專利名稱：：一種具有生物活性的導電聚苯胺及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種具有生物活性的導電聚苯胺及其制備方法和應用，具體說，是涉及一種采用原位電化學組合合成(combinatorialsynthesis)方法，使帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體以活性自由基聚合方式與溶液中的苯胺共聚于電極上，一步直接在電極上原位生成具有生物活性的導電聚苯胺，及采用獨立尋址的微電極陣列技術，應用所述的具有生物活性的導電聚苯胺制備功能化微電極陣列。
背景技術：
：導電聚合物因其特殊的結構和優異的物理化學性能，在光學、電磁學和化學等領域具有廣闊的應用前景。近年來，導電聚合物在生物材料領域的應用，取得了一定的研究成果。導電聚合物在生物材料領域中的應用，以作為生物傳感器最為多見。通常情況下，將不同的酶、輔酶、抗體、DNA、甚至細胞和組織等生物活性物質固定于導電聚合物中，形成各種新型的生物傳感器。這種傳感器具有響應性能強，制作過程簡單、可控等特點。在構建導電聚合物生物傳感器過程中，聚合物的合成通常采用操作簡單、易于控制的電化學方法。在聚合過程中，生物活性物質既可與聚合物單體同時聚合到電極表面，也可先與其單體吸附在電極表面，再氧化聚合形成生物識別固態元件。其間，通過有效地控制聚合物電聚合過程，生物活性物質可固定到各種類型的電極或者電極的特定部位，也可將兩種或多種酶等生物活性物質同時固定于同一層聚合膜或分別固定于多層聚合膜上。導電聚合物作為分子導線，其三維立體結構可使電子在生物分子(活性中心)與電極表面直接傳遞，顯著提高生物傳感器的響應特性。通過控制聚合膜的厚度、生物分子在膜中的空間分布、聚合膜的空隙度等指標可以調整生物傳感器的響應特性和選擇性。構建導電聚合物生物傳感器的關鍵是如何將生物活性物質有效地固定在導電聚合膜上，且最大限度地保持其生物活性，形成可長期反復作用的生物識別固態元件。生物活性物質常用的固定方法主要有包埋法、共價法、吸附法和交聯法。其中以包埋法最為多見，該法依賴于電化學聚合而實現，即，在電化學聚合的同時，生物活性物質以包埋的形式固定到導電聚合膜中。目前，導電聚合物生物傳感器的研究雖然取得了一定的成果，但同時也面臨了一些問題。如無常規設備可制造穩定的可重復生產的導電聚合物生物傳感器，這在很大程度上限制了此類傳感器在分析領域的廣泛應用。在導電聚合物中，聚苯胺因其導電性能優良，環境穩定性好，合成工藝簡單，原料成本低廉等優點，被稱為是最有可能實際應用的導電聚合物。然而用傳統方法合成的聚苯胺由于其分子量小，分子鏈中存在缺陷而使其導電性能和力學性能大大降低，從而限制了其實際應用。如中國專利CN1718611，由于其制備工藝的限制，制備的導電聚苯胺脆性較大，韌性較差，并且熱穩定性也不佳。又如中國專利CN1294154，采用乳液聚合的方法，摻雜劑采用十二烷基苯磺酸等，得到一種非常穩定的水相聚苯胺乳液，但是需要用破乳劑對其破乳，使得相應的一系列后續工藝變得復雜，大大增加了聚苯胺的生產成本。原位聚合法，是指單體吸附在其他基材上，通過引發基體表面上的單體聚合，從而獲得聚合物包覆基材表面的功能性復合材料的方法。該方法具有不需要特殊設備、操作簡單、膜厚可控等優點，尤其對找不到合適溶劑的導電聚合物具有優勢既改善了聚苯胺的加工性，又易工業化；既賦予了絕緣基質電學和光學性能，還保持了基質的完整結構。由于存在鏈轉移和鏈終止反應，傳統自由基聚合不能較好地控制分子量及大分子結構。活性自由基聚合具有無終止、無轉移、引發速率遠遠大于鏈增長速率等特點，它的優點在于可控制聚合物的分子量，分子量分布(相同的鏈長)窄，可進行端基官能化，形成立體結構如納米纖維，梳型，星型高分子，嵌段共聚物，接枝共聚物等，是實現分子設計、合成具有特定結構和性能聚合物的重要手段。
發明內容本發明為了解決困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到金屬上而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題，提供了一種具有生物活性的導電聚苯胺及其制備方法和應用。為實現上述發明目的，本發明采用的具體技術方案如下本發明的具有生物活性的導電聚苯胺，具有如下通式通式中的R1為其中的n可為1、2或3;X代/\—(CH2)n—O5表生物活性單元，可以是DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞，優選輔酶R-生物素(Biotin)；通式中的R2可以是氫，也可以是游離于苯胺鄰位和間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環)類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環)醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FM0C或B0C保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。本發明的具有生物活性的導電聚苯胺的制備方法，包括如下具體步驟a)制備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體將帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺與苯胺衍生物的摩爾比為101110；加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑(activator)，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌2040分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液(oxidationsolution)，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=811的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%;室溫下攪拌515分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫5酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入_4°C冰箱備用；b)將步驟a)制備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合，以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在0.51.5伏，30秒總時間以原位合成及電化學沉積的方式在電極上進行共聚，即得具有生物活性的導電聚苯胺。所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷酰胺，優選生物素甘醇亞磷酰胺。所述的苯胺衍生物是指通式為<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>其中的n可為1、2或3；其中的R2可以是氫，也可以是游離于苯胺鄰位和間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環)類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環)醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FM0C或B0C保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。本發明采用獨立尋址的微電極陣列技術，應用所述的具有生物活性的導電聚苯胺制備功能化微電極陣列的方法如下將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片上，此電路上的每個電極由CMOS(互補金屬氧化物半導體)晶體管的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的SRAM(靜態隨機存取記憶體)導通該開關；微電極陣列放置在一個專門設計的流體反應器中，反應器中的反應液為步驟a)制備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成，計算機以數字方式指示微電極陣列響應數字命令來組裝導電聚合物；一旦電極被呼叫到，導電聚合物在該電極下的邏輯電路控制下立即在原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得。所述電極可以是金屬、不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料，優選金屬。所述金屬可選自鉬、銥、鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢或鋁，優選鉬。正因為每個電極都與其下的獨立尋址邏輯電路連接，所以都具有智能傳感和訊號放大功能，當以一定的脈沖波掃描每個電極時，會產生一個微小的偶極化電子信號，此信號因電極所處的生物環境(有無分子識別反應)的變化而略有差異，因此，CMOS的運用提供了前所未有的可重復性，高度靈活的微米和亞微米范圍內合成聚合物微陣列的能力，使生物傳感及無標記分析方法得以成為現實。這種方法大大簡化了含多種內容的蛋白芯片乃至蛋白質文庫的制作，聚苯胺的微觀結構不僅可將蛋白質伸展出電極表面，從而有利于其對目標分子的交互作用；而且它的導電性的優點對蛋白質的快速檢測和進而測定其對目標分子的交互作用(比方說抗體與抗原的作用)也有著無可比擬的優越性。本發明人還研究發現隨著反應的進行，導電聚苯胺分子在形成電流通路的同時不斷延伸，依次從納米顆粒到納米纖維，最后纖維與纖維連接成片狀網絡結構。通過調控單體濃度、電流密度和反應時間等活性自由基聚合條件，可以控制生長成納米纖維。因為納米纖維狀的導電聚苯胺具有納米的三維微觀結構，具有獨特的化學、物理性質，因此，可大幅提高對生物分子或者細胞的檢測靈敏度，大大縮短檢測的反應時間，并且可以實現高通量的實時檢測分析，使生物傳感器實現向微型化、集成化方向的發展。與現有技術相比，本發明的突破點主要有以下幾點1、通過先將生物活性單元引入苯胺衍生物單體中，然后采用原位電化學組合合成方法，一步直接在原位形成具有生物活性的導電聚苯胺，解決了困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到金屬上、而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題。2、通過調控單體濃度、電流密度和反應時間等活性自由基聚合條件，可以控制導電聚苯胺生長成納米纖維狀，從而大幅提高對生物分子或者細胞的檢測靈敏度，大大縮短檢測的反應時間，實現高通量的實時檢測分析，使生物傳感器向集約化、微型化和微功耗方向發展成為可能。3、為無標記的分析方法奠定了基礎，使批量制作蛋白質芯片真正成為可能，第一次從可操作層面上提供了自動化生產蛋白質芯片的可能性并且具有很高的重現性。圖1是本發明中的獨立尋址邏輯電路芯片的結構示意圖；圖中1是指聚合反應驅動電路；2是指通過內部尋址連接導通的電極；3是指通過內部尋址連接的電極但在實驗中有意不通電而保持惰性；圖2是獨立尋址邏輯電路芯片中的微電極陣列以熒光掃描儀(AXOn4200A)掃描得到的照片；圖3是獨立尋址邏輯電路芯片中的微電極陣列在室光下的照片(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到)；圖4是證明電流密度和反應時間與導電聚苯胺的聚合度的關系圖。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明；實施例中所用化學試劑均向美國Sigma-Aldrich公司采購，生物素甘醇亞磷酰胺及接有熒光基團Cy5的卵白素以及供DNA合成之用的活化劑(activator)和氧化溶液(oxidationsolution)是從美國GlenResearch公司采購。實施例1制備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體將生物素甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入苯胺鄰甲醇的無水乙腈溶液，其中生物素甘醇亞磷酰胺與苯胺鄰甲醇的摩爾比為101110;加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌30分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=8:1:1的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌10分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入_4°C冰箱備用即可，本實施例的化學反應式如下7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>1)躲化銨、babi2〉中和類似的合成方法也適用于帶有飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環)類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環)醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FM0C或B0C保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基的苯胺鄰甲醇、苯胺鄰乙醇或苯胺鄰丙醇。實施例2制備具有生物活性的導電聚苯胺將制備得到的帶有生物素取代基的苯胺單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合，以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在1.0伏，30秒總時間以原位合成及電化學沉積的方式在電極上進行共聚，即得具有生物活性的導電聚苯胺。實施例中使用的電極為鉬金屬，可由銥或其他金屬(例如鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢、鋁)或不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料所替代。實施例3制備功能化微電極陣列將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片(見圖1所示)上，此電路上的每個電極由CMOS(互補金屬氧化物半導體)晶體管的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的SRAM(靜態隨機存取記憶體)導通該開關；微電極陣列放置在一個專門設計的流體反應器中，反應器中的反應液為制備得到的帶有生物素取代基的苯胺單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成，計算機以數字方式指示微電極陣列響應數字命令來組裝導電聚合物；一旦電極被呼叫到，導電聚合物在該電極下的邏輯電路控制下立即在原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干，在PH4的緩沖液中對每一電極進行掃描讀數(包括空白和對比(control))，以Axon4200A掃描得到圖2照片，室光下電極的照片見圖3所示(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到，其中圓形為電極，電極周圍為絕緣體)。所述電極可以是金屬、不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料，優選金屬；所述金屬可選自鉬、銥、鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢或鋁，優選鉬。實施例4證明電流密度和反應時間與導電聚苯胺的聚合度的關系實驗使正電荷在不同的脈沖間隔時間在電極上通過，總電荷是由脈沖與時間的積分決定。對數字1，脈沖是2毫秒開，10毫秒關；對數字2，脈沖是4毫秒開，10毫秒關；即對每下一個數字，脈沖開啟時間增加一倍，總時間不變一律為60秒，電壓始終維持在1.0伏，見表1所示。表1數字與脈沖的對應關系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將電極經去離子水清洗后用氮氣吹干，隨即進行光學測量。如圖4所示，數字1勉強可見，數字2以后逐步清晰，數字8呈藍色，說明隨著電流密度的增大和反應時間的延長，導電聚苯胺的聚合度逐漸增大，聚苯胺的氧化態逐步增高。權利要求一種具有生物活性的導電聚苯胺，其特征在于，具有如下通式通式中的R1為其中的n為1、2或3；X代表生物活性單元；通式中的R2是氫，或是游離于苯胺鄰位或間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。FSA00000084192900011.tif,FSA00000084192900012.tif2.根據權利要求1所述的具有生物活性的導電聚苯胺，其特征在于，所述生物活性單元是DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞。3.根據權利要求2所述的具有生物活性的導電聚苯胺，其特征在于，所述生物活性單元是輔酶R-生物素。4.一種權利要求1所述的具有生物活性的導電聚苯胺的制備方法，其特征在于，具體步驟如下a)制備帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體將帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺與苯胺衍生物的摩爾比為101110;加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌2040分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=811的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌515分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入_4°C冰箱備用；b)將步驟a)制備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合，以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在0.51.5伏，30秒總時間以原位合成及電化學沉積的方式在電極上進行共聚，即得具有生物活性的導電聚苯胺。5.根據權利要求4所述的具有生物活性的導電聚苯胺的制備方法，其特征在于，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷酰胺。6.根據權利要求5所述的具有生物活性的導電聚苯胺的制備方法，其特征在于，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指生物素甘醇亞磷酰胺。7.根據權利要求4所述的具有生物活性的導電聚苯胺的制備方法，其特征在于，所述的苯胺衍生物是指通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中的η為1、2或3；其中的R2是氫，或是游離于苯胺鄰位或間位的飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。8.一種應用權利要求1所述的具有生物活性的導電聚苯胺制備的功能化微電極陣列，其特征在于，制備方法如下將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)晶體管的開關連接，通過發送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個專門設計的流體反應器中，反應器中的反應液為制備得到的帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體與其摩爾量的110倍的苯胺及適量作為電解質的氯化鉀混合而成，計算機以數字方式指示微電極陣列響應數字命令來組裝導電聚合物；一旦電極被呼叫至IJ，導電聚合物在該電極下的邏輯電路控制下立即在原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得。9.根據權利要求8所述的功能化微電極陣列，其特征在于，所述電極是金屬、不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料。10.根據權利要求9所述的功能化微電極陣列，其特征在于，所述電極為鉬金屬。全文摘要本發明公開了一種采用原位電化學組合合成方法，使帶有生物活性單元的苯胺衍生物單體以活性自由基聚合方式與溶液中的苯胺共聚于電極上，一步直接在電極上原位生成具有生物活性的導電聚苯胺，及采用獨立尋址的微電極陣列技術，應用所述的具有生物活性的導電聚苯胺制備功能化微電極陣列的技術。本發明解決了困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到金屬上、而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題，為無標記的分析方法奠定了基礎，可使生物傳感器實現向微型化、集成化方向的發展，第一次從可操作層面上提供了自動化生產蛋白質芯片的可能性，可以推動物聯網產業鏈的發展，具有深遠的社會意義和廣闊的市場價值。文檔編號G01N27/327GK101812176SQ20101014603公開日2010年8月25日申請日期2010年4月13日優先權日2010年4月13日發明者王巍申請人:無錫中美億芯生物科技有限公司