專利名稱：：一種血清總膽汁酸的測定方法
技術領域：
：本發明涉及一種測定血清中總膽汁酸的方法，具體涉及一種采用電化學發光測定血清中總膽汁酸的分析方法，屬于臨床生化分析領域。
背景技術：
：膽汁酸(bileacid，BA)是內源性膽固醇在肝臟內的主要代謝產物，是膽汁中存在的一類膽烷酸的總稱，以鈉鹽或鉀鹽的形式存在，目前認為血清總膽汁酸水平是唯一可同時反映肝臟分泌，肝臟合成與代謝以及肝細胞損傷三方面的血清學指標。肝臟疾病時肝細胞受損可引起膽汁酸合成及排泄障礙，肝細胞內膽固醇7a-羥化酶及12a_羥化酶活力降低，膽汁酸的合成明顯減少。肝細胞攝取膽汁酸功能障礙，使膽汁酸從血中的清除速率減慢，導致血中膽汁酸的濃度升高，尿中膽汁酸的排出量可達正常人的10倍以上。膽汁酸的毒性作用又加重肝細胞損害，使肝功能進一步惡化。體內膽汁酸鹽不足，影響脂類和脂溶性維生素的吸收和代謝，可發生乳糜瀉及暗適應障礙等。在淤膽時，小腸和腎臟上皮轉運體通過調整，減少對膽汁酸的吸收，而在尿液中的排泄增加；同時，肝細胞通過核受體調節，使膽鹽轉運體改變，同時產生細胞因子，減少肝內膽鹽的積蓄，減輕肝損傷。臨床發現，總膽汁酸的測定與谷草轉氨酶，谷丙轉氨酶等生化檢查項目有同等的診斷效率，且體內總膽汁酸在反映肝功能改變上早于其它生化檢查的變化，更具有特異性和靈敏性，是反映肝膽功能的重要指標。目前檢測總膽汁酸的方法有氣相色譜、高效液相色譜、毛細管電泳(CE)和酶循環放大法。不管是氣相或液相色譜法測定總膽汁酸都需要衍生和水解，較為繁瑣，不適合臨床檢測。目前有關膽汁酸的CE檢測大都采用紫外檢測，檢測靈敏度較低，使其應用受到限制。而臨床使用的酶循環放大法測定總膽汁酸成本較高，且靈敏度也有待進一步提高。
發明內容本發明的目的是提供一種血清總膽汁酸的測定方法，本發明方法是采用毛細管電泳_酶促電化學發光測定總膽汁酸，本發明測定方法可達到快速簡便地測定血清中的總膽汁酸，適合用于臨床診斷與監測；且靈敏度高，可實現微量樣品的痕量測定分析；同時可實現酶和試劑的多次重復使用、成本低。本發明的目的是這樣實現的—種血清總膽汁酸的測定方法，其特征在于毛細管電泳血清樣品聚集膽汁酸，進入柱端檢測池的膽汁酸在氧化型輔酶I(NAD)+共存下經3a-類固醇脫氫酶(3a-HSD)催化脫氫，同時NAD+被還原為還原型輔酶I(NADH)；而生成的NADH在恒電位作用下被三聯吡啶釕(Ru(bpy)32+)氧化為NAD+，同時釋放出光子被記錄，從而按常規定量總膽汁酸。上述檢測池為柱端檢測池，上述三聯吡啶釕(Ru(bpy)32+)的濃度為35mmol/L，上述3a類固醇脫氫酶(3a-HSD)活性為150200U/L，上述氧化型輔酶I(NAD+)存在于7075mmol/LpH7.88.0的磷酸鹽緩沖液中，其在所述緩沖液中的濃度為603150nmol/L。上述檢測池采用三電極工作體系，其中工作電極為直徑500iim的鉬圓盤電極，輔助電極為直徑1mm的鉬絲對電極，參比電極為直徑300iim的Ag/AgCl參比電極(內充飽和KC1溶液)，檢測電壓1.171.18V，光電倍增管高壓為-700V。上述血清樣品是將血清用水稀釋后采用電動進樣至毛細管內，其進樣電壓為10KV，進樣時間為60s。上述毛細管為開口石英毛細管，其內徑為25iim，外徑為365iim，總長度50cm，有效長度為45cm。膽汁酸通過毛細管電泳聚集，所述毛細管電泳的運行緩沖液為含5lOnmol/LNAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸鹽緩沖液，運行電壓15KV，運行時間400s。具體地說上述柱端檢測池采用傳統的三電極體系工作電極為直徑為500iim的鉬圓盤電極，輔助電極為直徑為1mm的鉬電極，參比電極為直徑為300ym的Ag/AgCl電極(內充飽和KC1溶液)，通過檢測池的定位螺絲將毛細管和工作電極準直，調節毛細管與電極之間的距離約150ym。將電化學發光檢測池放入發光檢測儀的暗盒中，使透光窗正對光電倍增管，Ru(bpy)32+的電化學發光被光電倍增管收集并轉換為電信號記錄下來。檢測池中為7075mmol/L,pH7.88.0的磷酸鹽緩沖液，內含35mmol/L的Ru(bpy)32+，150200U/L的3a-HSD，60150nmol/L的NAD+。檢測池內容物每3h更換一次，以減小溶液蒸發和反應產物對檢測的影響。開口石英毛細管內徑為25iim，外徑為365iim，總長度50cm，有效長度為45cm。毛細管電泳的運行緩沖液為含510nmol/L的NAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸鹽緩沖液。每次實驗前分別用0.lmol/LNaOH、純水、運行緩沖液沖洗20min，毛細管進樣端放入運行緩沖液中，打開電化學分析儀和發光分析儀，待發光信號基線穩定后采用電動進樣方式在10KV電壓下進樣60s，然后施加15KV的電泳高壓400s進行分離檢測，光電倍增管負高壓為700V。恒電位設為1.171.18V。實驗室恒溫25°C。兩次進樣電泳間依次用純水、運行緩沖液沖洗毛細管3min。本發明的各種特征如下本發明采用已商品化的多參數電化學發光測定分析裝置，實施總膽汁酸的測定和研究。本發明使用的酶類3a-HSD、NAD+，Ru(bpy)32+均已商品化。本發明的有益效果是(1)本發明顯著降低了貴重酶試劑，化學試劑和生物樣本用量，減少廢液，顯著提高靈敏度，實現不連續的批量臨床樣品快速測定。(2)本發明將CE技術的分離能力和Ru(bpy)32+電化學發光(ECL)的高靈敏度檢測相結合，以酶促反應和進行膽汁酸的柱后衍生，建立了CE-ECL定量總膽汁酸的新方法，本發明兼備了ECL分析高靈敏度和CE分離能力強的特點，具有檢測限低、分離速度快、取樣體積小、溶劑消耗少和樣品預處理簡單等優點，無疑是一種更理想的總膽汁酸測定方法。(3)用電化學發光代替常規的可見光測定，實現微量樣品酶促電化學發光分析；(4)酶在三電極體系中可以重復使用多次，克服了常規情況下酶被進樣量稀釋后不穩定的弱點，能大大節約酶、輔酶和其它化學試劑的用量，顯著降低了實驗成本和化學廢4液，有利于臨床推廣；(5)本發明無須對樣品進行前處理，可以實現直接測定，操作簡便；(6)本發明試劑種類少，可以進行不連續的批量的臨床樣品測定；本發明可用于生物樣品的總膽汁酸測定，適用于臨床肝膽疾病的快速篩查和診斷。圖1為本發明使用的多功能發光檢測器的暗盒示意中1毛細管、2光電倍增管、3參比電極、4工作電極、5檢測池、6輔助電極圖2為本發明考察檢測池中緩沖溶液的pH對ECL強度影響的曲線3為本發明考察檢測池中緩沖溶液濃度對ECL強度影響的曲線4為本發明考察檢測池中Ru(bpy)32+濃度對ECL強度影響的曲線5為本發明考察檢測電壓對ECL強度影響的曲線6為本發明考察檢測池中3a-HSD酶活性對ECL強度影響的曲線7為本發明考察檢測池中NAD+濃度對ECL強度影響的曲線8為本發明考察運行緩沖液pH對ECL強度影響的曲線9為本發明考察運行緩沖液濃度對ECL強度影響的曲線10為本發明考察運行緩沖液中NAD+的濃度對ECL強度的影響圖11為本發明膽汁酸標準品與血清CE電泳圖譜具體實施例方式結合附圖對本發明的實施例作進一步描述實施例1本實施例是考察檢測池中緩沖溶液pH對ECL信號的影響。實驗條件將電化學發光檢測池放入發光檢測儀的暗盒中，使透光窗正對光電倍增管(如圖1)，光電倍增管高壓為-700V。該電化學發光檢測池采用三電極體系工作電極為直徑為500um的鉬圓盤電極，輔助電極為直徑為1mm的鉬電極，參比電極為直徑為300iim的Ag/AgCl電極(內充飽和KC1溶液)，檢測電壓1.17V。開口石英毛細管內徑為25iim，外徑為365iim，總長度50cm，有效長度為45cm。運行緩沖液為含5nmol/LNAD+的5mmol/LpH7.0的PBS。毛細管進樣端放入運行緩沖溶液中，打開電化學分析儀和發光檢測儀，待發光信號基線穩定后采用電動進樣方式，在10KV電壓下進樣60s，分離電壓15KV。檢測池中為75mmol/L的PBS，含5mmol/LRu(bpy)32+,167U/L3a-HSD,70nmol/LNAD+。在5.59.0范圍內改變PBS的pH值，結果見圖2。PBS的pH7.88.0時，可獲得最大的ECL強度。實施例2本實施例是考察檢測池中PBS濃度對ECL信號的影響。基于以上條件，緩沖溶液pH值設定為8.0，在25lOOmmol/L范圍內改變緩沖溶液的濃度，考察其對ECL強度的影響，結果如圖3。當磷酸鹽濃度不超過75mmol/L時體系ECL強度隨緩沖溶液濃度增加而增大，并且信號穩定性良好；濃度過大時，焦耳熱效應加劇，ECL強度雖增加，但峰形明顯展寬、信噪比變小。因此實驗選擇檢測池中磷酸鹽緩沖液的濃度為7075mmol/L。實施例3本實施例是考察檢測池中Ru(bpy)32+濃度對ECL強度的影響。基于以上條件，在120mmol/L范圍內改變Ru(bpy)32+濃度，考察Ru(bpy)32+濃度對本發明靈敏度的影響，如圖4所示。ECL強度隨著Ru(bpy)32+濃度的增加而增強，當濃度超過5mmol/L時，發光信號強度降低。檢測池中Ru(bpy)32+設定為35mmol/L。實施例4本實施例是考察檢測電壓對ECL強度的影響。其它實驗條件同實施例1，檢測電壓在1.053.0V范圍變化，考察檢測電壓對ECL強度的影響，結果如圖5所示。當檢測電壓在1.151.20V之間時，電化學發光強度達到較大值，且噪音也較低，設定恒電壓為1.171.18V。實施例5本實施例是考察檢測池中3a-HSD酶活性對ECL強度的影響。其它實驗條件同實施例1。在20850U/L范圍內改變3a-HSD酶濃度，考察3a-HSD酶對本發明靈敏度的影響，結果見圖6。在100400U/L范圍內ECL信號都較高且穩定，但考慮到進樣后溶液的稀釋和蒸發，應該適當增加酶濃度，故選擇3a-HSD酶用量為150200U/L。實施例6本實施例是考察檢測池中NAD+濃度對ECL強度的影響。在10500nmol/L范圍內改變NAD+濃度，考察NAD+濃度對本發明靈敏度的影響，結果如圖7所示。NAD+的濃度在50500nmol/L范圍內均可以保證反應的進行，過多的NAD+會降低ECL強度。故NAD+的用量選擇60150nmol/L。實施例7本實施例是考察運行緩沖液的pH對ECL強度的影響。運行PBS的pH值在4.010.0范圍內對毛細管電泳分離和ECL檢測強度的影響，結果如圖8所示。當磷酸鹽pH值為7.0時，體系的ECL信號最強，電泳峰形狀好，pH值低于6.0時沒有ECL信號。本發明選擇運行緩沖液的pH為7.07.2。實施例8本實施例是考察運行緩沖液濃度對ECL強度的影響。在175mmol/L范圍內改變運行緩沖液即磷酸鹽濃度，考察緩沖液濃度對本發明靈敏度的影響，結果如圖9所示。保持pH值不變的條件下，濃度較高時，電泳峰略高，但峰形變差且噪音較大。隨著緩沖液濃度降低，峰形變好且噪音變弱。故本實驗運行緩沖液即磷酸鹽濃度為5lOmmol/L。實施例9本實施例是考察運行緩沖液中NAD+的濃度對ECL強度的影響。在運行緩沖液中添加NAD+是為了膽汁酸在柱端發生酶促反應時與輔酶NAD+已充分混合，利于反應的完成。實驗表明NAD+會出現過載或不足的情況。NAD+過載時易引起毛細管的堵塞，而NAD+不足反應又不能進行完全，其結果見圖10，選擇運行緩沖液中NAD+為46nmol/L。實施例10本實施例是考察本發明的回收率，取含膽汁酸濃度為低值和高值的二份血清樣品，按樣品標準=91的體積比，在二份血清中分別加入高、中、低濃度的甘氨膽酸(glycocholicacid,GCA)標準溶液，進行回收率實驗，結果見表1。本發明的加標回收率在91.5%102.3%之間，表明本發明測定血清的膽汁酸濃度是準確可靠的。表1回收率(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例11本實施例是為了考察本發明的抗干擾能力，干擾物質為血清標本中常見的溶血和黃疸。按照美國國家臨床實驗室標準委員會制定的干擾試驗的評價方案進行，即測定未加膽紅素標準品的血清總膽汁酸濃度(Xc)和加入膽紅素標準品后的膽汁酸濃度(XT)，干擾值(=XT-Xc)在本發明方法的1.96S(即95%可信度)范圍內為無顯著干擾(用N表示)，如干擾值超過1.96S，即為有顯著干擾(用I表示)。得到20i!mOl/L膽汁酸所能容忍的干擾濃度為850iimol/L膽紅素和16.3g/L血紅蛋白，結果見表2。表2干擾物質對總膽汁酸測定的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求一種血清總膽汁酸的測定方法，其特征在于毛細管電泳血清樣品聚集膽汁酸，進入柱端檢測池的膽汁酸在氧化型輔酶I(NAD+)共存下經3α-類固醇脫氫酶(3α-HSD)催化脫氫，同時NAD+被還原為還原型輔酶I(NADH)；而生成的NADH在恒電位作用下被三聯吡啶釕(Ru(bpy)32+)氧化為NAD+，同時釋放出光子被記錄，從而按常規定量總膽汁酸。2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測池為柱端檢測池，所述三聯吡啶釕(Ru(bpy)32+)的濃度為35mmol/L，所述3α-類固醇脫氫酶(3α-HSD)活性為150200U/L，所述氧化型輔酶I(NAD+)存在于7075mmol/LpH7.88.0的磷酸鹽緩沖液中，其在所述緩沖液中的濃度為60150nmol/L。3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述檢測池采用三電極工作體系，其中工作電極為直徑500μm的鉬圓盤電極，輔助電極為直徑Imm的鉬絲對電極，參比電極為直徑300μm的Ag/AgCl參比電極(內充飽和KCl溶液)，檢測電壓1.171.18V，光電倍增管高壓為-700V。4.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血清樣品是將血清用水稀釋后采用電動進樣至毛細管內，其進樣電壓為10KV，進樣時間為60s。5.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述毛細管為開口石英毛細管，其內徑為25μm,外徑為365μm,總長度50cm，有效長度為45cm。6.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于膽汁酸通過毛細管電泳聚集，所述毛細管電泳的運行緩沖液為含510nmol/LNAD+的46mmol/LpH7.07.2的磷酸鹽緩沖液，運行電壓15KV，運行時間400s。全文摘要一種血清總膽汁酸的測定方法，其特征在于毛細管電泳血清樣品聚集膽汁酸，進入柱端檢測池的膽汁酸在氧化型輔酶I(NAD)+共存下經3α-類固醇脫氫酶(3α-HSD)催化脫氫，同時NAD+被還原為還原型輔酶I(NADH)；而生成的NADH在恒電位作用下被三聯吡啶釕(Ru(bpy)32+)氧化為NAD+，同時釋放出光子被記錄，從而按常規定量總膽汁酸。本發明方法顯著降低了貴重酶試劑，化學試劑和生物樣本用量，減少廢液，顯著提高靈敏度，實現不連續的批量臨床樣品快速測定。文檔編號G01N27/447GK101825609SQ201010145678公開日2010年9月8日申請日期2010年4月14日優先權日2010年4月14日發明者丁敏,張曉清,王箭,鄧文平申請人:重慶醫科大學