專利名稱：一種污泥中痕量雌激素含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種污泥中痕量雌激素的檢測技術，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯質譜聯用技術對污泥樣品中痕量雌酮和17β-雌二醇含量的檢測方法。
背景技術：
由人與動物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，E1)和17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)，會隨著糞尿排放進入污水處理系統中。同時，畜禽糞便中的雌激素會通過堆肥施用或地表徑流進入水體底泥中。雌激素的排放是不可避免的，近十年來雌激素作為典型的內分泌干擾物受到廣泛關注。有關魚類生殖異常現象的研究結果表明，污水處理廠受納水體中所含ng/L濃度水平的雌激素是導致魚類雌性化生殖異常現象的主要原因物質。歐美等國對多家污水處理廠雌激素濃度及去除效率的調查結果顯示，在污水處理廠出水及受納水體中殘留著ng/L濃度水平的雌激素，表明污水處理廠不能有效去除進水中的雌激素。
污水處理廠剩余污泥經脫水后通常采用填埋處理，污泥中吸附的雌激素可隨地表徑流等過程進入土壤環境，甚至污染地下水，具有潛在的生態風險。因此測定污泥中雌激素的含量，對污水處理系統中雌激素的控制和生態風險評價，具有重要意義。
污泥中雌激素的含量與污水處理工藝、污泥性質及有機質含量等因素有關。由于污泥樣品基體復雜，樣品前處理技術在雌激素檢測中起著重要的作用，如何高效地從污泥樣品中提取雌激素成為了痕量雌激素的分析瓶頸。在對污泥中雌激素的提取方面，單獨采用快速溶劑萃取法或超聲波萃取法等雖然具有分析時間短、有毒溶劑使用量少、萃取效率高等優點，但仍然存在回收率低、重現性差等缺點。近年來，雌激素的儀器檢測技術有了很大的提高，如氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)、氣相色譜-串聯質譜聯用(GC/MS/MS)、液相色譜-質譜聯用(LC/MS)、液相色譜-串聯質譜聯用(LC/MS/MS)等，具有較高的靈敏度和精確度。因此，建立回收率高、重現性好、精確度及精密度高的污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇分析方法，成為研究的關鍵。
發明內容
本發明的目的是針對污泥樣品基體復雜，雌激素痕量存在，前處理技術難度大等問題，擬開發一種回收率高、靈敏度高、準確、快速的分析技術，實現對污泥樣品中痕量雌酮和17β-雌二醇的定量測定。
本發明的技術方案如下 一種污泥中痕量雌激素含量的檢測方法，該方法包括如下步驟 (1)污泥樣品預處理 取1g經冷凍干燥后污泥樣品，加入0.5mL1.5×10-3mol/L的NaN3溶液，攪拌均勻后風干；向上述干燥后的污泥樣品中加入10mL丙酮振蕩30min后，在2000rpm下離心30min，收集上清液，重復兩次；離心后的污泥樣品風干后，采用快速溶劑萃取儀進行萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL，萃取液與上述兩次振蕩離心后的上清液合并混勻得到提取液；快速溶劑萃取條件為溫度60℃，壓力1500pis，靜態提取2次，各8min；Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及10mL超純水，流速為1mL/min；取50mL提取液加入1000mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min；萃取結束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2×3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，洗脫液收集于10mL玻璃離心管中，控制流速為1mL/min；洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩渦混合后冷藏待測。
(2)利用液相色譜-串聯質譜聯用分析雌激素濃度 色譜柱Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm； 梯度洗脫采用甲醇和pH＝10的氨水為流動相，甲醇的比例在0-1.2min內由15％升到70％，1.2-2.0min內升到90％，2.0-3.0min內升到98％，3.0-6.1min維持在98％，6.1-6.2min內降至15％，6.2-10min內維持在15％，以上百分比均為體積百分比； (3)標準曲線的繪制，以外標法進行定量測定 (4)樣品的測定 采集待測污泥樣品，按步驟(1)對污泥樣品進行預處理，再按步驟(2)進行液相色譜-串聯質譜聯用檢測，并與步驟(3)得到的標準曲線比較，通過換算最終得到待測污泥樣品中雌激素的含量。
本發明所述的方法還包括采用同樣的污泥樣品，采用浸泡加標方式按0.5ng/g的添加量加入標準溶液，進行上述預處理并測定雌酮和17β-雌二醇含量，進行回收率計算； 本發明所述污泥中痕量雌激素含量的檢測方法，其中所述雌激素為雌酮和17β-雌二醇。
本發明的有益效果是添加NaN3抑制了微生物的降解作用，回收率較好；采用快速溶劑萃取進行提取，操作簡單，萃取速度快，安全可靠；采用固相萃取進行富集，有機溶劑用量少，富集倍數高，操作簡單；采用液相色譜-串聯質譜聯用進行檢測，檢測限低，具有較高的靈敏度和精確度。本發明提供一種檢測限低、重現性好、靈敏度高、回收率較好、操作簡單易行的分析方法，能夠快速分析污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇的含量。
圖1為200ng/L標準品溶液的色譜圖，出峰順序為E15.69min；E25.63min； 圖2為剩余污泥樣品的色譜圖。
具體實施例方式 下面結合實施例及附圖對本發明的技術方案作進一步的描述。
(1)活性污泥樣品預處理 將活性污泥樣品進行冷凍干燥處理之后，取1g經冷凍干燥后污泥樣品，加入0.5mL NaN3溶液(1.5×10-3mol/L)，攪拌均勻后風干。向上述干燥后的污泥樣品中加入10mL丙酮振蕩30min后，在2000rpm下離心30min，收集上清液，重復兩次。離心后的污泥樣品風干后，利用快速溶劑萃取儀進行萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL。萃取液與上述兩次振蕩離心后的上清液合并混勻得到提取液。快速溶劑萃取條件為溫度60℃，壓力1500pis，靜態提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及10mL超純水，流速為1mL/min。取50mL提取液加入1000mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min。萃取結束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，洗脫液收集于10mL玻璃離心管中，控制流速為1mL/min。洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩渦混合后，待測。
(2)利用液相色譜-串聯質譜聯用分析雌激素濃度 液相色譜-串聯質譜聯用選擇的條件3200QtrapTM型液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1數據處理軟件，美國AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色譜系統，包括四元輸液泵，自動進樣器，美國Agilent公司。
色譜柱Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V；溫度450℃；源內氣體1(GS1，N2)壓力45psi；氣體2(GS2，N2)壓力45psi；氣簾氣體(N2)壓力20psi；掃描方式為多重反應監測(MRM)；碰撞氣(N2)壓力Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水為流動相，流動相梯度條件詳見表1。
表1流動相梯度條件
液相色譜-串聯質譜聯用對雌酮和17β-雌二醇的最低檢測限為200ng/L。
(3)標準曲線的繪制，以外標法進行定量測定 所述的外標法標準曲線的繪制利用分析天平準確稱量2種雌激素，溶于色譜純乙腈內，配置成系列濃度的標準溶液，采用液相色譜-串聯質譜聯用進行分析，分別以雌激素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，得到2條標準曲線，用于測定樣品中分析物的量。圖1為200ng/L標準品溶液的色譜圖。
(4)樣品及回收率的測定 采集待測活性污泥樣品，按步驟(1)對污泥樣品進行預處理，再按步驟(2)進行液相色譜-串聯質譜聯用檢測，并與上述得到的標準曲線比較，通過換算最終得到待測污泥樣品中雌酮和17β-雌二醇的含量。
采用同樣的污泥樣品進行冷凍干燥，取1g冷凍干燥后的污泥樣品，采用浸泡加標方式按0.5ng/g的添加量加入標準溶液，進行預處理并測定雌酮和17β-雌二醇含量，并按照下式進行回收率計算 R-回收率，％； C-添加標準溶液污泥樣品的雌激素含量，ng/g； C0-未添加標準溶液污泥樣品的雌激素含量，ng/g。
本方法的回收率與最低檢測限，如表2所示。
表2本方法的回收率和最低檢測限
以下為利用本發明檢測污水處理廠剩余污泥中痕量雌酮和17β-雌二醇的實施例 采集北京污水處理廠剩余污泥樣品，迅速裝入密封袋中帶回實驗室進行處理分析。污泥樣品先進行冷凍干燥處理。取1g經冷凍干燥后污泥樣品，加入0.5mLNaN3溶液(1.5×10-3mol/L)，攪拌均勻后風干。向上述干燥后的污泥樣品中加入10mL丙酮振蕩30min后，在2000rpm下離心30min，收集上清液，重復兩次。離心后的污泥樣品風干后，進行快速溶劑萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL。萃取液與上述兩次振蕩離心后的上清液合并混勻得到提取液。快速溶劑萃取條件為溫度60℃，壓力1500pis，靜態提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及10mL超純水，流速為1mL/min。取50mL提取液加入1000mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min。萃取結束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，洗脫液收集于10mL玻璃離心管中，控制流速為1mL/min。洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩渦混合后，待測。
利用液相色譜-串聯質譜聯用測定上述待測樣品的雌激素濃度。液相色譜-串聯質譜聯用選擇的條件3200QtrapTM型液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1數據處理軟件，美國Applied Biosystem公司；Agilent 1100高效液相色譜系統，包括四元輸液泵，自動進樣器，美國Agilent公司。色譜柱Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V；溫度450℃；源內氣體1(GS1，N2)壓力45psi；氣體2(GS2，N2)壓力45psi；氣簾氣體(N2)壓力20psi；掃描方式為多重反應監測(MRM)；碰撞氣(N2)壓力Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水為流動相，流動相梯度條件詳見表1。計算結果得到，該污水處理廠剩余污泥中雌酮和17β-雌二醇的含量分別為0.43～1.01ng/g和未檢出～0.67ng/g。圖2為剩余污泥樣品的色譜圖。
權利要求
1.一種污泥中痕量雌激素含量的檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟
(1)污泥樣品預處理
取1g經冷凍干燥后污泥樣品，加入0.5mL 1.5×10-3mol/L的NaN3溶液，攪拌均勻后風干；向上述干燥后的污泥樣品中加入10mL丙酮振蕩30min后，在2000rpm下離心30min，收集上清液，重復兩次；離心后的污泥樣品風干后，采用快速溶劑萃取儀進行萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL，萃取液與上述兩次振蕩離心后的上清液合并混勻得到提取液；所采用的快速溶劑萃取條件為溫度60℃，壓力1500pis，靜態提取2次，各8min；Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及10mL超純水，流速為1mL/min；取50mL上述提取液加入1000mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min；萃取結束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2×3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，洗脫液收集于10mL玻璃離心管中，控制流速為1mL/min，洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩渦混合，冷藏待測。
(2)利用液相色譜-串聯質譜聯用分析雌激素濃度
色譜柱Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm；
梯度洗脫采用甲醇和pH＝10的氨水為流動相，甲醇的比例在0-1.2min內由15％升到70％，1.2-2.0min內升到90％，2.0-3.0min內升到98％，3.0-6.1min維持在98％，6.1-6.2min內降至15％，6.2-10min內維持在15％，以上百分比均為體積百分比；
(3)標準曲線的繪制，以外標法進行定量測定
(4)樣品的測定
采集待測污泥樣品，按步驟(1)對污泥樣品進行預處理，再按步驟(2)進行液相色譜-串聯質譜聯用檢測，并與步驟(3)得到的標準曲線比較，通過換算最終得到待測污泥樣品中雌激素的含量。
2.根據權利要求1所述污泥中痕量雌激素含量的檢測方法，其特征在于，還包括采用浸泡加標方式測定回收率的步驟，添加量為0.5ng/g。
3.根據權利要求1所述污泥中痕量雌激素含量的檢測方法，其中所述雌激素為雌酮和17β-雌二醇。
全文摘要
本發明涉及一種污泥中痕量雌激素的檢測技術，特別是涉及污泥樣品中痕量雌酮和17β-雌二醇含量的檢測方法。本方法將采集好的污泥樣品進行冷凍干燥，添加NaN3并采用丙酮振蕩萃取后，進行快速溶劑萃取，合并上述萃取液，采用固相萃取柱濃縮富集其中的雌激素，采用乙酸乙酯將雌激素從固相萃取柱上洗脫下來，利用液相色譜-串聯質譜聯用分析雌激素濃度。該方法環境友好、易于操作、且回收率較高，能夠快速分析污泥樣品中痕量雌酮和17β-雌二醇的含量。
文檔編號G01N30/08GK101813676SQ20101015399
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者史江紅, 曹金玲, 韓蕊, 楊志峰 申請人:北京師范大學