCD照相機)。
可將檢測器微制造在微流體設備內，或者可以是分離部件。如果檢測器作為分離部件存在且微流體設備包括多個檢測部分，則可在單個檢測部分內在任意給定時刻發生檢測。可替換地，可以使用掃描系統。例如，具體自動系統相對于微流體設備掃描光源；其它系統掃描在檢測上發射的光，或者包括多通道檢測器。作為具體說明的例子，微流體設備可被附連到可轉移平臺上或在顯微鏡目鏡下被掃描。所要求的信號然后被傳遞給處理器，用于信號解釋和處理。還可以利用光倍增管陣列。另外，可以利用具有從所有不同檢測部分同時收集信號且同時根據各個部分確定信號能力的光學系統。
外部檢測器是有用的，因為提供的設備完全或大范圍上由在被檢測波長處是光透明的材料制造。這個特點使這里所述設備使用大量光檢測系統，常規基于硅的微流體設備使用所述光檢測系統是不可能的。
具體優選檢測器使用CCD照相機和提供用于大視場和高數值孔徑的光路，以使從各個反應腔收集的光數量最大化。關于這一點，CCD被用作光檢測器陣列，其中各個象素或象素組對應于反應腔而不是被用于產生陣列圖像。因此，光學器件可以被改變以使圖像品質被降低，或被重新聚焦以增加光學系統景深以從各個反應腔收集更多光線。在優選實施例中，有用的是采用高縱橫比或柱狀腔體，以集中將被檢測器沿光學系統的光軸質詢的樣本，以及優選地通過對圖像重新聚焦以增加景深。低NA透鏡系統的使用，優選使用雙側向對稱(symetrical)透鏡系統。同樣有用的是使用檢測器設備，例如一個或更多CCD設備，其具有將被成像的彈性塊面積的尺寸或大于將被成像的彈性塊面積。在低NA光學器件中相連的使用中，可以實現改進的檢測靈敏度。
檢測器可包括用于激發指示器的光源，所述指示器產生可檢測的信號。所使用的光源類型部分取決于被激發的指示器的類型。合適的光源包括，但不限于激光器、激光二極管和高密度燈。如果使用激光器，可以使用激光器掃描一套檢測部分或單個檢測部分。激光二極管可被制造在微流體設備自身上。可替換地，激光二極管可被制造在鄰近被使用的微流體設備而放置的另一設備中，以實施熱循環反應，以致于來自二極管的激光被指向進入檢測部分。
檢測部分可另外包括大量非光學方法。例如，檢測器還可包括，例如溫度傳感器、導電傳感器、電勢測定傳感器(例如pH電極)和/或電流測定傳感器(例如，監測氧化和減少反應)。
大量在市場上可以買到的外部傳感器可以被使用。其中許多為熒光檢測器，因為容易制備熒光標示試劑。可以得到的檢測器的具體例子包括但不限于Applied Precision ArrayWoRx(Applied Precision Issaquah，WA)。
B.對擴增的核酸的檢測 1.嵌入染料(intercalation dye) 在粘合至雙旋DNA上僅僅發熒光的具體嵌入染料可被用于檢測雙旋擴增DNA。適合染料的例子包括但不限于SYBRTM和Picro Green(從OR，Eugene的Molecure Probe有限公司)、溴化乙錠、亞丙基、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-1、Yoy-1和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚氫氯化物)(4′，6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride)。涉及嵌入染料使用的另外論述由Zhu等于Anal.Chem.661941-1948(1994)提供其通過引用起全文被結合。
2.基于FRET的檢測方法 這種類型的檢測方法包括在施主/受主熒光團對中檢測來自施主(指示劑)和/或受主(猝光劑)熒光團的熒光變化。選擇施主/受主熒光團對以使施主的發射譜重疊受主的激發譜。因此，當熒光團對充分進入互相靠近時，可發生從施主至受主的能量轉移。這種能量轉移可以被檢測到。
FRET和模板擴展反應。這些方法通常利用使用施主/受主對中一個元素標示的引物(primer)和使用施主/受主對中另一個元素標示的核苷酸。在模板依賴擴展反應期間在將標示的核苷酸進合金引物之前，施主和受主被間隔開足夠遠以使不能發生能量轉移。然而，如果標示的核苷酸被結合進引物以及空間足夠低靠近，則能量轉移發生且能被檢測到。這些方法對單核苷酸多態性的檢測中實施單基底對擴展反應尤其是有用(見下文)，以及被描述在US專利No.5945283核PCT公開WO97/22719。
定量PT-PCR。各種所謂“實時擴增”方法或“實時定量PCR”方法還可被用于檢測存在于樣本中的目標核酸數量，通過在擴增過程自身期間或之后測量擴增產物的數量。熒光團(fluorogenic)核酸酶測定是實時定量方法的一個具體例子，所述方法可被連續使用這里所述的設備。監測擴增產物形成的這種方法包括使用雙標示熒光團低聚核苷酸探針對PCR產物累積的持續測量——經常在文獻中被稱為“TaqMan”方法的途徑。
在這種測定中使用的探針典型地是短(ca.20-25基數)多聚核苷酸(polynucleotide)，其使用兩個不同熒光團染料被標示。探針的5′終端典型地被附連到指示器染料，以及3′終端被附連到淬光染料(quenching dye)，盡管染料也可被附連到探針的其它位置。設計探針，以至少具有與在目標核酸上探針結合點的真正序列互補。在反應混合物中還包括上游核下游的PCR引物，所述PCR引物備年接到與探針結合點成側面的區域。
在未觸動探針時，在兩個熒光體之間發生能量轉移，以及猝光劑(quencher)對來自指示器的發射猝光。在PCR的擴展階段期間，通過例如Taq核酸酶的核酸聚合酶的5′核酸酶活性穿過探針，從而從多聚核苷酸猝光劑中釋放指示劑，從而導致可由合適檢測器測量的指示劑發射濃度的增加。
專門適用于測量如在熒光測定中產生的熒光團發射例的一種檢測器是ABI 7700，其由Foster City，CA的Applied Biosystems有限公司制造。該儀器所使用的計算機軟件能夠記錄指示劑的熒光基團濃度，并在擴增過程中淬光。然后，這些被記錄的數值可被用于計算在連續基礎上標準指示劑發射濃度的增加，以及最終統計被擴增的mRNA數量。
關于用于實時確定擴增產物的濃度熒光團的理論劑操作的另外細節被描述，例如在授予Gelfand的US專利No.5210015、授予Livak等的US專利No.5538848、授予Haaland的US專利No.5863736以及Heid，C.A.等的Genome Research，6986-994(1996)；Gibson，U.E.M等的GenomeResearch，6995-1001(1996)；Holland，P.M等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA887276-7280，(1991)；以及Livak，K.J.等的PCR Methods and Applications357-362(1995)，其各個通過引用其全文被結合。
因此，因擴增反應過程，增加的染料數量受到限制，并且由信號中伴隨的增加而被相伴。
還可以以不同途徑使用例如上述的相互對照染料，以定量化PCR方法。如上所述，這些染料選優結合至雙旋DNA(例如，SYBR GREEN)，進而僅僅在限制之后產生信號。因此，當擴增反應進行時，染料的增加數量被限制，以及由可被檢測的信號中伴隨的增加而被相伴。
分子標記使用分子標記，探針構造的改變當其雜交至擴增產物的互補區域時導致可檢測信號的形成。探針自身包括兩部分在5′端處的一部分和在3′端處的另一部分。這些部分在對探針結合點淬火的探針部分的側面，并且彼此是互補的。一末端部典型地被附連至指示劑染料，以及其余端部分被通常附連到淬光劑染料。
在溶液中，兩端部可以互相雜交以形成發夾環(hairpin loop)，在這種構造中，指示劑和淬光劑染料處于足夠接近中，以使來自指示劑染料的熒光團由淬光劑染料有效地被淬光。相對比地，雜交探針產生線性構造，在所述構造中，淬光程度被降低。因此，通過監控兩種染料的發射變化，可能的是間接監控擴增產物的形成。這種類型探針及其使用的方法被進一步描述，例如，通過Piatek，A.S.等的Nat.Biotechnol.16359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F.R，Nature Biotechnology 14303-308(1996)；以及Tyagi，S等的Nat.Biotechnol.1649-53(1998)，其各個在這里通過以其全文用于所有目的的引用而被結合。
侵入物(invader)侵入物測定(第三波技術(Third WaveTechnologies/Madison，WI))被用于SNP基因定型和使用低聚核苷酸，指定信號探針，所述信號探針對目標核酸(DNA或RNA)或多形性點是互補的。第二低聚核苷酸，指定低聚侵入物，包含相同的5′核苷酸序列，但3′核苷酸序列包括核苷酸多形性(polymorphism)。低聚侵入物干涉信號探針至目標核酸的結合，以使信號探針的5′端在包含多形性的核苷酸處形成“片狀物(flap)”。這種復合體由結構指定核酸內切酶(endonuclease)所確認，稱為可分裂性酶制劑(cleavase enzyme)。可分裂性酶分裂核苷酸的5′片狀物。釋放的片狀物與接收FRET標示的第三探針結合，從而形成由可分裂性酶制劑所確認的另一雙結構。這次，可分裂性酶制劑分裂遠離淬光劑的熒光團，進而產生熒光信號。用于SNP基因定型，信號探針將被設計以與基準(野生型)等位基因或變形(突變型)等位基因相雜交。與PCR不一樣，有信號的線性擴增，所述擴增沒有核酸的擴增。進一步細節足以引導本領域技術人員通過例如Neri，B.P.等Advances in Nucleic Acidand Protein Analysis 3826117-125，2000而提供。
Nasba基于核酸序列的擴增(NASBA)是使用RNA作為檢測模板的檢測方法。對RNA的引物互補包含用于T7啟動子點(promoter site)的序列這個引物允許與模板RNA和添加的逆轉錄酶(reverse transcriptase)(RT)相結合，以產生從3′至5′的互補旋轉。隨后RNase H被添加，以消化掉RNA，剩下單旋cDNA。然后，引物的第二版可結合單選cDNA和制造雙旋cDNA。添加T7RNA聚合酶，以通過第一引物從被結合進cDNA序列的T7促進劑點產生更多版的RNA。提及的所有酶能夠在41℃處起作用(參見，例如Compton，J.Nucleic Acid Sequence-basedAmplification，Nature 35091-91，1991)。
Scorpion。這種方法例如由Thelwell N等的Nucleice Acids Research，283752-3761，2000所描述，因此其通過引用其全文用于所有目的被結合，以及圖20描繪了其方案，其中Scorpion探針機制如下。步驟1目標和Scorpion主干序列的初始變性。步驟2將Scorpion引物退火至目標。步驟3延長Scorpion引物產生雙鏈DNA。步驟4變性步驟3中產生的雙鏈DNA。這產生附著Scorpion引物的單鏈目標分子。步驟5通過冷卻，Scorpion探針序列以分子內的方式結合至其目標。由于互補目標鏈的分子間結合這是具有優勢的。Scorpion(如圖24所示)包含容納在由探針的3′和5′側上互補的主干序列形成的發夾環內的特殊探針序列。附著于5′末端的熒光基團被連接至環的3′末端的部分(通常甲基紅)猝滅。發夾環通過PCR終止序列(止動裝置)連結至引物的5′末端。當引物在PCR擴增過程中延伸后，特異性探針序列能夠在DNA的相同鏈內結合至它的互補序列。該雜交事件打開發夾環因此熒光基團不再被猝滅以及可觀察到信號的增加。PCR終止序列防止通讀，該通讀可能導致發夾環在缺乏特異性目標序列的情況下打開。這種通讀將導致檢測非特異性PCR產物，例如，引物二聚物或引導錯誤事件。
3.容性DNA檢測 DNA濃度和電容改變之間具有線性關系，該電容改變由跨越1khz電場的核酸通道引起。已發現這種關系是不依賴物種的。(見，例如Sohn，等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9710687-10690)。這樣，在某些設備中，流動通道內的核酸(例如，圖1的幾乎環形的流動通道或圖2的反應腔)經受這樣的場以確定擴增產物的濃度。可代替地，包含擴增產物的溶液被取出以及然后經受這樣的電場。
IX.實施反應的合成物的成分 此處披露的由微流體設備進行的反應典型地由某些添加劑實施以增強反應。因此，例如，在反映物沉積在其內的設備的例子中，這些添加劑可在例如反應部位被一種或更多試劑污染。一套添加劑為封閉彈性材料基質上蛋白結合位點的封閉試劑。很多種這樣的合成物可以被使用包含多種不同蛋白(例如，凝膠和各種清蛋白，例如牛血清清蛋白)和甘油。
洗滌劑添加劑也可以是有用的。可以使用多種不同洗滌劑中的任何洗滌劑。例子包含，但不局限于SDS和各種Triton洗滌劑。
在核酸擴增反應的特異例子中，可以包含多種不同類型添加劑。一種是促進擴增反應的增強劑。這樣的添加劑包含但不局限于減少核酸內二級結構的試劑(例如，三甲銨乙內酯)、和減少錯誤引導事件的試劑(例如，四甲基銨氯化物)。
還發現在某些擴增反應的進行中某些多聚物酶增強效果。例如，雖然使用來自Thermus aquaticus(Applied Biosystems，Foster city,CA)的AmpliTaq Gold聚合酶獲得良好效果，在某些情況下使用Finnzyme，Espoo，Finland的DyNAzyme聚合酶獲得改善的反應。該聚合酶來自嗜熱菌，Thermus brockianus。其它可被使用的范例的多聚酶包含但不局限于rTH多聚酶XL，其為Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)、嗜超熱原始細菌pyrosoccus woesei(Pwo)和Tgo DNA多聚酶的結合。在反應混合物中合并兩種或更多多聚物酶對增加PCR反應的準確度或敏感度是有用的。其它試劑例如DMSO的加入尤其那些包含內部對照染料者加入至PCR混合物中可進一步輔助實施反應。使用甘油或PEG溶液用于對照列液體也可改善PCR反應的實施。
關于添加劑在應用此處披露的某些設備進行反應包含核酸擴增反應中是有用的的其它細節，在下文例1中提供。
X.應用范例 由于此處提供的微流體設備可被制造為包含巨大數量的反應部位，該設備在非常多種篩選和分析方法中是有用的。通常，該設備可用于檢測發生反應以產生可檢測信號的種之間的反應，或一旦和另一物種相互作用產生可檢測信號的產物。考慮到它們在各種類型溫度控制系統下的使用，設備也可被用在多個不同類型的需要溫度控制的分析或反應中。
A.核酸擴增反應 此處披露的設備主要可被用于進行任何類型核酸擴增反應。因此，例如，擴增反應可以是線性擴增，(使用單一引物擴增)，和指數擴增(即，由前向和逆向引物集實施的擴增)。
當使用盲通道類型設備實施核酸擴增反應時，典型地沉積在反應部位內的試劑是那些實施所需類型擴增反應必須的試劑。通常這意味著以下物質的某些或全部是沉積的例如引物、多聚酶、核苷酸、金屬離子、緩沖液、和協同因子。在這樣的例子中引導進入反應部位的樣本是核酸模板。然而可替換的，模板可以被沉積以及擴增試劑流入反應部位。如以上討論的，當矩陣設備用于進行擴增反應時，包含核酸模板的樣本通過垂直流動通道流動以及擴增試劑通過水平流動通道或反之亦然。
雖然PCR可能是最佳公知擴增技術，該設備不局限于進行PCR擴增。其它類型可被實施的擴增反應包含但不局限于(i)連接酶鏈反應(LCR)(見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)和Landegren等，Science2411077(1988))；(ii)轉錄擴增(見Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861173(1989))；(iii)自身維持的序列復制(即Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))；和(iv)基于核酸的序列擴增(NASBA)(見，Sooknanan，R和Malek，L，BioTechnology13563-65(1995))。每一前述參考以它們的整體為了所有目的在此通過參考被結合。
使用任何以上描述的用于檢測擴增的DNA的檢測方法可以完成對產生的擴增產物的檢測。
B.SNP分析和基因分型 1.概述 很多與或者宿主機體或者感染性機體的基因組更改相關的疾病是少數核苷酸改變的結果，常常包含單個核苷酸的改變。這樣的單個核苷酸的改變指單核甘酸多形態或簡單SNPs，以及SNP產生的位點典型地指多形態的位點。此處描述的設備可用于檢測出現在這樣的多形態位點處的核苷酸的鑒定。作為這種能力的擴展，該設備可用于基因分型分析。基因分型包含確定二倍體有機體(即每一基因具有兩個拷貝的有機體)是否包含參考等位基因的兩個拷貝(參考類型純和體)、每一參考的一個拷貝和一個變異的等位基因(即雜合子)、或包含變異等位基因的兩個拷貝(即變異型純和體)。當進行基因分析分析時，本發明的方法可被用于檢測單一變異位點。然而，如以下多元化部分中進一步描述的，該方法也可用于檢測個體或在同一基因、或不同基因或它們的組合上的多個不同DNA基因座位的基因型。
用于進行基因分型分析的設備設計為使用適當大小的反應部位以從統計學觀點確保二倍體受試者的兩個等位基因中的每一個的拷貝以可工作的DNA濃度出現在反應部位。否則，分析可能產生提示雜和子是純和體的結果，僅僅由于第二等位基因的拷貝沒有出現在反應部位。下面的表2指示了使用此處描述的設備可被使用的以各種示例的DNA濃度出現在1nl反應體積中的基因組拷貝的數目。
表2以指示的DNA濃度出現在1nl體積中的基因組拷貝的數目 通常而言，由于樣本的隨機比例，在擴增反應開始之前出現的拷貝數目決定檢測中的可能錯誤。使用某些設備的基因分型分析典型地以具有大約0.1μg/μL DNA濃度的樣本進行，盡管目前發明者們已以各濃度進行成功的每一反應部位有單一基因組的Taqman反應。
2.方法 基因型分析可以應用各種不同方法進行。在這些方法中，通常獲得“是”或“否”的結果就足夠了，即，檢測只需能夠回答某一等位基因是否存在的問題。因此，僅使用檢測多形態位點可能出現的一個等位基因所必須的引物或核苷酸可進行分析。然而，更典型地，包含檢測多形態位點每一可能的等位基因的出現的引物和核苷酸。以下是合適的方法的例子。
單堿基對延伸(SBPE)反應。SBPE反應是為進行基因分型分析特異性發展起來的一項技術。盡管已發展了數個SBPE反應，總的方法是十分相似的。典型地，這些分析包含將與目標核酸互補的引物進行雜交，這樣引物的3′末端緊密靠近變異位點的5′或與其毗鄰。延伸在存在一個或更多標記的不可延伸核苷酸和多聚酶的情況下進行，所述不可延伸核苷酸與占據變異位點的核苷酸互補。不可延伸核苷酸是核苷酸類似物，它一旦結合進入引物阻止多聚酶作用下的進一步延伸。如果加入的非延伸核苷酸是在變異位點與核苷酸互補的，那么標記的非延伸核苷酸結合至引物的3′末端以產生標記的延伸產物。因此，延伸的引物提供核苷酸出現在目標核酸變異位點的指示。這樣的方法和相關方法例如在美國專利第5,846,710；6,004,744；5,888,819；5,856,092和5,710,028和WO92/16657號中描述。
延伸產物的檢測可使用在上述檢測部分描述的用于延伸反應的FRET檢測方法檢測。這樣，例如，使用此處描述的設備，包含標記的供體/受體熒光基團中一個成員的試劑混合物、一至四種標記的非延伸核苷酸(如果包含多于一種非延伸核苷酸，被不同標記)、和多聚酶被引入(或之前被點樣)至反應部位。然后包含模板DNA的樣本被引入反應部位以允許產生模板延伸。任何形成的延伸產物被FRET信號的形成檢測(見，例如，美國專利第5,945,283和PCT出版物WO97/22719)。可選擇性地使反應熱循環以使用溫度控制方法和以上描述的裝置增加信號。
定量PCR。基因分型分析也可使用更早描述的定量PCR方法進行。在這種情況下，與等位基因形式的每一個互補的不同標記探針被包含作為試劑，還有引物、核苷酸和多聚酶。然而，反應可僅使用單一探針進行，盡管這在是否缺乏信號是由于缺乏特異性等位基因或僅由于反應失敗上能產生含糊。對于典型的雙等位基因的例子，其中對于多形態位點兩個等位基因是可能的，通常在試劑混合物中包含兩者不同標記的探針，每一個都與等位基因之一完美互補，還有擴增引物、核苷酸和多聚酶。包含目標DNA的樣本被引入反應部位。如果探針與其互補的等位基因存在于目標DNA上，那么產生擴增，因而導致如在以上檢測中所述的可檢測信號。基于獲得的不同信號的種類，可確定多形態位點核苷酸的鑒定。如果兩種都被檢測到，那么兩種基因都存在。反應過程中的熱循環如以上溫度控制部分中所述一樣被實施。
B.基因表達分析 1.概述 基因表達分析涉及測定特定細胞中一種或更多基因表達的水平。這種測定可以是定性的，但通常是定量的。在差異性基因表達分析中，一種細胞(例如檢測細胞)中基因水平與另一種細胞(對照細胞)中相同基因表達的水平相比較。可進行非常多種這樣的比較。例子包含但不局限于，健康和患病細胞之間、用一種藥物治療的個體的細胞與另一未治療個體的細胞之間、暴露于特定毒物的細胞和未暴露細胞之間的比較等等。檢測和對照細胞之間表達水平不同的基因可作為標志和/或治療的目標。例如，如果發現某組基因在患病細胞中的上調多于健康細胞，這樣的基因可作為該疾病的標志并可能用作診斷試驗的基礎。這些基因也可成為目標。治療疾病的策略可包含導致上調基因的表達減少的程序。
此處披露的設備的設計對于易化多種基因表達分析是有用的。因為該設備包含巨大數量的反應部位，巨大數量的基因和/或樣本可以同時被檢測。使用盲流動通道設備，例如，可同時檢測數百或數千基因的表達水平。該設備還方便了差異基因表達分析。通過矩陣設計，例如，從健康細胞獲得的樣本可在一個流動通道檢測，而來自患病細胞的樣本在密切靠近的通道進行。該特征增強了檢測的簡便性和結果的準確性，因為該兩樣本在相同時間在相同設備和相同條件下進行。
2.樣本制備和濃度 為了檢測一基因或多個基因的轉錄水平(和從而表達水平)，獲得包含該基因或基因片段的mRNA轉錄產物的核酸樣本或來自mRNA轉錄產物的核酸。來自mRNA轉錄產物的核酸是指對于該核酸的合成而言，mRNA轉錄產物或其序列最終作為模板。這樣從mRNA逆轉錄得到的cDNA、從該cDNA轉錄的RNA、從該cDNA擴增的DNA、從擴增的DNA轉錄的RNA都來自mRNA轉錄產物以及檢測這樣的轉錄產物指示了樣本中原始轉錄產物的存在和/或豐度。這樣，合適的樣本包含但不局限于，基因或多個基因的轉錄產物、從mRNA逆轉錄得到的cDNA、從cDNA轉錄的cRNA、從基因擴增的DNA、從擴增的DNA轉錄的RNA。
在有些方法中，核酸樣本從生物樣本分離的總mRNA；在其它例子中，核酸樣本是來自生物樣本的總RNA。術語“生物樣本”，如此處應用的，指從有機體或從有機體的組分例如細胞、生物組織和液體中得到的樣本。在某些方法中，樣本來自人類患者。這樣的樣本包含唾液、血液、血細胞(例如白細胞)、組織或細針活檢樣本、尿、腹膜的液體、漿膜液或它們的細胞。生物樣本也可包含組織的部分例如取來用于組織學目的的冷凍部分。常常提供兩個樣本用于比較的目的。樣本可以是，例如，來自不同細胞或組織類型、來自不同個體或來自接受不同治療的相同來源樣本(例如藥物治療和對照)。
任何不選擇性反對mRNA分離的RNA分離技術可被用于這樣的RNA樣本的提純。例如，核酸分離和提純的方法在WO97/10365、WO97/27317、Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分第3章、Theory and Nucleic AcidPreparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y.(1993)、Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分中第3章、Theory and Nucleic Acid Preparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y(1993)、和Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring harbor Press，N.Y(1989)、Current Protocols in MolecularBiology，(Ausubel，F.M.等，eds.)John Wiley&Sons，Inc.，New York(1987-1993)中詳細描述。巨大數量的組織樣本可以使用本領域公知的技術容易地處理，包含例如，Chomczynski，P.在美國專利第4,843,155號中描述的單一步驟RNA分離程序。
在使用所述設備的基因表達分析中，影響結果的重要因素是樣本中核酸的濃度。在低拷貝數目時，干擾與拷貝數目的平方根相關。因此，認為可接受的錯誤水平決定了所需拷貝數目。在特定樣本體積中所需的拷貝數目確定了所需DNA的濃度。盡管不一定最佳，定量反應可以用達50％的錯誤水平實施，但優選更低。假設1納升體積，獲得特定錯誤水平所需的DNA濃度如表3所示。如所示的，以微流體設備可工作的濃度，例如通過某些設備使用的1納升體積具有足夠的基因表達產物拷貝數。
表3基因表達&——DNA定量 進一步的計算證實此處提供的使用1nL反應部位的設備中的某些包含足夠的DNA以獲得準確的表達結果。特別地，典型mRNA制備程序產生大約10μg mRNA。已證明典型地在每一細胞中具有每一mRNA的1到10,000個拷貝。在任何特定細胞中表達的mRNA中，大約四個最常見信息包含總mRNA水平的約13％。這樣，這種高表達信息包含1.3μg mRNA(每一個是4×10-12克分子或大約2.4×1012拷貝)。根據前述表達范圍，預期稀有信息以2×10-8拷貝的水平存在。如果在標準分析中mRNA樣本溶解在10μl中，稀有信息的濃度約為2×107拷貝/μl；該濃度對應于每1nl孔20,000拷貝(或4×1011M)。
3.方法 由于表達分析典型地變化定量分析，典型地使用以上描述的定量實時PCR方法中之一完成檢測。這樣，如果使用Taqman方法，引入(或之前點樣)反應部位的試劑可包含以下物質之一或全部引物、標記探針、核苷酸和多聚酶。如果使用嵌入染料，試劑混合物典型地包含以下物質之一或全部引物、核苷酸、多聚酶和嵌入染料。
D.多元化 此處描述的基于陣列的設備(見，例如，圖1A、1F、2、3A、和3B以及伴隨的文本)本質上設計為為了同時實施巨大數量擴增反應。然而這個特點通過在每一反應部位內進行多種分析(例如，基因分型和表達分析)可以容易地進一步擴展。
甚至可在單一反應部位實施多元擴增，通過例如在熱循環過程中使用多種引物，每一種是特定感興趣目標核酸特異性的。不同擴增產物的存在可以使用有差別地標記的探針檢測以進行定量RT-PCR反應或通過使用有差別地標記的分子標志(見上述)。在這樣的方法中，每一有差異地標記的探針設計為只與特定擴增目標雜交。通過明智選擇所使用的不同探針，分析得以進行，其中不同標記在單一反應中在不同波長被激活和/或檢測。關于適用于這樣的方法的適當熒光標記的選擇的進一步指導包含Fluorescence Spectroscopy(Pesce等，Eda.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White等，Fluorescence AnalysisApractical Approach，Marcel Dekker，New York，(1970)；Berlman，handbook of Fluorescence Spectra of AromaticMolecules，第二版，Academic Press，New York，(1971)；Griffiths，Colour andConstitution of Organic Molecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，19723；和Haugland，handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，MolecularProbes，Eugene(1992)。
多種基因分型和表達分析可在每一反應部位可選擇地進行。如果使用定量PCR方法例如TaqMan，那么用于擴增感興趣目標DNA不同區域的引物被包含在單一反應部位內。使用用于每一區域的有差別地標記的探針區別形成的產物。
E.非-核苷酸分析 雖然對進行非常多種核酸分析是有用的，設備也可被用于多種其它用途。如更早提示的，設備可主要被用于分析兩個或更多物種之間的相互反應，所述反應產生可檢測信號或能與可檢測試劑反應的反應產物，該可檢測試劑一旦與反應產物反應可產生信號。
因此，例如，該設備可被用于多個篩選應用以識別具有特定所需活性的檢測試劑。作為特殊的例子，該設備可被用于篩選化合物，篩選其作為一種或更多酶的底物或抑制劑的活性。在這樣的分析中，檢測的化合物和其它必須的酶分析試劑(例如，緩沖液、金屬離子、協同因子和底物)被引入(如果之前未沉積)反應部位內。然后引入酶樣本以及反應(如果檢測化合物是底物)或抑制反應(如果檢測化合物是抑制劑)被檢測。這樣的反應或抑制可通過標準技術完成，例如直接或間接檢測底物的喪失和/或產物的出現。
具有足夠大量流動通道和反應部位的設備也可被用于進行細胞分析以檢測細胞和一種或更多試劑之間的相互作用。例如，某些分析涉及確定特定細胞類型是否存在于樣本內。用于完成這種分析的一個例子是使用優先與某些細胞類型反應的細胞特異性染料。因此，這樣的染料可被引入反應部位以及然后加入細胞。細胞的染色可使用標準顯微技術檢測。如另一例子，檢測的化合物可被篩選觸發或抑制細胞反應的能力，例如信號轉導旁路。在這樣的分析中，檢測的化合物被引入反應部位然后加入細胞。然后檢查反應部位以檢測細胞反應的形成。
相關設備和這樣的設備的應用的進一步闡述在2001年11月30日提交的待審查和共同所有的美國臨時申請第60/335,292號中闡述，其在此處為了所有目的以其整體通過參考被結合。
XI.制造 A.一般方面 作為先前提及的，利用單和多層軟光刻(MSL)技術和/或犧牲層封裝方法，一般構造提供的微流體設備。基本MSL漸進法包括在微加工模具上鑄造一系列彈性材料層，從模具去除該層，然后將該層熔化在一起。在犧牲層封裝方法中，光致抗蝕劑層圖案被沉積在通道是理想的地方。這些技術及其在生產微流體設備中的使用由下述文獻詳細論述，例如Unger等(2000)Science 288113-116、Chou等(2000)“Integrated Elastomer FluidicLab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagonstics”、在Solid StateActuator and Sensor Workshop的Hilton Head，S.C.會議論文集中以及在PCT公開WO01/01025中，其中各個在這里通過引用器全文用于所有目的而被結合。
簡單地說，前面制造方法最初涉及通過使用光致抗蝕劑(Shipley SJR5740)光蝕刻在硅基片上制造用于頂層(例如，具有控制通道的彈性層)和底層(例如，具有流動通道的彈性層)的模模具。通過旋涂速率可以精確地控制通道高度。通過在顯影之后將光致抗蝕劑暴露至UV光，形成光致抗蝕劑通道。熱回流處理和保護處置典型地被實現，與M.A.Unger，H.-P.Chou，T.Throsen，A.Scherer和S.R.Quake，Science(2000)288113，其在這里通過引用其全文而被結合。然后，混合兩部硅彈性體(GE RTV 615)分別被旋進底部模具并且被傾瀉在頂部模具上。這里，還有，可以利用旋涂控制底部聚合體流體層的厚度。局部固化頂層在烘箱中以80℃烘焙25分鐘之后被從起模具中剝離，與底層對齊且組裝。使用80℃、1.5小時最終烘焙不可逆地結合這兩層。一旦被從底部硅母模具剝離，這個RTV設備典型地使用HCL被處置(0.1N，30分鐘、80℃)。這種處置起到裂開某些Si-O-Si結合的作用，從而露出使通道更親水的羥基團(hydroxy group)。
然后，該設備可優選地被氣密地密封至支座。該支座可以實質上由任意材料制造，盡管表面應當是平坦的以確保良好密封，因為形成的密封主要因粘結力。合適支座的例子包括剝離、塑料等。
根據前面方法形成的設備產生形成流動通道中一個壁的基片(例如，載玻片)。可替換地，一旦從母模具移除的設備就被密封至薄彈性隔膜，以致于流動通道被整體密封在彈性材料中。因此，得到的彈性設備可被優選連接至基底支座。
B.利用盲道設計的設備 1.層結構 基于盲道設計的微流體設備典型地由三層形成，在所述微流體設備中試劑在制造期間被沉積在反應點。底層是試劑沉積在其上的層。底層可以由各種彈性材料形成，如在上面引證的MLS方法中在引用中所述的。典型地，材料是聚二甲基硅氧烷(PMDS)彈性體。基于該裝置和理想的用于具體設備的反應點的定位，人們可以確定在適當試劑應當點樣在其上的底層上的定位。因為PMDS是親水的，則沉積的含水點收縮移形成非常小的點。沉積的試劑被沉積以使在試劑和彈性體表面之間沒有形成共價鍵，因為如先前所述的試劑一旦被導入反應點中則被用于融解在樣本溶液中。
設備的其余兩層是形成流動通道的層和形成控制和優選保護通道的層。這兩層根據在這個部分先前所述的一般方法被制備，然后，將得到的兩層結構放置在第一層的頂部，試劑已經被沉積在所述第一層上。三層中的組成的具體例子如下(組成A對組成B的比率)第一層(樣本層)30∶1(重量上)；第二層(流動通道層)30∶1；以及第三層(控制層)4∶1。然而，可以想象到的是，也可以利用彈性部件的其它組成和比率。使用結合兩或多層和或基片的其它方法可以包括使用粘結劑或等離子結合，優選空氣等離子體結合，以形成彈性材料塊或微流體設備的其他部分。在一些實施例中，與其它層通過通孔內部連接的附加層，優選彈性層可被用于增加彈性材料塊中每單元區域的反應密度或者減小彈性材料塊的大小。
在這種處理過程中，反應點與沉積的試劑相對齊，以致于試劑被定位在合適的反應點內。圖6是一套從設備四角截取的照片；這些照片顯示利用前面方法，沉積的試劑可被精確地與反應點相對齊。這些照片顯示保護通道和反應點被定位在分支流動通道的末端處。白色圓圈指示沉積試劑相對于反應點的位置。如所指示，各個試劑點很好地處于反應點的限制內。
2.點樣(spotting) 利用任意數量的在市場上可以買到的試劑點樣器和使用各種構建的點樣技術，可以沉積試劑。在設備制備中可被利用的合適點樣器的例子包括針點樣器、超聲點樣器、自動微吸移管管理器、電泳泵、噴墨打印機設備、滴墨打印機和某些滲透泵。在市場上可以買到的點樣器包括CartesianTechnologies MicroSys 5100(Irvine，CA)，Hitach SPBIO(Alameda，CA)，Genetix Q-Array(United Kingdom(大不列顛聯合王國))，Affymetrix 417(Santa Clara，CA)和Packard Bioscience SpotArray(Aeriden，CT)。一般地，沉積非常小的試劑點；通常小于10nl的點被沉積，在另一例子中小于5nl、2nl或1nl，在又一例子中，小于0.5nl、0.25nl或0.1nl。
使用Foder等的US專利No.5445935名稱為“Array of oligonucleotideon a solid substrate”中所述的方法還可以形成材料陣列，其中例如SNP探針的低聚核苷酸探針使用空間光引導光蝕刻在原位置被合成。這種陣列還將被用作本發明中微流體設備的基片或基底，以致于對應于反應點的基片區域例如盲填充腔將排列在基片上在一個已知位置中包含一個或者優選多余一個的低聚核苷酸探針。在分離微流體結構的情形中，例如在這里圖15中所描繪的一種，被描繪為沿蛇形線(serpentine)的正方形盒子的反應點，流動通道將包含多個不同SNP探針，優選適于從單體的總和中識別單體的SNP探針的集合，以致于如果包含來自多個單體中的核酸序列的流體樣本，在此處被導入蛇形線流動通道，和與蛇形線流動通道相連通的多個閥門，以致于被起動時導致蛇形線流動通道被分離，從而隔離互相隔離各個反應點，以在各個反應點中包含流體樣本的片斷。可以執行對樣本組成的擴增以增加分子數，例如核酸分子，用于結合至被定位在各個反應點內的SNP探針陣列。在一些實施例中，沿蛇形線流動通道的各個反應點將是相同的陣列，也就是具有相同的排列SNP探針，以及在另一實施例中，沿蛇形線流動通道的兩個或多個反應點將具有不同系列SNP探針。其它分離流動通道構造還可能被使用，例如分支的和/或分支的分支系統等等。其它排列技術，例如這里所述的點樣，同樣的可被用于形成定位在沿蛇形線或普通流動通道(例如分支的)的可分離反應點內的陣列。
下面例子被表述，以進一步說明這里公開的設備和方法的具體方面。所述例子不被認為是對本發明的限制。
例1 信號強度評價 I.介紹 這套實驗的目的是證明使用此處闡述的設計的微流體設備可進行成功的PCR反應，信號強度比Macro TaqMan反應大50％。
II.微流體設備 使用MSL程序制造的三層微流體設備被設計和制造，用于進行下面例子中描述的實驗。圖7A示出該設備的橫截面圖。如所示，設備700包含層722，在其內形成流動通道。該液體層722被夾在覆蓋層720和底層密封層724之間，覆蓋層720包含控制和保護層。封閉層724層形成流動通道的一個側面。作為結果的三層結構被固定至基層726(在這個例子中，滑板或蓋片)，基層726提供結構穩定性，增加熱傳導，并幫助防止從微流體設備700底部的蒸發。
圖7B示出流動層722內流動通道的設計的略圖以及控制/保護層720內控制通道和保護通道的設計的略圖。設備700包含十個獨立的流動通道702，每一個帶有自己的入口708，以及分支盲通道704，每一盲通道704具有1nl的反應部位706。設備700包含控制線712的網絡，其在施加足夠壓力時分隔反應部位706。還包含一系列保護通道716以防止液體蒸發出反應部位706；液體通過入口718引入。
II.試驗配置 在設備700中實施PCR反應，所述PCR反應使用β肌動蛋白引物和TaqMan探針以從人類男性染色體組DNA(Promega，Madison WI)擴增β肌動蛋白基因的外顯子3。TaqMan反應包括下面成分1×TaqMan緩沖劑A(50mM KCI，10mM Tris-KCI，0.01MEDTA，60nM Passive Reference1(PR1)，pH8.3)；3.5-4.0mM Macl；200nM dATP，dCTP，dGTP，400nMdUTP，300nM激動蛋白前向引物和逆向引物；200nMFAM標記的β肌動蛋白探針；0.01U/ul AmpEraseUNG(Applied Biosystems Foster市，CA)；0.1-0.2U/ul DyNAzyme(Finnzyme，Fspoo，Finland(芬蘭))；0.5％Triton-x-100(Sigma，St.Louis，MO)；0.8ug/ul凝膠(Calbiochem，San Diego，CA)；5.0％甘油(Sigma，St.Louis，MO)；去離子水和男性染色體組DNA。加入反應成分以生成25ul總反應容積。每一套PCR反應中包含陰性對照(negative control)，陰性對照包含除去目標DNA之外的所有TaqMan反應成分。
一旦TaqMan反應樣本和對照被制備，則使用連接至1毫升注射器的凝膠加載吸管尖端，將它們注射入微流體設備700中。吸管尖端被充滿反應樣本，然后通過708被注入流體。通過手動將反向壓力施加給注射器，流動通道702被填充，直至所有整個盲道704和反應部位706被填充。控制線712被填充去離子水，并且在所有樣本被加載進流線702、704之后被壓縮至15-20psi。壓縮的控制線712被激勵以關閉閥門和將樣本隔離在1nl孔706中。然后，將引導通道716填充去離子水，進而壓縮至5-7psi。將礦物油(15ul)(Sigma)放置在熱循環器的平板上，然后將微流體設備/蓋片700放置在熱循環器上。微流體設備700因而被熱循環，使用初始斜面和三步或兩步熱循環曲線。
1.初始斜面至95℃，并且保持1分鐘(1.0℃/s至75℃，0.1℃/sec(秒)至95℃)。
2.三步熱循環持續40周(92℃持續30秒，54℃持續30秒以及72℃持續1分鐘)或者； 3.兩步熱循環持續40周(92℃持續30秒以及60℃持續60秒) 帶有殘留反應混合物的MicroAmp(微安)管(Applied Biosystems Foster市，CA)，為了將它們與在微流體設備中進行的反應相區分而標明MacroTaqMan反應，被放置在GeneAmp PCR系統9700(Applied Biosystems，Foster市，CA)中，并且在9600型號中被熱循環。Macro TaqMan反應被用作微流體設備中進行的反應的宏觀對照。熱循環協議被設置以與微流體設備中的相匹配，除了初始斜面比率不是為Macro T aqMan反應而控制之外。
一旦完成熱循環，對照和保護線被減壓以及該片被轉移到玻璃滑片(VWR，West Chester，PA)上然后該片被放置進入具有改良的托架的ArrayWoRx掃描器(Applied Precision，Issaquah，WA)。熒光強度在三種不同激發/發射波長下被測量475/510nm(FAM)，510/560nm(VIC)，和580/640nm(Passive Reference 1(PR1))。使用Array Works軟件顯像微流體設備中的熒光和測量每一1nl孔中的信號和背景強度。然后使用Microsoft Excel文件分析結果，計算β肌動蛋白TaqMan反應的FAM/PR1比值。對于傳統MacroTaqMan，目標DNA的陽性樣本使用制造商提供的協議(TaqMan PCR試劑盒協議)中描述的計算方法測定。信號強度通過用對照的FAM/PR1比值除樣本的FAM/PR1比值來計算。成功的反應定義為樣本比值高于99％置信度閾值水平。
III.結果 開始，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems，Foster市，CA)被用在TaqMan反應中以及與Macro TaqMan反應5.0-14.0的反應比值相比，產生1.5-2.0的FAM/PR1對照比值。盡管結果是陽性的，需要增強信號強度。因此，由于DyNAzyme聚合酶的熱穩定性、校正和對雜質的抵抗增強，AmpliTaq Gold聚合酶被DyNAzyme聚合酶代替。0.025U/μl的標準MacroTaqMan DyNAzyme濃度被用于微流體實驗中。聚合酶改變為DyNAzyme產生了3.5-5.8的FAM/PR1對照比值。信號強度被改善，但難于獲得穩定的結果。由于已知某些蛋白粘至PDMS，增加了多聚酶的濃度并包含了表面改良添加劑。以微流體設備中每nl 100pg或10pg基因組DNA檢測了兩種濃度增加的DyNAzyme，8×(0.2U/μl)和4×(0.1U/μl)用于MacroTaqMan的標準濃度。加入凝膠、甘油和0.5％Triton-x-100以防止多聚酶粘附到PDMS。微流體設備(片)中和Macro TaqMan對照的反應結果在圖8示出。
微流體TaqMan反應比值范圍從4.9-8.3而Macro TaqMan反應范圍從7.7-9.7。因此，片中TaqMan反應的信號強度達到Macro TaqMan反應的87％。4×和8×DyNAzyme之間沒有顯著差異。該結果證實PCR反應可以在微流體設備中進行，信號強度大于與Macro TaqMan反應相比的50％。該結果在至少四次的嘗試中是一致的。
例2 試劑點樣 I.介紹 該實驗的目的是證實微流體設備中成功的點樣PCR反應。該文本中的術語“spotted”是指小滴試劑(斑點)在基質上的放置，該基質然后被組合成為微流體設備的部分。被點樣的試劑通常是實施PCR所需的試劑混合物的子集。
II.過程 A.試劑的點樣 試劑的常規點樣通過接觸打印來實施。試劑從一套源孔被取到金屬針上，以及通過使針接觸目標基質而被沉積。該打印過程在圖9中進一步概括。如所示，試劑被從源(例如微滴定板)取得，以及然后通過使裝載的針與基質接觸而被打印。洗滌步驟包含在去離子水中搖動然后真空干燥。用于打印試劑斑點的系統是Caresian Techologies MicroSys 5100(IrvineCA)，使用TeleChem“ChipMaker”打印針，盡管如上所述可使用其它系統。
使用的針是TeleChem ChipMaker 4針，其結合有電切削狹槽(見圖9)以增加攝取的體積(以及因此可打印斑點的數量)。在使用的操作條件下(典型地，75％相對濕度和大約25℃)，每針每裝載循環打印超過一百個斑點。在以上條件下，點樣在PDMS基質上的試劑的體積是0.1nl級的。
針尖端的大小為125×125μm。干燥的試劑的最終斑點實質上是小于此的(小到直徑7μm)，針的大小依然決定可容易獲得的斑點間距的下限。可獲得的間距決定了最終設備中最小的孔-至-孔間距。使用這樣的設備和前述的方法，可獲得180μm間距的陣列。構建在工作片中的陣列趨向于具有從600到1300微米的間距。
在某時間僅使用一個針進行點樣。然而，使用的系統具有可容納達到32個針的針頭部。打印標準尺寸的片(20×25nm級陣列大小)花費低于5分鐘。
B.點樣的片的組合 PCR設備的流動和控制層根據以上描述的正常MSL程序組合。微流體設備設計與例1中所描述的那個相同。同時，包含A∶B成分比30∶1的150μm厚PDMS的基質層，通過旋轉被覆空白硅晶片，以及然后在80℃固化90分鐘。
固化的PDMS空白基質層(圖7A的封閉/基層724)用作為試劑點樣的目標。點樣的圖案被打印在仍然在空白晶片上的基質上，用于PCR反應的點樣的試劑是即將被擴增的特定基因的特異性引物和探針。點樣的試劑包含體積比1∶1∶1的300nMβ肌動蛋白前向引物(FP)，300nM nMβ肌動蛋白逆向引物(RP)，和200nMβ肌動蛋白探針(Prb)。在某些情況下，通過濃縮點樣的混合物進一步調整化學性質是有用的。已發現調整濃度以使引物和探針濃度等于或稍微高于常規宏觀的配方值產生一致性良好結果。因此，點樣的試劑被濃縮至宏觀反應濃度的3倍和4倍。試劑的濃縮在Centrivap加熱和抽空離心分離機內進行并且不改變FP∶RP∶Prb的相對比值。斑點濃度的增加產生當試劑在1nl反應體積被重新懸浮時的恰當終濃度。點樣的試劑不需限制為引物和探針；也不必所有三者(FP、RP和Prb)被點樣。可以進行只有探針、或甚至引物之一被點樣的應用。點樣的樣本引物/探針套是TaqManβ肌動蛋白和TaqManRNAse-P的實驗已經進行。
在基質層上點樣過程之后，結合的流動和控制層(即圖7A的層720和722)與斑點圖案對齊并接觸。使用進一步在80℃烘烤60-90分鐘以將基質結合至片的其余部分。在片組裝后，PCR反應的其余成分(在例1中描述)被注入片的流動通道以及片被如例1中所述進行熱循環。
III.結果 使用其中引物(向前和反向引物)和探針分子被點樣的設備，連續地和重復地執行PCR反應。類子芯片的數據例被顯示在圖10中，在該芯片中連續執行反應。點樣的試劑產生如在例子1中限定的連續PCR反應。使用2階和3階熱循環協議連續執行反應。
例3 基因定型 I.介紹 下面試驗的目的是闡述利用這里所述的例如微流體設備或芯片可以實施基因定型試驗。具體地，這些試驗被設計以確定在該設備中實施的反應是否具有足夠的靈敏度且確保除β肌動蛋白之外其它引物/探針集合可被執行在微流體設備中。
II.方法/結果 A.Rnase P試驗 如例1中所述在微流體設備中執行Rnase P TaqMan反應(AppliedBiosystems，Foster city，CA)，以說明其它引物/探針集合產生可檢測的結果。Rnase P反應還要求更高靈敏度，因為與β肌動蛋白引物/探針集合相對照Rnase P引物/探針集合檢測單拷貝基因(2拷貝/染色體組)。β肌動蛋白集合檢測單拷貝β肌動蛋白基因和幾種假基因，它們每個染色體組集中總共近似17份。使用如例1中所述的相同組成運行Rnase P反應，除了β肌動蛋白引物/探針集合由Rnase P引物/探針集合取代之外。另外，Rnase P引物/探針集合在4×制造商推薦數值處被使用，以增強熒光信號。將VIC染料共軛結合至用于Rnase P的探針，并且關注針對VIC/PRI比率分析。四種試驗之一的結果被顯示在圖11中。
用于Macro TaqMan反應的VIC/PRI/對照比率是1.23。用于微流體設備中TaqMan反應的相應比率是1.11和1.21。微流體設備中染色體組DNA樣本的比率在高于99％確信閾值之上。另外，微流體設備中TaqMan反應的信號強度為Macro TaqMan反應的50％和93.7％。微流體設備中對照TaqMan反應具有標準偏差.006和.012，說明了在微流體設備上的反應連貫性。因此，確定芯片中TaqMan反應是靈敏的，足夠檢測每個染色體組的2個拷貝。
B.DNA稀釋試驗 為了進一步確定微流體設備中TaqMan反應的靈敏度，對染色體組DNA的稀釋液進行測試，使用β肌動蛋白引物/探針集合。反應組成通常與例子1中所述的一樣被組成，使用4×DyNAzyme和染色體組DNA的稀釋液。染色體組DNA被稀釋至0.25pg/nl之下，其相應于近似每nl 1份。一種稀釋系列的結果被顯示在圖12中。
根據泊松分布，如果平均目標數為一，則孔總數的37％應當為負的。孔數5、6和7低于計算的閾值，因此是負的。這建議微流體芯片中的β肌動蛋白TaqMan反應可以檢測每nl一份的平均值。因此，微流體設備中的反應靈敏度是足以執行基因定型試驗的。
C.基因定型試驗 因為微流體設備中的TaqMan能夠檢測低目標數，預先測試SNP(單核苷酸多態)，所以使用針對CYP2D6 P450細胞色素基因的預定AllelicDiscrimination包(Applied Biosystems，Foster city，CA)執行基因定型。所述包包含一引物集和兩探針；標示用于野生型或參考等位基因的FAM，CYP2D6*1和標示用于CYP2D6*3突變或變異等位基因的VIC。用于沿染色體組DNA的各個等位基因的正極性對照、PCR產物在設備中被測試，使用與例1中所述的相同條件。來自一個試驗的結果被顯示在圖13和14中，該試驗被重復至少三次，以驗證結果和論述可靠性。
如圖13中所示，分別被產生3.5和2.2的平均VIC/PRI/對照比率的Al-1(Allele 1，CYP2D6*1野生型等位基因)和染色體組DNA(100pg/nl)，指示染色體組DNA是用于CYP2D6*1野生型等位基因的正極性。這些數值在用于反應的閾值限之上。微流體設備中TaqMan反應的信號強度分別是Macro TaqMan對照的59％和40％。在VIC通道中應當位負的的Al-2(Allele 2，CYP2D6*3突變或變異等位基因)，被顯示在對照(1.5)之上的一些信號，可能因為FAM熒光泄漏進檢測器的VIC通道。使用改進的檢測處理可將泄漏最小化。
Al-2正極性對照給出3.0的平均VIC/PRI/對照比率，其為MacroTaqMan信號的37％和在計算的閾值限之上(見圖14)。用于CYP2D6*3突變等位基因的染色體組樣本是負的，由于CYP2D6*3等位基因的頻率是低的期望結果。再者，顯示有一些Al-1、VIC探針的泄漏進入檢測器的FAM通道。總的來說，SNP檢測反應在微流體設備中是成功的。
例4 使用凝膠電泳的PCR校驗 I.介紹 當證實DNA擴增的可選擇方法發生在微流體設備中時，使用凝膠電泳檢測PCR產物的試驗被執行。PCR反應組成與例子1中所述的一樣，除了TaqMan探針被省略和β肌動蛋白向前引物被共軛結合至FAM。
II.過程 A.微流體設備 使用MSL處理制造的三層微流體設備被設計和制造，用于實施在這個例子中所述的試驗；圖15顯示該設計的示意圖。設備1500一般包括樣品區域1502和對照區域1504。樣品區域1502包含三百四十一個1nl反應點1508，該反應點由沿流動通道1506排列的矩形所表示，流動通道1506包括進入通孔1510和出去通孔1512。對照區域1504包含三個控制流動通道1514，各個流動通道包含1nl反應點1518，同樣由矩形和進入通孔1516所表示。在足夠壓力被施加給進入通孔1524中時，控制線網1522隔離各個反應點1508、1518。包括一系列保護通道1520，以阻止流體蒸發到反應點1508、1518的外面。該設備與例1中所述的一樣是三層設備(見圖7A)。整個芯片被放置在蓋玻片上。
B.試驗配置 使用例1中所述的3個溫度曲線，加載和熱循環微流體設備1500。殘留的反應樣本在GeneAmp 9700中被熱循環，使用與用于微流體設備1500一樣的熱循環曲線。在熱循環被完成之后，反應產物被再現。為了再現擴增的DNA，將3μl水注入樣本通孔1506，并且從出通孔1512取出3-4μl產物。來自設備1500和Marco反應的反應產物被使用2μl ExoSAP-IT(USB，Cleveland，OH)被處理，ExoSAP-IT由DNA Exonuclease I和ShrimpAlkaline Phosphatase組成，以去除過量的核苷酸和引物。Marco產物被從1∶10稀釋至1∶106。設備1500中的產物被脫水，以及被重新懸浮在4μl甲酰胺中。
III.結果 針對聚丙烯酰胺凝膠，連同負對照一起對兩個產物進行分析。圖15顯示凝膠電泳結果。在圖16中觀察到在長度上294帶基對的合適大小DNA帶。
來自Marco反應的產物被示出在凝膠的左手側，并且對應于大約294帶基對(β肌動蛋白PCR產物所期望的大小)。負對照缺少PCR產物。類似地，從該設備中得到的產物給出期望的β肌動蛋白PCR產物。因此，目標DNA在微流體設備中被擴增。
例5 大塊分割 聚合酶鏈反應(PCR)成為分子生物學中的主要工具。其與靈敏度(DNA單個分子的擴增)、特異性(區分單帶基失配)和動態范圍(實時測試設備的105)的組合使其成為現有中最強大分析工具之一。描述了當反應容積減小時PCR性能提高我們在單微流體芯片上執行21000個同時發生的PCR反應，在每個反應90pL的容積中且具有單溫度分子靈敏度。
圖17a-17d描繪了單排和雙排分割微流體設備，其中多層軟光蝕刻(MSL)(1)被用于產生彈性微流體芯片，該彈性微流體芯片起到活動閥門的作用，以將幾種流體樣本中的每個大塊地隔離為大量隔離的反應容積。在樣本備注如入口1703之后，所述入口1703與微流體設備1701中的分支隔離通道系統1705相連通(圖17b)，2400個各個樣本的90pL容積1709由沿單微流體通道(圖17d)間隔開的關閉閥1707隔離開。然后，芯片設備在平板熱循環器上被熱循環，以及在在市場上可以買到的熒光度數器中成像。
通過改變模板DNA的濃度以及測量給出正極性Taqmantm信號的孔的數量，評估芯片中的PCR性能。我們發現，在每孔復制品的平均數量是低的時觀察到數字擴增(圖18a和18b)。即使在每孔平均數量復制品低于1時，也觀察到強化正極性和清楚的負極性信號；這意味著甚至目標的單復制品可能具有良好擴增。正極性孔的數量與計算的控數量是一致的，以通過Poisson(泊松)分布具有≥1的目標版本(圖19)。這種結果確認這種系統即使根據單目標版本也具有恒定的擴增。來自微流體TaqmantmPCR的熒光信號強度針對宏觀PCR反應與相同DNA濃度是可比較的-即使宏觀反應每個反應包含多于＞104個模板版本。
也許被觀察的確限度(fidelity)的主要來源是目標的有效濃度90pL容積中的單分子比5μL容積中的單分子濃于55000倍。由于目標分子數nt沒有改變(也就是，nt＝1)以及可產生側反應的分子數ns(也就是，樣本中的引物-二聚物和非互補DNA序列)與容積成線性比例的(也就是，ns∝V)，目標對側反應的比率與容積成反比例nt/ns∝1/V。由于側反應是PCR事故(4)的主要原因，則減小反應容積的優點是顯而易見的。
從模板的單拷貝的PCR擴增已經在前面被報告(5)。然而，在宏觀容積中實現從單拷貝可靠擴增的當前方法經常需要改變熱循環協議(例如，長延展時間，許多循環)、對錯誤引物(mispriming)和非特定擴增(例如，“熱啟動”PCR(聚合酶的熱激勵)、“增壓器”PCR、添加劑，以減少非特定雜交等)的預防措施，并且幾乎一直使用兩圈PCR作出，其中第一PCR中的部分被用作第二反應中的模板。相相反地，這種系統從單拷貝實現可靠的擴增，使用標準條件離開隔板引物和探針和單圈標準熱循環協議。作為完整地封閉，還幾乎不受環境污染的影響。相比于宏觀容積(，同時作大量PCR反應的能力提供明確邏輯的、成本和時間益處具有21000個反應的1芯片對219個分離的96孔板，以及相關聯時間、設備和跟蹤基礎結構)。
使用數字PCR讀出的大量分離的這種原理可以被用于樣本中目標濃度的絕對數量。例如，可被使用的是，簡單地通過統計給出如上所述的特定等位基因或多個等位基因正極性的孔數量，對染色體組DNA的存儲(pool)樣本基因定型。由于對側反應的增強阻力，在量化野生型DNA中的突變異種(相關于癌癥檢測的問題)中，應當還是可使用的。通過隔離的濃度的一般原則在其它反應中可能還是有用的，在其中對單分子、細菌、病毒或細胞的檢測是感興趣的(例如，用于蛋白質檢測的ELISA反應)。Brown等的US專利No.6143496、名稱為“Method of sampling，amplifying and quantifying segment of nucleic acid，polymerase chain reactionassembly having nanoliter-sized chambers and methods of filling chambers”以及Vogelstein等的US專利No.6446706、名稱為“Digital PCR”描述了數字PCR，從而其兩者通過以其全文引用被結合。使用微流體設備可獲得的小容積允許高度并行化和非常高的目標-背景濃度比率。高目標-背景濃度比率允許單分子擴增確限度。這些因素建議用于PCR，越小越好。
本發明提供用于在微流體環境中實施數字PCR的方法和設備，所述方法包括步驟提供在其中流體通道的微流體設備，所述流體通道具有在其間相關的兩個或更多閥門，閥門被啟動時能夠將流體通道隔離為兩個或多個反應點或腔體；引入包含至少一個目標核酸聚合體的樣本，啟動閥門將流體樣本隔離為兩個或多個部分，其中至少一部分包含目標核酸聚合體，而另一部分不包含目標核酸聚合體，擴增目標核酸聚合體，以及確定包含目標分子的流動通道部分的數量。在優選實施例中，微流體設備包括彈性體材料，更優選地包括包含彈性體材料的至少一層。在具體優選實施例中，微流體設備進一步包括可偏轉的隔膜，其中可偏轉的隔膜可偏轉入流體通道或偏轉出流體通道，以控制流體通道內的流體流和/或隔離流體通道中一部分與另一部分，優選地其中可偏轉的隔膜對于微流體設備層來說是完整的，在其中具有形成在其中的通道或進出口，以及優選地其中形成可偏轉的隔膜，在該處微流體設備的第一層中的第一通道由第二層中的第二通道所重疊。在一些實施例中，樣本流體包含實施擴增反應所需的所有部件，而在其它實施例中，在引入樣本流體之前，微流體設備包含擴增反應的至少一個部件。在一些實施例中，微流體設備進一步包括檢測試劑，優選地對至少部分目標核酸聚合物有用的(complimentary)一個或多個核酸聚合物，優選地多種不同核酸聚合物在空間上排列在微流體設備的反應點或腔體內。
通過例如PCR的熱循環反應或者通過絕熱反應可以獲得擴增，所述絕熱反應例如由Van Ness等描述在美國專利申請No.10/196740中，其被公告為US2003/0138800A1，其再次通過引用其全文用于教導絕熱擴增放案的目的被結合。
本發明進一步使用熒光染料用于蛋白質微量熱法測定，例如SYBER綠(TM)，以測量蛋白質的構象變化，例如變性，尤其是如果在蛋白質與例如配合基或復合物或其他蛋白質的另一半族(moiety)相互作用時蛋白質變形溫度改變。使用SYBR綠(TM)的另外優點在于它在比其他UV范圍染料低的波長處被使用，從而減少典型地與許多塑料材料相關的背景問題。
圖22B描繪了完整的微流體設備2899的展開圖，所述微流體設備2899包括圖22A中所示的部件，且進一步包括彈性材料塊2808，所述彈性材料塊2808被附連或更優選地使用粘結劑被粘結以及更優選地直接被粘結，優選地不使用至基底2800的彈性材料塊位置2807的粘結劑以形成完整的微流體設備2899(圖22C)。在彈性材料塊2808內是處于與一個或多個通孔2814相流體連通的一個或多個通道，所述通孔2814接下來提供彈性材料塊內通道和基底內通道之間的流體連通，所述流體連通然后在井排2806a-d內產生井(well)2805以提供基底2800的井(well)2805和彈性材料塊2808內通道之間的流體連通。累積器井(well)頂部2809和2810被附連至累積器井(well)2801和2802以形成累積器腔2815和2816。累積器井(well)頂部2809和2810分別包括閥門2812和2811，其優選為在壓力下用于引導和保持氣體進入累積器腔2815和2816的止回閥門。當存在于累積器腔2815和2816內時，閥門2811和2812為了保持液體而適于距離接觸閥門2811和2812被定位在排水井2802和2804內側。閥門2811和2812可優選是在優選止回閥門內通過擠壓薄片、銷釘等而被機械打開的，以克服止回閥門的自動關閉力，以允許從累積器腔釋放壓力從而降低被包含在累積器腔內的流體壓力。
圖22B描繪了完整的微流體設備2899的展開圖，所述微流體設備2899包括圖22A中所示的部件，且進一步包括彈性材料塊2808，所述彈性材料塊2808被附連或更優選地被粘結以及更優選地直接被粘結，優選地不使用至基底2800的彈性材料塊位置2807的粘結劑以形成完整的微流體設備2899(圖22C)。在彈性材料塊2808內是處于與一個或多個通孔2814相流體連通的一個或多個通道，所述通孔2814接下來提供彈性材料塊內通道和基底內通道之間的流體連通，所述流體連通然后在井排2806a-d內產生孔(well)2805以提供基底2800的孔(well)2805和彈性材料塊2808內通道之間的流體連通。累積器井(well)頂部2809和2810被附連至累積器井(well)2801和2802以形成累積器腔2815和2816。累積器井(well)頂部2809和2810分別包括閥門2812和2811，其優選為在壓力下用于引導和保持氣體進入累積器腔2815和2816的止回閥門。當存在于累積器腔2815和2816內時，閥門2811和2812為了保持液體而適于距離接觸閥門2811和2812被定位在排水井2802和2804內側。閥門2811和2812可優選是在優選止回閥門內通過擠壓薄片、銷釘等而被機械打開的，以克服止回閥門的自動關閉力，以允許從累積器腔釋放壓力從而降低被包含在累積器腔內的流體壓力。
圖22D描繪了微流體設備2899和井(well)2805的平面圖，其中斷口被鄰近井(well)基底被定位，優選底部，或可選擇地井(well)2805的側面，用于從京津如形成在基底2800中通道的流體的通過，優選在井(well)2805對過在基底2800的側面上。在具體優選實施例中，基底2800被模制，在其中帶有凹槽，所述凹槽通過優選粘結劑膜或密封層的密封層被制造在通道中。
基底2800機器相關部件可以由聚合物制造，例如聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚三氟氯乙烯PTFE或Teflon(R)、玻璃、石英或金屬(例如鋁)、透明材料、多晶硅等等。累積器井(well)頂部2809和2810進一步可包括進口螺旋2812，可以將進口螺旋2812去除以從累積器腔2815和2816導入或去除氣體或液體，優選地，閥門2812和2811可被啟動以釋放否則保持在累積器腔2815和2816內的流體壓力。使用凹口2817協助校正微流體設備在其它儀器中的位置，例如，用于操作或分析微流體設備或在其中執行反應的儀器圖22D進一步描述圍繞彈性材料塊區域2807的水合腔2850，所述水合腔可以使用水合蓋體2851覆蓋以形成濕潤腔，以有利于對彈性材料塊周圍濕度的控制。通過將例如水的揮發性液體添加至水合腔2851可以增加濕度，優選通過對吸附材料或海綿增濕。可優選使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)。通過改變優選用于增濕吸附材料或海綿的聚乙烯醇和水的比率可以獲得濕度控制。通過使用例如HUMIDIPAKTM濕潤封裝的濕度控制設備還可以控制水合，所述濕度控制設備例如使用水蒸氣可透過的而液體不可透過的密封袋容納具有適于維持理想濕度值的鹽濃度的鹽溶液。參見Saari等的US專利No.6244432，在這里通過引用用于包括濕度控制設備和方法的特定目的的所有目的被結合。水合蓋體2850優選是透明的，以為了在使用期間在彈性材料塊內不掩蓋可視化的情況。同樣地，在彈性材料塊區域2807下面的基底2800的部分優選是透明的，但也可是模糊的或反射的。
圖22E描繪了基底2800的橫截面圖，帶有沿密封層2881被定位在彈性材料塊區域2807的彈性材料塊808，所述密封層2800在彈性材料塊2808的對面被附連到基底2800的側面。井(well)2805處于與彈性材料塊2808流體連通中，通過第一端口2890、通道2870和第二端口2892、進而進入彈性材料層2808的凹槽，所述凹槽由基底2800的上頂面2897密封以形成通道2885。密封層2881由模制或加工入基底2800底表面2898的凹槽形成通道2870。密封層2881優選是透明材料，例如聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯。在一個實施例中，密封層2881是彈性的，例如粘接帶，并且可通過粘接被附連到基底2800，例如使用粘接劑或加熱密封或機械附連，例如通過壓縮。用于密封層2881的材料優選是易于形成帶有凹槽的流體密封的，以形成具有最小泄露的流體通道。密封層2881可進一步由是剛性的附加支承層(未顯示)支承。在另一實施例中，密封層2881是剛性的。
流體的閉合細節展示了基底2800的彈性材料塊2808和彈性材料塊區域2807之間界面。如在Grossman等待審查專利申請US11/043395中所描述的，其中用于這里這里和那里掃描述的所有目的而被結合，以及用于公開關于集成載體和自動啟動設備的使用的進一步細節的目的，由被結合在一起以形成彈性材料塊的多層彈性材料可以形成彈性材料塊。優選地，具有形成在那里的凹槽的第一彈性材料層被粘接至具有形成在那里的凹槽的第二材料層，以形成形成在那里的凹槽的彈性材料塊。第一彈性材料層的凹槽被整體或部分阻塞，以形成在第一彈性材料層中的通道。當彈性層被粘接至基底時，形成在第二材料層中的凹槽同樣地被整體或部分阻塞，以形成第二彈性材料層中的通道，從而形成具有形成在其中帶有通道的多層的微流體設備。
在圖23中，第一彈性材料層2920和第二彈性材料層2923被粘接在一起以形成具有通道2907(由第一凹槽2901和第二彈性材料層2923頂面形成)的彈性材料塊，所述第一彈性材料層2920具有形成在其中帶有第一凹槽2901的底表面，所述第二彈性材料層2923具有形成在其中的帶有第二凹槽2905的頂表面和底表面。基底2800被附連到第二彈性材料層2923的底表面，以由基底2800的頂表面2897和第二彈性材料層2923的底表面形成通道2909。端口2892可使用第二彈性材料層的通道2909連接基底2800的通道2872，通道2909部分通過基底2800的頂表面形成。可替換地如圖23中所示，經由通孔2950，端口2892使用彈性材料塊2808的第一彈性材料層2920的通道2907連接基底2800的通道2872。通孔2950大約垂直于基底表面2897被形成，優選形成在第二彈性材料層2923，在其與彈性材料層2920粘接之前，以及更具體在第一和第二彈性層被粘接在一起之后。參見待審查的且共同受讓的由Unger于2004年三月29日提出的US臨時專利申請No.60/577715，其通過用于所有目的和教導經由構成使用自動激光消融系統和方法的專用目的而被結合。用于制造通孔的示例方法包括包括微制造同時形成第二彈性材料層2923、激光專控、使用CO2激光器的激光鉆孔、使用受激準分子激光器的激光鉆孔、機械鉆孔和取芯，優選地其中使用機器人鉆孔系統執行鉆孔，優選地具有x、y自動階段的鉆孔系統。
圖23描繪通孔的另一優選使用的橫截面圖，所述通孔位于這里所述的微流體設備中。微流體塊2921包括具有形成在其中的第一層凹槽(或粘接至第二層時的通道)2907的第一層2920和具有在其中的第二層凹槽(或粘接至基底時的通道)2950的第一層2923。兩個第二層通道處于穿過第一層通道的流體連通中，使用兩個或多個通孔2950。優選地，至少一個通孔2950處于與基底2800中的孔2999另外流體連通中，穿過基底凹槽2892(或者通道，如果密封層(未顯示)被結合至基底2800)。至少一個第二層通道2909被第一層通道2907重疊，沒有處于流體連通中。在圖23中所示的實施例中，因為一層中的流體通道可以在同一層中的居間流體通道上或下行進，所以得到微流體設備中每單元面積的較高密度的反應和/或檢測帶。有消融碎片腔2989，用于收集由激光消融通孔2950產生的碎片。使用兩層鑄造方法可以將碎片腔2989鑄入層2920內，其中在第一光致抗蝕劑層被圖案化和開發出之后，第二光致抗蝕劑層被重疊在第一圖案上，并且第二圖案被形成在第一光致抗蝕劑層的圖案上，以致于使光致抗蝕劑圖案區域可以是不同高度。一個在另一個上可以構造多層，以產生變化高度的圖案。不同光致抗蝕劑材料還可以被使用，以使例如光致抗蝕劑上層能夠在被加熱時重新流動，然而下層由在相同加熱溫度出基本上不會重新流動的光致抗蝕劑材料制造。
本發明的流動通道取決于它們想要的應用可選擇地被設計具有不同橫截面尺寸和形狀，呈現不同優點。例如下流動通道的橫截面形狀可以具有彎曲的上表面，或者沿其整個長度或處于設置在上橫截通道下面的區域中。這種彎曲上表面有利于閥門密封，如下面。通過本發明實現的隔膜厚度剖面和流動通道橫截面包括矩形的、梯形的、圓形的、橢圓形的、拋物面形的、雙曲線形的和多邊形的，還有上面形狀部分。更復雜橫截面形狀，例如具有隆起部分(protrusion)的實施例或在流動通道中具有凹陷的實施例，還使用本發明被實現。
另外，盡管本發明主要結合其中流動通道的壁和天花板由彈性體構成且流動通道的地面由下面基底構成的實施例被描述，但是本發明不限于這種具體定位。通道的壁和地面還可能被形成在下面基底中，流動通道中只有天花板由彈性體構造。響應施加的激勵力，這種彈性體流動通道天花板將向下突出進入通道，從而控制穿過流動通道的材料的流動。一般地，單片彈性體結構優選用于微流體應用。盡管可能有用的是，采用形成在基底中的通道，其中這種結構具有多個優點。例如，包括光波導的基底可以被構造，以使光波導專門將光引導至微流體設備的側面。
本發明的微流體設備可被用作單獨的設備，或優選地可被用作如由本發明所提供的系統中的部件。圖24描繪了用于起動微流體設備的機器人站的透視圖。自動氣動控制和累積器裝料站3200包括接受灣(bay)3203，用于保持本發明的微流體設備3205，例如在圖22A-22E中所描繪的類型。壓盤3207適于接觸微流體設備3205的上面3209。壓盤3207在其中具有于微流體設備3205對齊的端口，以將優選氣體壓力的流體壓力提供至微流體設備3205內的孔和累積器。在一個實施例中，壓案3207通過臂3211的運動被推動向微流體設備3205的上面3221，所述臂3211懸掛在樞軸3213上且通過活塞3215被激勵，所述活塞3215在一端被連接至3211且在另一端被連接至平臺3217。沿活塞3215的傳感器檢測活塞運動和將關于活塞位置的信息中轉至控制器，優選地在遵循軟件腳本(software script)的計算機(未顯示)控制下的控制器。壓盤檢測器3219檢測微流體設備3205在接收灣3203內側的存在，優選地可檢測為流體鎖骨把3205的正確定位。例如通過將光偏離微流體設備3205的側面使用光檢測微流體設備3205的存在和位置，這可能實現。壓盤3207可以機器人化地、氣動地、電力地等等被下降。在一些實施例中，壓盤3207被手動下降以結合設備3205。
在一個實施例中，指向壓盤3207的流線被定位在臂3211內且被連接到流體壓力源，優選在控制器控制下的自動氣動壓力源。壓力源將控制流體壓力提供給壓盤3207的壓盤表面(未顯示)內的端口，將受控壓縮流體供給至微流體設備3205。通過采用壓盤3207連接至臂3211的萬向節(gimbal joint)3223，至少部分地實現對壓盤3207的微定位，以使壓盤3207可圍繞垂直微流體設備3205上表面3221的軸用萬向架固定。
圖25描繪了壓盤3207的剖開側面圖，所述壓盤3207被推向微流體設備3205的上表面3221。壓盤3207被推向微流體設備3205上表面3221，以形成在微流體設備3205和壓盤面3227之間或設備32056部分和表面3227之間的流體密封。在一個實施例中，壓盤面3227包括或由順應材料制造，例如彈性彈性體，優選耐久橡膠等。壓盤3207內是分離流體壓力線，優選氣體壓力線，其與微流體設備3205的上表面3221上各個位置相匹配。還示出的是止回閥(check valve)凈化致動器3233，所述止回閥凈化致動器3233優選氣動地被激勵以及在被激勵時將銷釘3231向下推入止回閥2812，以打開和緩解流體壓力，或者通過克服其開啟阻力允許流體通過止回閥2718的引入。在一個實施例中，壓盤3207具有第一和第二凈化致動器3233，其與止回閥2811和2812嚙合(見圖22B)。
在另一實施例中，芯片或設備3205被制造具有常閉容器和/或分界閥門。在這個實施例中，累積器不必在在培養期間保持閥門關斷。在分界面和/或容器閥是理想被打開時，將壓力應用到載體或設備3205孔區域。用于全部或大多數其他時間，閥門將保持閉合以將各個芯片試驗互相分離，和/或將芯片上的試劑和蛋白質孔互相分離。
圖25描繪了壓盤3207的剖開圖，所述壓盤3207被推向微流體設備3205的上表面3221，其中通過將壓盤表面3227接觸在上表面3221的脊部3250上將壓力腔3255形成在井排2806上方。然后，流體壓力優選氣體壓力被應用至壓力腔3255，通過將流體從追溯到裝料站(chargingstation)3200的臂3211的壓力線導入腔體3255。通過與裝料站3200相關的壓力調整器調整壓力，優選地通過根據裝料站控制器發送的信號而可變化輸出壓力的電受控可變壓力調整器，優選在計算機控制下。壓力腔體3255內的流體壓力接下來驅動孔2805內的流體穿過基底2800內的通道，進而進入彈性材料塊2808的通道和/或腔體內，以填充通道或腔體或激勵彈性材料塊2808的可偏轉部分，優選如前所述的可偏轉隔膜閥門。
圖27A和27B描繪了系統3500的具體實施例，更具體地，描繪了界面板3520的具體實施例。在圖27A中，界面板3520被耦合至集成芯片和載體3400，以流體密封其某一區域的方式。具體地，流體密封被設置在分界板3520和載體3400和芯片中一個或多個區域之間，例如第一蛋白質區域3430、第二蛋白質區域3432、第一井區域3420、第二井區域3422分界累積器3460、止回閥3465、容器累積器3450和/或止回閥3455。在一個實施例中，分界板3520將流體密封提供給區域3420、3422、3430、3432，以及提供給累積器3450和3460。在一個實施例中，分界板3520提供一個或多個止回閥致動器3570，如在圖27B中最佳看到的。
在一些實施例中，分界板3520將所有理想的流體密封提供給載體3400和微流體設備。這樣做時，分界板3520可包括密封墊圈3580。密封墊圈3580可包括廣泛的材料，包括但不限于硅膠、彈性體等。在一些實施例中，墊圈3580包括順應材料，以有助于在想要的位置出形成流體密封。以這種方式，系統3500可將想要的壓力提供給芯片和載體3400中的合適區域。在其它實施例中，分界板3520為兩個或多個板部件。例如，在載體3400和微流體設備上的區域或端口各個可被流體耦合至分離板3520，所述分離板3520適于裝配所述端口或區域。系統3500然后將包括必要數量的分界板3520，用于各個端口或區域。另外，在一些實施例中，多于一個區域或端口被耦合至具體分界板3520，而其余區域或端口被耦合至分離分界板3520。分界板和載體/芯片區域和端口的其它組合還落入本發明的范圍內。
在一個實施例中，系統3500的操作包括將一個載體3400裝載入接收站3510內。在某些實施例中，載體3400包括耦合至那里的微流體設備，并且在將載體放置入接收站3510之前將想要的試劑和蛋白質裝載入載體孔。在其它實施例中，載體3400被放置進接收站3510，隨后使用試劑和蛋白質裝載。載體3400進一步可裝載有水合流體。水合流體可被放置在水合腔3440中。在載體3400被裝載入系統3500之后，分界板3520被被降低或相反被轉移結合載體3400。板3520可以手動地、機器人地或相反被降低以使用下片/載體3400的部分或全部流體密封。水合流體被提供給分界累積器3460和/或容器累積器3450，以及通過使用耦合至分界板3520的壓力源將合適壓力應用到累積器3450、3460而驅入芯片。在具體實施例中，系統3500自動執行這個工藝，所述工藝在具體實施例中在水合流體被添加至載體3400之后在大約二十(20)小時內發生。結果是，使用水合流體將芯片充分加載，以操作芯片容器和/或分界閥，如這里及本專利更充分的所述的和在這里通過引用結合先前應用。
通過將理想的壓力施加給圍繞合適入口的合適密封芯片區域，將包括試劑和樣本的溶液分發進芯片。例如，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區域3420和3422，使驅動試劑進入芯片。類似地，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區域3420、和3422，使驅動蛋白質進入芯片。在具體實施例中，這在芯片裝載水合流體之后在大約六十(60)分鐘之內發生。一旦溶液被驅趕至芯片內的想要的孔、腔、蓄積庫等等，通過釋放分界累積器3460中的止回閥3465打開芯片內的分界閥門。在具體實施例中，止回閥3465被釋放，以打開芯片中的分界閥，此時系統3500激勵結合止回閥3465的止回閥致動器3570。在一些實施例中，止回閥致動器3570包括適于結合止回閥3465的銷釘、接線柱等，以釋放分界累積器3460內的壓力。在可替換實施例中，止回閥3465被手動釋放或打開。
在使溶液混合理想時間之后，使用例如常規混合或重復打開和關閉分界閥以增加流體在腔中運動的分散或其它工藝，閉合分界閥。將壓力施加給致動器3450和/或3460，以保持閉合的分界閥門和容器閥門。載體3400可以從系統3500中去除，用于在這里所述的工藝中培養或存儲或使用。致動器3450和3460使壓力保持持續想要的時間，從數小時至數天，以阻止或幫助阻止容器或分界閥打開。在具體實施例中，致動器3450和3460保持芯片內壓力在理想閾值壓力之上，足以保持容器和/或分界閥閉合。在一個實施例中，致動器3450和3460保持壓力在閾值壓力之上持續至少兩(2)天、至少七(7)天等。致動器3450和3460保持理想壓力的時間長部分取決于培養溫度。部分取決于理想培養時期長和/或培養條件，載體3400可以往返至系統3500，為了重復裝料或重復壓縮致動器3450、3460。以這種方式，培養時期可以 在具體實施例中，集成載體3400和微流體設備適于執行根據本發明實施例的想要的實驗，通過使用本發明的系統。更具體地，如圖26A中所示，系統3500包括一個或多個接收站3510，各個適于接收載體3400。在具體實施例中，系統3500包括四個(4)接收站3510，盡管在本發明的可選擇實施例中提供更少或更多數量的站3510。圖26B描繪在站3510中被組合設置的載體3400和設備，處于分界板3520下面。在圖26B中，分界板3520適于向下傳遞，以使分界板3520結合載體3400的上表面及其微流體設備。在一些實施例中，站3510和壓盤3520類似于站3200和壓盤3207。分界板3520包括一個或多個端口3525，用于與適于在載體3400中容納流體、壓力等的區域相耦合。在一些實施例中，分界板3520包括兩端口、三端口、四端口、五端口、六端口、七端口、八端口、九端口、十端口等。在優選實施例中，分界板3520被耦合至用于將壓力提供至載體3400中想要區域的六條線以及用于提供激勵止回閥3455和3465的機械的兩條線。
如圖26A所示，系統3500進一步包括處理器，在一個實施例中所述處理器是與筆記本計算機或其它計算機設備3530相關聯的處理器。計算機設備3530包括適于保存用于執行本發明的理想工藝的軟件、方案等的存儲器。另外，計算機設備3530包括用于呈現微流體設備的研究和分析結果的屏幕3540，在一個實施例中，系統3500使用GUI顯示器。系統3500被耦合至一個或多個壓力源，例如壓力流體、氣體等，用于將同樣的傳遞給微流體設備，所述微流體設備被流動地耦合至分界板3520。
圖27A和圖27B描繪了系統3500的具體實施例，更具體地，描繪了分界板3520。在圖27A中，分界板3520被耦合至集成芯片和載體3400，以流體密封其中某一區域的方式。具體地，流體密封被設置在分界板3520和載體3400及芯片中的一個或多個區域之間，例如第一蛋白質區域3430、第二蛋白質區域3432、第一井區域3420、第二井區域3422、分界累積器3460、止回閥3465、容器累積器3450和/或止回閥3455。在一個實施例中，分界板3520將流體密封提供給區域3420、3422、3430、3432，以及提供給累積器3450和3460。在一個實施例中，分界板3520提供一個或多個止回閥累積3570，如在圖27B中最佳所看到的。
在一些實施例中，分界板3520將全部理想流體密封至載體3400和微流體設備。這樣作，分界板3520可包括密封墊圈3580。密封墊圈3580可包括廣泛的材料，包括但不限于硅膠、彈性體等。在一些實施例中，墊圈3580包括順應材料，以有助于在想要的位置出形成流體密封。以這種方式，系統3500可將想要的壓力提供給芯片和載體3400中的合適區域。在其它實施例中，分界板3520為兩個或多個板部件。例如，在載體3400和微流體設備上的區域或端口各個可被流體耦合至分離板3520，所述分離板3520適于裝配所述端口或區域。系統3500然后將包括必要數量的分界板3520，用于各個端口或區域。另外，在一些實施例中，多于一個區域或端口被耦合至具體分界板3520，而其余區域或端口被耦合至分離分界板3520。分界板和載體/芯片區域和端口的其它組合還落入本發明的范圍內。
在一個實施例中，系統3500的操作包括將一個或多個載體3400裝載入接收站3510內。在某些實施例中，載體3400包括耦合至那里的微流體設備，并且在將載體放置入接收站3510之前將想要的試劑和蛋白質裝載入載體孔。在其它實施例中，載體3400被放置進接收站3510，隨后裝載有試劑和蛋白質。載體3400進一步可裝載有水合流體。水合流體可被放置在水合腔3440中。在載體3400被裝載入系統3500之后，分界板3520被被降低或相反被轉移以結合載體3400。板3520可以手動地、機器人地或相反被降低以與下片/載體3400的部分或全部流體密封。水合流體被提供給分界累積器3460和/或容器累積器3450，以及通過使用耦合至分界板3520的壓力源將合適壓力應用到累積器3450、3460而驅入芯片。在具體實施例中，系統3500自動執行這個工藝，在具體實施例中所述工藝在水合流體被添加至載體3400之后在大約二十(20)小時內發生。結果是，芯片被充分加載水合流體，以操作芯片容器和/或分界閥，如這里及本專利更充分的所述的和在這里通過引用結合先前應用。
通過將理想的壓力施加給圍繞合適入口的合適密封的芯片區域，將包括試劑和樣本的溶液散布進芯片。例如，將在大約1psi(磅/平方英寸)和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區域3420和3422，驅動試劑進入芯片。類似地，將在大約1psi和大約35psi之間的壓力施加給第一和第二井區域3420、3422，驅動蛋白質進入芯片。在具體實施例中，這在芯片裝載水合流體之后大約六十(60)分鐘之內發生。一旦溶液被驅至芯片內的想要的井、腔、蓄積庫等等，通過釋放分界累積器3460中的止回閥3465打開芯片內的分界閥門。在具體實施例中，止回閥3465被釋放，以打開芯片中的分界閥，此時系統3500激勵結合止回閥3465的止回閥致動器3570。在一些實施例中，為了釋放分界累積器3460內的壓力，止回閥致動器3570包括適于結合止回閥3465的銷釘、接線柱等。在可替換實施例中，止回閥3465被手動釋放或打開。
在使溶液混合理想時間之后，使用例如常規混合或重復打開和關閉分界閥以增加流體在腔中運動的分散或其它工藝，閉合分界閥。將壓力施加給致動器3450和/或3460，以保持閉合的分界閥門和容器閥門。載體3400可以從系統3500中去除，用于在這里所述的工藝中培養或存儲或使用。致動器3450和3460使壓力保持持續想要的時間，從數小時至數天，以阻止或幫助阻止容器或分界閥打開。在具體實施例中，致動器3450和3460保持芯片內壓力在理想閾值壓力之上，足以保持容器和/或分界閥閉合。在一個實施例中，致動器3450和3460保持壓力在閾值壓力之上持續至少兩(2)天、至少七(7)天等。致動器3450和3460保持理想壓力的時間長度部分取決于培養溫度。部分取決于理想培養時期長度和/或培養條件，載體3400可以往返至系統3500，為了重復裝料或重復壓縮致動器3450、3460。
在一些實施例中，如在這里一般所述的集成芯片載體(ICC)和附連至那里的彈性體芯片被使用，以促進聚合酶鏈反應(PCR)。然而，在使用PCR片進行PCR時，塑料ICC的熱傳導率可能不足于在隱蔽在彈性芯片內的反應陣列中產生均勻熱場。例如，盡管圖28A中所述的ICC對其它工藝中的蛋白質結晶是有用的，但不可能充分均勻地將熱量傳遞給耦合至那里的芯片。另外，圖28A中的ICC的操作可能要求將它保留約束在壓盤上。如圖29A中所示，收縮力的應用可對芯片產生不利影響。因此，在本發明的一些實施例中，使用結合圖28B所述的ICC提供改進的均勻熱場，并且改進的ICC保留方法被描繪在圖29B中。
在一些實施例中，彈性芯片被設計，以致于與ICC的流體連接被定位在彈性芯片的外邊沿。以這種方式，ICC部分不必以來于流體傳遞。一種這樣的實施例被描述在圖28A中。在一些實施例中，沒有與ICC表面相接觸的彈性芯片中的區域位于反應腔陣列被定位的地方。這種反應區域3810包括彈性芯片和導熱材料，彈性芯片和導熱材料被匹配在芯片的下側(另外地，彈性塊側面將接觸ICC的塑料部分)。反應區域3810的大小和形狀可在本發明的范圍內發生變化，圖29C中所述的一個實施例顯示了ICC和芯片之間的關系。
以這種方式，具有最小或降低的熱阻抗，可將熱能(例如，來自PCR設備)傳遞至彈性塊。在一些實施例中，導熱材料包括硅(Si)。在具體實施例中，使用來自拋光和平滑硅晶片的硅，與半導體工業中所使用的類似或相同。在本發明的范圍內還可以使用其它低熱阻抗材料，依賴于所尋求的熱曲線的屬性。在一些實施例中，導熱材料具有低熱量(也就是，影響溫度快速改變的材料，即使良好熱導體，例如銅)。在一些實施例中，使用拋光硅，以增強反射效應和增加可由系統中使用的檢測器收集的光的數量，或實時地或如PCR反應中末端點分析的。這些益處還可改善絕熱反應。
使用ICC3800，執行PCR的一種清洗可以實現，通過使彈性塊的反應區域與熱控制源相匹配。熱控制源可包括連同其它一道的PCR設備、受熱壓盤、分離熱源。在一些實施例中，ICC裝配入接收平底反應盤的標準PCR設備和/或具有平熱壓盤，其中用于基于管的PCR的各種制式的適配器可以被使用。然而，各個這些結構通常依賴于盤向下壓縮，以得到良好(均勻)的熱接觸，如圖29A中所示。在本發明的一些實施例中，彈性材料片對向下壓縮是不可修正的，因為撓性閥門和彈性腔體在彈性片內可變形和引起不想要的流體行為。
在其它實施例中，通過使用真空卡盤(vacuum chuck)以匹配在結合至其它暴露彈性塊下側的熱材料上，降低或避免了對ICC的向下壓縮的不利影響。以這種方式，在將真空施加至卡盤時，在真空卡盤和ICC熱材料之間產生緊密密封。在如圖29B中所示的一個實施例中，真空卡盤3950包括或由為良好導熱體的一種或多種材料制造，所述良好導熱體被結合至熱控制源，例如一個或多個Peltier(珀耳帖)器件。在一個實施例中，使用多個熱控制產生在反應陣列中的熱剃度。
使用中，ICC被定位在真空卡盤3950上方，以及向下降低或被轉移，以使集成芯片3910和ICC3930中的熱部分3920與真空卡盤3950相接觸。再者，在一個實施例中，熱部分3920包括硅。熱部分3920被描繪耦合至彈性塊或片3910，使用在一些實施例中的粘結劑等實時這種耦合。如所示，塊3910結合ICC3930，以及在一個實施例中，間隙3940被保持在熱部分3920和ICC3930之間。間隙3940由于與例如卡盤或壓盤3950的熱源的熱隔離ICC3930。另外，在一個實施例中，間隙3940允許塊3910和/或熱部分3920的一些折曲。以這種方式，在這些實施例中的間隙3940在對卡盤3950施加真空時有助于形成密封，通過一個或多個真空口3960以將熱部分3920拉向卡盤3950。可以監測得到的真空數量，以變化在卡盤3950和熱部分3920之間真正地需要制造的良好熱接觸。在一些實施例中，真空卡盤中的一個或多個端口被使用用于監測真空度。在圖29D和圖30中所示的具體實施例中，用于監測真空度的一個或多個端口將被定位在真空端口的遠端以及通過通路彼此流體連通，所述通路優選曲折的且狹窄的通路。以這種方式，真空卡盤的一側-ICC中的熱部分之間差異可以與真空卡盤的另一側-ICC中的熱部分之間相比較，以確定在真空卡盤上重新放置ICC的努力能否可以解決真空損耗問題(若有的話)。折可以是自動或手動、或其中一些組合的迭代處理。
圖30描繪根據本發明的卡盤的一個實施例。在本發明范圍內可以改變曲折通路的屬性，所述曲折通路的屬性被用于得到對真空卡盤熱部分區域上不同真空度的精確測量，以及促進真空對ICC熱部分的均勻或相對均勻地應用。通過使用這種方案，被用于執行PCR反應的彈性塊可以處于與PCR設備的良好接觸，如果將使用通常向下壓縮，則沒有對彈性塊的彈性(可偏轉的)部分的功能冒險。
盡管本發明在這里已經參考其中的具體實施例被描述，但是大范圍改變、各種變化和替代被意味在前面公開中，并且將會理解的是在一些例子中，不脫離所述的本發明范圍沒有對應的其它特征的用途，本發明的一些特征將被采用。例如，除了上述的基于壓力的制動系統之外，可選的靜電和磁致動系統還被實現。還可能的是，激勵所述設備，通過基于熱能應用在控制通道中產生流體流動，或通過熱膨脹或通過從液體的氣體生成。另外，在另一實施例中，使用離心力將蛋白質和試劑驅動進入芯片。因此，不脫離本發明的真實范圍和宗旨針對本發明教導可作出適于具體情形或材料的許多改進。其目的在于，本發明不限于如具體實施方式
所公開的用于執行本發明的具體實施例，而是本發明將包括落入權利要求范圍內的所有實施例和等價物。
引用 1.Unger等，Science 288，113-116(2000) 2.通過“盲填充”裝載樣本通道和控制線-PDMS是充分透氣的，以幾個磅/平方英寸(psi)壓縮的液體將氣體趕出通道，剩下完全由液體填充的它們。參見Hansen等，PNAS 99，16531-16536(2002) 3.人β肌動蛋白基因的294bp片段被使用5′核酸外切酶分析(Taqman)擴增。前向和逆向引物序列分別是5′-TCACCACACTGTGCCCATCTACGA-3′和5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。圖1b是使用基于TAMRA的FRET探針，序列5′-(FAM)ATGCCC-X(TAMRA)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3′采取的。圖1c中的數據是使用基于黑-猝滅劑的探針采取的，由于大量這些引物探針套開始能夠商業提供。反應包含1×Taqman緩沖液A(50nMKCL，10nM Tris-Hcl，0.01MEDTA，60nM Passive Reference 1，pH 8.3)，4mM MgC12，200nMdATP，dCTP，dTTP，400nMdUTP，300nM前向引物，300nM逆向引物，200nM探針，0.01U/μlAmperase UNG(全部來自Applied Biosystems，Foster市，CA)，0.2U/μlDyNAzyme(Calbiochem，San Diego，CA)，5.0％甘油，去離子水和人男性基因組DNA(Promega)。
4.定量PCR技術。關于“基因定量”章節，LJ McBride，K Livak，M Lucero，等，編輯，Francois Ferre，Birkauser，Boston，MA，p97-110，1998。
見E.T.Lafally，I.Medntz，R.A.Mathies，Anal Chem73(3)，565-570(2001)，和B.Vogelstein，K.W.Kinzler，PNAS96，9236-9241(1999)。
理解的是，這里所示例子及實施例僅僅用于說明目的，其中闡述的各種改變或變化將給予本領域技術人員建議，并且被包含在本申請的宗旨和條款及附加的權利要求書的范圍內。這里列舉的全部公開、專利和專利申請通過以其全文應用用于所有目的而被結合，在相同程度上，與各個單個公開、專利和專利申請被專門和單獨地指示一樣，通過應用被結合。
權利要求
1.一種隨時間在選擇溫度處或溫度范圍內實施反應的方法，所述方法包括
提供用于包含多個分離反應腔的陣列設備，所述陣列設備包括由多層形成的彈性塊，其中至少一層具有形成在其中的至少一個凹槽，所述凹槽具有與凹槽可集成所述層的至少一個可偏轉的隔膜，陣列設備另外包括接近至少一個反應腔的熱傳遞設備，熱傳遞設備被成形以接觸熱控制源；
引入陣列設備試劑，用于執行想要的反應；和
使陣列設備接觸熱控制設備，從而熱控制設備處于與熱控制源相熱連通中，以使至少一個反應腔中的反應溫度隨熱控制源的溫度改變而改變。
2.如權利要求1中所述方法，其中熱傳遞設備包括半導體。
3.如權利要求1中所述方法，其中熱傳遞設備包括硅。
4.如權利要求1中所述方法，其中熱傳遞設備包括反射材料。
5.如權利要求1中所述方法，其中熱傳遞設備包括金屬。
6.如權利要求1中所述方法，其中熱控制設備適于將作用力施加到熱傳遞設備，以將熱傳遞設備推向熱控制源。
7.如權利要求6中所述方法，其中作用力包括磁、靜電或真空作用力。
8.如權利要求7中所述方法，其中作用力包括通過形成在熱控制設備或熱傳遞設備的表面中通道施加給熱傳遞設備的真空作用力。
9.如權利要求8中所述方法，進一步包括檢測真空度，所述真空在熱控制設備表面和熱傳遞設備表面之間得到。
10.如權利要求9中所述方法，其中使用真空度檢測器執行檢測真空度，所述真空度檢測器位于距離真空源位置的沿通道或多個通道遠端的位置。
11.如權利要求10中所述方法，其中真空度不超過報警所呈現的或重新校整協議所結合的預設置值。
12.如權利要求1中所述方法，其中通過一個或多個機械或電機械定位設備的使用，執行使陣列設備與熱控制設備的接觸。
13.如權利要求1中所述方法，進一步包括自動控制和監測所述方法的執行。
14.如權利要求13中所述方法，其中使用自動控制設備執行自動控制和監測所述方法的執行，所述自動控制設備與機器人控制設備可操作的相連通，用于從熱控制設備中導入和去除陣列設備。
15.如權利要求1中所述方法，進一步包括監控反應的進程。
16.一種包括權利要求1中所要求的陣列設備的設備。
17.一種包括權利要求9中所述的熱控制設備的單元。
18.一種包括權利要求1中陣列設備和權利要求9中熱控制設備的系統。
19.一種微流體系統，其包括
陣列設備，其用于包含多個分離反應腔，所述分離反應腔被設置在反應區域內且使用設置在反應區域外測的陣列設備的流體入口相流體連通，所述陣列設備包括由多層形成的彈性塊，其中至少一個層具有形成在其中的至少一個凹槽，所述凹槽具有使用凹槽可結合置所述層的至少一個可偏轉隔膜；
載體，其適于保持陣列設備且具有使用流體入口分界的多個流體腔；以及
熱傳遞界面，其包括熱傳導材料，所述熱傳導材料被設置以提供從熱控制源至反應區域的大致均勻的熱連通。
20.如權利要求19中所述微流體系統，其中熱傳導材料是反射性的。
21.如權利要求19中所述微流體系統，其中熱傳導材料包括半導體。
22.如權利要求19中所述微流體系統，其中熱傳導材料包括硅。
23.如權利要求19中所述微流體系統，其中熱傳導材料包括拋光硅。
24.如權利要求19中所述微流體系統，其中熱傳導材料包括金屬。
25.如權利要求19中所述微流體系統，其中反應區域被定位在陣列設備的中心部分，以及流體入口被設置在陣列設備外周邊。
26.如權利要求25中所述微流體系統，其中陣列設備與載體耦合在陣列設備外周邊，以及熱傳導材料與陣列設備表面耦合在反應區域。
27.如權利要求19中所述微流體系統，進一步包括將作用力應用到熱傳遞設備以將熱傳遞設備推向熱控制源的裝置。
28.如權利要求27中所述微流體系統，其中施加作用力的裝置包括將真空源施加至熱傳遞界面的裝置，通過形成在熱控制設備中或熱傳遞設備中的通道。
29.如權利要求28中所述微流體系統，進一步包括真空度檢測器，其用于檢測在熱控制設備表面和熱傳遞設備表面之間得到真空的水平。
30.如權利要求29中所述微流體系統，其中所述真空度檢測器被定位在距離真空源位置的沿通道或多個通道遠端的位置。
31.如權利要求19中所述微流體系統，進一步包括自動控制系統，所述自動控制系統可操作的與機器人控制系統相連通，用于從熱控制設備中導入和去除陣列設備。
32.一種實現彈性材料塊中縱橫比特點的方法，所述方法包括步驟
·提供第一彈性材料層；
·將光致抗蝕劑層應用在所述第一彈性材料層表面上；
·將光圖案應用至所述光致抗蝕劑層，以形成已反應的光致抗蝕劑材料圖案；
·去除未反應的光致抗蝕劑材料，在所述第一彈性材料層的所述表面上剩下已反應的光致抗蝕劑材料圖案；
·將蝕刻劑應用到所述第一彈性材料表面，以蝕刻沒有由已反應的光致抗蝕劑材料的所述圖案所覆蓋的所述第一彈性材料層的所述表面，從而去除沒有由已反應的光致抗蝕劑的所述圖案所覆蓋的所述第一彈性材料層的區域，進而剩下對應于已反應的光致抗蝕劑材料的所述圖案的所述彈性材料層的圖案，
其中從側面看去時，縱橫比等于或大于至少兩倍于特征寬度的長度的高度。
33.如權利要求6中所述的方法，進一步包括去除已反應光致抗蝕劑材料的所述圖案的步驟。
34.如權利要求7中所述的方法，其中通過將粘結帶應用到所述彈性材料層的所述表面和已反應光致抗蝕劑材料的所述圖案而進行所述去除，然后將所述粘結帶與所述彈性材料層分離，同時已反應光致抗蝕劑材料的所述圖案的部分或全部從所述彈性材料層的所述表面被去除。
35.如權利要求6中所述的方法，其中所述光致抗蝕劑是SU8。
36.如權利要求6中所述的方法，其中所述蝕刻劑包括四丁銨氟化物—三水合物。
37.如權利要求6中所述的方法，其中所述特點為通孔。
38.如權利要求11中所述的方法，其中所述彈性材料塊包括粘結在一起的多個彈性材料層，其中兩個或多個彈性材料層具有形成在其中的凹槽，以及一個彈性材料層中的一個凹槽與另一個彈性材料層中的凹槽通過通孔處于連通中。
39.一種用于使M種不同樣本與N種不同試劑反應的微流體設備，其包括
·多個反應單元，各個反應單元包括樣本腔和試劑腔，所述樣本腔和所述試劑腔通過具有與其兩者相關聯的分界閥的分界通道處于流體連通中，所述分界閥用于控制所述樣本腔和所述試劑腔之間的流體連通；
·多個樣本入口，各個與所述樣本腔處于流體連通中；
·多個試劑入口，各個與所述試劑腔處于流體連通中；
其中所述腔中的至少一個包含低聚核苷酸或蛋白質聚合物劑及內部對照(intercollating)染料。
40.如權利要求1中所述微流體設備，其中所述反應單元被形成在彈性塊內，所述彈性塊由粘結在一起的多層構成，以及所述分界閥是可偏轉的隔膜。
41.如權利要求1中所述的微流體設備，其中所述樣本入口與所述樣本腔通過樣本通道處于連通中，以及所述試劑入口與所述試劑腔通過試劑通道處于連通中，所述樣本腔部分和所述試劑腔部分大約互相平行地被定位且各個具有相關聯其兩者的容器閥門，用于控制通過其中的流體連通。
42.如權利要求3中所述的微流體設備，其中所述相關聯于所述樣本腔的所述閥門和相關聯于所述試劑腔的所述閥門可操作地通過公共容器控制通道互相處于連通中。
43.如權利要求4中所述的微流體設備，其中所述公共容器控制通道沿大約垂直所述樣本腔和所述試劑腔中之一的線被定位。
44.如權利要求1中所述的設備，其中內部對照染料是SYBR Green(TM)。
45.一種用于確定蛋白質或低聚核苷酸變性溫度的方法，所述方法包括提供權利要求1中的設備的步驟，改變設備中的溫度，進而檢測染料中的改變。
46.一種將PCR反應容器保持在熱控制設備的熱控制表面的真空使用。
47.如權利要求46中所述的使用，其中容器是微流體設備。
48.如權利要求47中所述的使用，其中容器是彈性材料微流體設備。
49.一種在微流體支撐基底內以使熱傳導局部化的熱傳導插入物的使用。
50.如權利要求49中所述的使用，其中基底是集成載體。
51.如權利要求49中所述的使用，其中熱傳導插入物是硅。
52.如權利要求51中所述的使用，其中硅是拋光的。
53.如權利要求46中所述的使用，其中通過形成在熱控制表面中的與微流體設備接觸的通道，施加真空壓力。
54.如權利要求53中所述的使用，其中微流體設備是彈性材料微流體設備。
55.如權利要求53中所述的使用，其中微流體設備另外包括熱傳導部分。
56.如權利要求55中所述的使用，其中熱傳導部分是硅。
57.一種微流體設備執行PCR的使用，其中PCR設備具有在流體隔離中每平方cm(厘米)面積大于100個反應的反應密度。
58.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于250。
59.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于500。
60.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于750。
61.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于1000。
62.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于1250
63.如權利要求57中所述的使用，其中反應密度大于1500。
64.一種對稱光學系統的使用，所述對稱光學系統具有低于1.5的NA，對包含PCR反應的微流體設備成像。
65.如權利要求64中所述的使用，其中NA低于1.0。
66.一種甘油作為控制線流體的使用。
67.如權利要求66中所述的使用，其中甘油為溶液的一部分。
68.一種PEG溶液作為控制線流體的使用
69.一種自動激勵設備的使用，以控制微流體設備中的PCR反應。
70.如權利要求69中所述的使用，其中激勵設備控制閥門。
71.如權利要求69中所述的使用，其中微流體設備包括彈性塊。
72.如權利要求69中所述的使用，其中在采用熱控制設備的系統中使用自動閥門激勵設備。
73.如權利要求72中所述的使用，其中熱控制設備采用真空，以協助實現與微流體設備的熱接觸。
74.如權利要求69中所述的使用，其中自動閥門激勵設備、計算機控制用于PCR的微流體設備的激勵。
75.如權利要求70中所述的使用，其中閥門包括可偏轉的隔膜。
全文摘要
一種用于執行矩陣反應的M×N矩陣微流體設備，所述設備具有與樣本入口或試劑入口中之一通過通孔相連通的多個反應單元，所述通孔形成在設備的彈性材料塊。提供的方法包括在微流體設備的彈性材料塊的彈性材料層中并行形成通孔的方法，所述方法包括使用已圖案化的光致抗蝕劑掩膜和蝕刻劑蝕刻掉彈性材料塊的彈性材料層中的區域或部分。
文檔編號G01N31/22GK101811074SQ20101015461
公開日2010年8月25日 申請日期2005年5月2日 優先權日2004年5月2日
發明者費德里科·顧特塞德, 馬克·A·恩格, 黃江, 埃默森·全, 羅伯特·格羅斯曼, 菲里普·林, 周厚樸, 吉克·金保爾, 馬丁·皮普瑞茲克, 杰弗里·費塞 申請人:弗盧丁公司