專利名稱：一種體外檢測鋅-a2-糖蛋白的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學領域，具體涉及檢測血清或尿液等體液中脂肪動員因子鋅-a2-糖蛋白(ZAG)的試劑盒和方法。
背景技術：
鋅-a2_糖蛋白(ZAG)是存在于血漿及多種體液中的一種蛋白質，主要功能是促進脂肪動員分解，減少脂肪含量，故又名脂肪動員因子。ZAG是一種約41KD大小的可溶性蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，與主要組織相容性復合物(MHC)I類分子a鏈的氨基酸序列有 30% -40% 同源。ZAG廣泛分布于體液中，以及脂肪組織，前列腺，乳房，皮膚，肺，胰臟，肝，腎等多種組織中。ZAG作為一種脂肪動員因子能促進脂肪分解，在脂肪利用和減少脂肪含量中發揮重要作用，特別是在惡病質患者中例如忍受癌癥、艾滋病和其他長期性疾病的病人患者當中。 ZAG在惡性腫瘤惡病質中能夠直接影響與能量平衡調節密切相關的非偶聯蛋白質(UCPs) 的表達。在人脂肪組織中，通過TM^a和PPAR γ核受體來調節ZAG的表達。ZAG的表達還受到糖皮質激素的上調和EPA和β _3_腎上腺素受體抑制劑的下調影響。ZAG的表達受交感神經系統、糖皮質激素及某些細胞因子的調節，地塞米松、腎上腺素受體類似物BRL37344等能增加ZAG mRNA的表達；多元不飽和脂肪酸EPA和腫瘤壞死因子 TNF- α等能明顯抑制ZAG的mRNA水平。ZAG在一些特定的人類惡性腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌或膀胱癌等分化性腫瘤中過量表達。此外，ZAG在肥胖癥，糖尿病患者的腎臟紊亂和黑色素產生中發揮重要作用。ZAG推測能在肥胖癥和惡病質中起治療作用，并能作為腎臟性糖尿病患者和一些特定惡性腫瘤中的一種診斷性指標。臨床研究表明，ZAG與原發性前列腺癌、乳腺癌及其引起的惡病質狀況有密切關聯，有明顯惡病質的腫瘤患者血漿中ZAG的含量是年齡、性別匹配正常人的20倍；惡病質患者腫瘤組織中ZAG的表達比不具有惡病質患者腫瘤組織中ZAG 的表達明顯高；惡病質腫瘤患者尿中含有大量ZAG，而在不具有惡病質的患者和正常人的尿中，檢測不到ZAG ；血、尿ZAG的水平和體重減少存在明顯的相關關系，ZAG水平越高，體重減少越多。目前用于ZAG檢測的試劑盒有酶聯免疫ELISA試劑盒，采用抗ZAG多克隆抗體進行檢測，不僅測定步驟多、時間長、使用不方便，且存在特異性較差、準確性參差不齊、線性范圍窄，這些因素大大限制了酶免試劑盒的推廣與應用。因此，本領域迫切需要開發更快速、更準確、更方便的ZAG檢測試劑盒，以滿足準確、快速檢測ZAG指標的需求。
發明內容
本發明旨在提供一種體外檢測鋅-a2_糖蛋白的方法。本發明還提供了用于體外檢測鋅-a2_糖蛋白的試劑盒。
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一種用于體外檢測鋅-a2-糖蛋白(ZAG)的方法，包括如下步驟(1)將待測樣品和帶有標記物的抗ZAG蛋白的單克隆抗體分別加入包被ZAG的固相載體的樣品孔中，從而使樣品孔中固相的ZAG和游離的ZAG分別與帶有標記物的抗ZAG 蛋白的單克隆抗體形成固相載體-ZAG-單克隆抗體-標記物和游離-ZAG-單克隆抗體-標記物這兩種二元復合物；(2)洗滌后檢測固相載體-ZAG-單克隆抗體-標記物，并用與標記物相對應的底物進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號，從而確定待測樣品中ZAG存在與否以及存在的量。上述固相載體的材料可選用聚丙乙烯多孔板，硝酸纖維素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。上述的標記物可選用辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酯酶(AP)，葡萄糖氧化酶， β -D-半乳糖苷酶，脲酶，過氧化氫酶，或葡萄糖淀粉酶。與標記物相對應的底物是指可被單克隆抗體上的標記物所催化顯色，用于顯示抗體與ZAG結合的信號，例如用于辣根過氧物酶的鄰苯二胺(0PD)、四甲基聯苯胺(ΤΜΒ)、 ABTS ；用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯。所述的固相載體的材料可選用聚丙乙烯多孔板，硝酸纖維素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。固相載體上樣本孔的數量為1 197個。用于體外檢測鋅-a2_糖蛋白(ZAG)的試劑盒，包括包被ZAG的固相載體和容器a， 容器a中含帶有標記物的抗ZAG蛋白的單克隆抗體。所述的固相載體的材料可選用聚丙乙烯多孔板，硝酸纖維素膜(NC膜)，或聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。固相載體上樣本孔的數量為1 197個。更優選的，上述試劑盒還包括裝有ZAG標準品的容器b、裝有與標記物相對應的底物的容器C、裝有顯色劑的容器d、裝有洗滌劑的容器e和裝有中止液的容器f。標記物可選用辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酯酶(AP)，葡萄糖氧化酶， β -D-半乳糖苷酶，脲酶，過氧化氫酶，或葡萄糖淀粉酶。與標記物相對應的底物是指可被單克隆抗體上的標記物所催化顯色，用于顯示抗體與ZAG結合的信號，例如用于辣根過氧物酶的鄰苯二胺(0PD)、四甲基聯苯胺(ΤΜΒ)、3， 4，5_三甲氧基苯甲醛(ABTS)；用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯。本發明的基本原理是競爭法，將抗原固定于固相載體上，然后加入抗原和帶標記的抗體，使固相載體上的抗原與液相中的游離抗原和抗體產生競爭性結合作用，反應后進行洗滌，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。當液相中游離抗原含量越高時，則結合固相載體上抗原的抗體越少，被檢測到的信號則越低。ZAG是一種已知蛋白，其氨基酸和核苷酸序列都是本領域已知的。生產ZAG的方法也是已知的。例如，通過常規的DNA重組技術(kience，1984 ； 224 :1431)，可利用ZAG的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的ZAG蛋白，一般來說有以下步驟(1)用編碼人ZAG蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；
(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。上述獲得的重組ZAG蛋白可被加工成具有一定純度的蛋白，用于制備標準品；此外，所述的ZAG也可分離自人體，例如，從人血清或尿液中提取和純化ZAG。制備抗ZAG蛋白的抗體的技術是本領域中眾所周知的，用于本發明的抗體是針對人ZAG具有高度特異性的單克隆抗體。可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol 6 ；511,1976 ；Kohler 等人， Eur. J. Immunol 6 ;292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and Tcell hybridomas,Elsevier,N. Y. , 1981) 0本發明的單克隆抗體可以利用人ZAG基因產物或片斷或功能區，通過常規免疫技術獲得。本發明的試劑盒和檢測方法，靈敏度高，線性范圍寬，能準確檢測血清、尿液中的 ZAG ；而且測定步驟簡單，可大大縮短檢測時間，方便快捷。
圖1為實施例IZAG標準品濃度參考曲線圖2實施例2ZAG標準品濃度檢測范圍和靈敏度測定曲線
具體實施例方式實施例1(1)固相載體反應板的制備取96孔聚苯乙烯板，設置80個樣本孔，2個陰性質控孔，2個陽性質控孔，12個不同濃度標準品孔。在每個反應孔均包被ZAG抗原QOOng/mg)。(2)試劑盒制備制備ZAG檢測的試劑盒，它含有實施例1的反應孔板一塊(13-37人份)，ZAG標準品1瓶(容器b)，高值質控品1瓶，低值質控品1瓶，酶標抗體(帶有辣根過氧化酶的ZAG 特異性單克隆抗體)1瓶(容器a)，底物(鄰苯二胺)1瓶(容器c)，顯色劑1瓶(容器d)， 洗滌液1瓶(容器e)，終止液1瓶(容器f)。表1 ZAG檢測試劑盒檢測不同濃度標準品測定結果
權利要求
1.一種體外檢測鋅-a2-糖蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將待測樣品和帶有標記物的抗ZAG蛋白的單克隆抗體分別加入包被ZAG的固相載體的樣品孔中，從而使樣品孔中固相的ZAG和游離的ZAG分別與帶有標記物的抗ZAG蛋白的單克隆抗體形成固相載體-ZAG-單克隆抗體-標記物和游離-ZAG-單克隆抗體-標記物這兩種二元復合物；(2)洗滌后檢測固相載體-ZAG-單克隆抗體-標記物，并用與標記物相對應的底物進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號，從而確定待測樣品中ZAG存在與否以及存在的量。
2.權利要求1所述檢測鋅_a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述固相載體的材料為聚丙乙烯多孔板、硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。
3.權利要求1所述檢測鋅_a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶。
4.權利要求1和3所述檢測鋅-a2-糖蛋白的方法，其特征在于，所述底物為標記物為辣根過氧物酶時，底物為鄰苯二胺、四甲基聯苯胺、3，4，5-三甲氧基苯甲醛；標記物為堿性磷酸酯酶，底物為對硝基苯磷酸酯。
5.一種體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，包括包被ZAG的固相載體和容器a，容器a中含帶有標記物的抗ZAG蛋白的單克隆抗體。
6.權利要求5所述體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，固相載體的材料為聚丙乙烯多孔板、硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。
7.權利要求5所述體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，所述固相載體的材料為聚丙乙烯多孔板、硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。
8.權利要求5所述體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，還包括裝有ZAG標準品的容器b、裝有與標記物相對應的底物的容器C、裝有顯色劑的容器d、裝有洗滌劑的容器e和裝有中止液的容器f。
9.權利要求5所述體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，所述標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶。
10.權利要求5和9所述體外檢測鋅-a2-糖蛋白的試劑盒，其特征在于，所述底物為 標記物為辣根過氧物酶時，底物為鄰苯二胺、四甲基聯苯胺、3，4，5-三甲氧基苯甲醛；標記物為堿性磷酸酯酶，底物為對硝基苯磷酸酯。
全文摘要
本發明公開了一種體外檢測鋅-a2-糖蛋白ZAG的方法和試劑盒，利用競爭法，將抗原固定于固相載體上，然后加入抗原和帶標記的抗體，使固相載體上的抗原與液相中的游離抗原和抗體產生競爭性結合作用，反應后進行洗滌，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。當液相中游離抗原含量越高時，則結合固相載體上抗原的抗體越少，被檢測到的信號則越低。本發明的試劑盒和檢測方法，靈敏度高，線性范圍寬，能準確檢測血清、尿液中的ZAG；而且測定步驟簡單，可大大縮短檢測時間，方便快捷。
文檔編號G01N33/558GK102207505SQ20101013482
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者吳楊, 蔡興鋒 申請人:上海友科生物科技有限公司