專利名稱：一種在蛋白質水平精確定量檢測抗朊病毒藥物作用效果的方法
技術領域：
本發明涉及一種在酵母細胞中檢測抗朊病毒藥物作用效果的方法，特別涉及一種 在蛋白質水平的精確定量檢測抗朊病毒藥物作用效果的方法。
背景技術：
朊病毒是一類能在動物和人中引起可傳染性腦病(包括瘋牛病、羊搔癢癥、庫魯 病、克雅氏病等)的病原體，其高度傳染性和致死性對整個社會造成了極大的危害。關于 朊病毒的分子致病機理和治療藥物篩選、開發的研究是國際上生物學、醫學領域研究的前 沿和熱點。目前國際上一般使用SDS-PAGE/Western Blot來在蛋白質水平通過檢測細胞內 朊病毒蛋白聚集體的可溶性的變化來評估抗朊病毒藥物的作用效果，這種方法首先通過高 速離心將細胞內可溶狀態的單體朊蛋白與不可溶狀態的聚集體朊蛋白分開，然后分別進行 SDS-PAGE/Western Blot，從而通過條帶的有無以及條帶亮度來判斷細胞內的朊病毒的聚 集狀態。盡管這是一種行之有效的方式，但是使用這種方法不能夠定量測定朊病毒蛋白聚 集體的分子量大小的變化。而朊病毒蛋白聚集體的分子量大小是其致病性、傳染性的根本 原因，其聚集體的分子量大小的變化是抗朊病毒藥物作用效果的重要指標。因此，尤其是在 基于酵母細胞的抗朊病毒藥物篩選中，需要一種更為有效的方法來對藥物的作用效果進行 精確地檢測與評估。
發明內容
針對國際上不能夠定量測定朊病毒蛋白聚集體的分子量大小的變化的不足，本發 明提供一種新型的采用半變性瓊脂糖凝膠電泳結合蛋白質印跡的方法(SDD-AGE/Western blot)，用瓊脂糖凝膠電泳來定量檢測朊病毒蛋白聚集體的分子量大小的變化，以解決測定 朊病毒蛋白聚集體的分子量大小方面的技術問題。本發明使用的菌種為野生型釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)，來自于美國標準菌種庫(American Type Culture Collection, ATCC)，保藏編號 為208719。這種野生型釀酒酵母細胞帶有[PSI+]朊病毒，即Sup35p呈聚集狀態，表現為 較大的分子量，菌落顏色表現為白色；經藥物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的藥物促進 Sup35p聚集體解聚的能力不同，從而表現出不同的分子量，菌落的顏色也隨著聚集體的變 化而變化——Sup35p聚集體越小菌落顏色越深，即隨著Sup35p聚集體從大到小，菌落依次 表現為白色，粉色，紅色。徹底治愈的細胞內Sup35p完全解聚呈單體，表現為恒定的較小的 分子量(約為74kDa)，菌落顏色表現為紅色，稱為[psil細胞。本發明采用的技術方案是一種在蛋白質水平精確定量檢測抗朊病毒藥物作用效 果的方法，其步驟如下1)釀酒酵母細胞的活化取釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)接入 YPD 液體培養基中，30°C水浴振蕩培養18h，然后進行酵母菌初始0D值的調試，調制菌懸液0D, = 0.5；2)抗朊病毒藥物的初篩選取無菌凍存管，加入待測藥物、YPD液體培養基以及調試好的釀酒酵母細胞菌懸 液，在24°C的條件下，振蕩培養，每天定時取前一天凍存管中的釀酒酵母細胞放入新的裝有 YPD液體培養基和待測藥物的無菌凍存管中，振蕩培養1 5天，每天取菌懸液少量稀釋涂 平板到1/2YPD固體培養基上，通過觀察菌落顏色的變化初步判斷待測藥物的治療效果；Sup35p呈聚集狀態時，朊病毒蛋白聚集體表現為較大的分子量，菌落顏色表現 為白色；經藥物作用后，聚集的Sup35p解聚，菌落的顏色也隨著聚集體的變化而變化—— Sup35p聚集體越小菌落顏色越深，即隨著Sup35p聚集體從大到小，菌落依次表現為白色， 粉色，紅色。徹底治愈的細胞內Sup35p完全解聚呈單體，表現為恒定的較小的分子量(約 為74kDa)，菌落顏色表現為紅色。3)定量檢測抗朊病毒藥物的作用效果釀酒酵母細胞裂解液的制備取經藥物治療不同時間后稀釋涂平板在1/2YPD上 長出的單菌落，按菌落顏色分組，每組挑取3-5個單菌落接種到10ml YPD液體培養基中活 化18h，然后再以的接種量接種到50mlYPD液體培養基中擴大培養12h，離心收集細胞， 然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細胞，離心收集上清得到蛋白樣品；瓊脂糖凝膠電泳用含0. 1 %十二烷基硫酸鈉(SDS)的TBE配制1. 5%瓊脂糖凝 膠，用含0. 5% SDS的上樣緩沖液于42°C溫育蛋白樣品lOmin，然后將蛋白樣品在100V，4°C 的條件下電泳至凝膠前沿，再將蛋白濕法電轉移到PVDF膜上，進行免疫印跡反應，并曝光X 光片獲得圖像信息；4)用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析。本發明中，朊病毒被治愈的釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)中Sup35p呈單體可溶狀態，未被治愈的細胞中Sup35p聚集在一起形成聚合物。通 過細胞中Sup35p聚集體分子量的大小變化，可以在蛋白質水平精確定量檢測待測藥物對 朊病毒聚集體的作用效果。本發明的有益效果是本發明，采用半變性瓊脂糖凝膠電泳結合蛋白質印跡的方 法(SDD-AGE/Western blot)，相對于國際上一般使用的SDS-PAGE/Western Blot方法，能夠 更加精確地在蛋白質水平通過檢測細胞內朊病毒蛋白聚集體的可溶性的變化，依此來評估 抗朊病毒藥物的作用效果。由于，朊病毒蛋白聚集體的分子量大小是其致病性、傳染性的根 本原因，其聚集體的分子量大小的變化是抗朊病毒藥物作用效果的重要指標，而本發明通 過SDD-AGE/Western blot方法能夠精確的確定朊病毒蛋白聚集體的分子量大小的變化，從 而實現在蛋白質水平定量判斷藥物對朊病毒的作用效果，并在分子機理和細胞學上探討抗 朊病毒藥物的作用機理。本發明采用濕法電轉移的方法將經凝膠電泳的蛋白轉移到PVDF 膜上，該法與虹吸法相比可以節約80%以上的時間，同時它也克服了半干法電轉蛋白轉移 不完全的缺點。
圖1是實施例1中，利用SDD-AGE/Western Blot方法檢測[PSI+]、[psi_]的照片；圖2是實施例2中，利用SDD-AGE/Western Blot方法檢測鹽酸胍對朊病毒[PSI+]
4作用效果的照片。圖3是實施例3中，利用SDD-AGE/Western Blot方法檢測菲啶對朊病毒[PSI+]作 用效果的照片。
具體實施例方式菌種來源Sf生型釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae ATCC208719)，來自 于美國標準菌種庫(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏編號為 208719。實施例1定量檢測[PSI+]、[psil細胞中Sup35p的聚集水平1)釀酒酵母細胞的活化取野生型釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)中的[PSI+]、 [psi_]菌株單菌落，分別接種到10ml YPD液體培養基中，30°C水浴振蕩培養18h。然后用 YPD進行酵母菌初始0D值的調試，調制菌懸液終濃度0D_ = 0.5；以的接種量將調試好的[PSI+]、[psi-]分別接種到50ml YPD液體培養基中， 30°C，180轉振蕩培養約12h，到0D_ = 1. 5左右時停止培養。2)采用 SDD-AGE/Western blot 的方法，定量檢測[PSI+]、[psil 細胞中 Sup35p 的聚集水平釀酒酵母細胞裂解液的制備將1)步培養好的[PSI+]、[psil酵母菌培養液分 別離心，5000rpm，5min，去上清收集細胞，加入裂解緩沖液(25mM Tris-Cl，pH 7. 4,100mM NaCl,50mM KCl,5mM MgC12，4%甘油，1 % TritonX-100，2. 5mM EDTA,0. 1% SDS,2mM DTT 現 用現加，5mM PMSF現用現加)懸浮細胞，再次離心收集細胞，取0. 3ml細胞放入可密封的樣 品管中，加裂解緩沖液適量(0. 6ml)，懸浮細胞，再加鋯珠適量(0. 3g)，擰緊管蓋密封樣品 管，將其置于酵母細胞破碎儀(珠磨儀，MiniBeadbeater-1)中，震蕩破碎細胞。破碎方法 震蕩破碎30s，取出置于冰上60s，再次震蕩破碎30s，再取出置于冰上60s，如此反復4次。 5000rpm,離心5min，收集上清得到蛋白樣品PSI+和psi—，用蛋白質測定試劑盒(protein assay kit)分別測定兩個蛋白樣品的濃度。瓊脂糖凝膠電泳用含0. 1 % SDS的TBE (45mM Tris-硼酸，ImMEDTA, pH 8. 0)配制 1. 5%瓊脂糖凝膠(12cmX 12cm，稱取0. 45g瓊脂糖加熱溶于30ml含0. SDS的TBE中)， 用上樣緩沖液(0.5XTBE，0.5% SDS，5%甘油，0. 05%溴酚藍)混勻蛋白樣品，于42°C水浴 中溫育蛋白樣品lOmin，然后將樣品在含0. SDS的TBE電泳緩沖液的作用下，進行1. 5% (12X12)的瓊脂糖凝膠電泳，100V，4°C電泳至凝膠前沿。再將電泳完的凝膠中的蛋白在轉 移緩沖液(48mM甘氨酸，39mM Tris，0. 0375% SDS，20%甲醇)的作用下，濕法電轉(恒壓 100V, 60min)到PVDF膜上，進行免疫印跡反應，最后曝光X光片獲得圖像信息。3)結果分析用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析目標帶的分子量和凈光 密度值。如圖1所示。根據實驗操作以及圖1所示可以看出，本發明采取的SDD-AGE/Western Blot方 法操作簡單(樣品離心次數大大減少)、對設備要求較低(普通離心機即可)且耗時較少， 而實驗結果不但可以確定目的蛋白的分布及多少，更重要的是可以確定蛋白分子的聚集狀 態，從而在蛋白質水平精確定量抗朊病毒藥物的作用效果。
實施例2定量檢測鹽酸胍對朊病毒的作用效果1)酵母細胞的活化取野生型釀酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)中的[PSI+]、 [psi_]菌株單菌落，分別接種到10ml YPD液體培養基中，30°C水浴振蕩培養18h。然后用 YPD進行酵母菌初始0D值的調試，調制菌懸液終濃度0D_ = 0.5；2)抗朊病毒藥物的初篩選取2ml無菌凍存管，加入鹽酸胍，0. 9ml YPD液體培養基以及0. lml調試好的酵母 細胞菌懸液，使鹽酸胍的終濃度為5mM。在24°C的條件下，水浴搖床振蕩培養，每天定時取 適量的前一天凍存管中的酵母細胞放入新的裝有YPD培養液和鹽酸胍的無菌凍存管中，振 蕩培養1 5天；在鹽酸胍作用的過程中，適時取出經藥物治療ld，3d，5d的酵母細胞，稀釋10000 倍，取0. lml均勻涂平板到1/2YPD固體培養基上，放24°C溫箱中培養5 8d，觀察菌落顏 色的變化，經1 5天的治療，菌落顏色從白色逐漸變為粉色和紅色，初步判斷鹽酸胍對朊 病毒具有治療效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量檢測鹽酸胍的作用效果釀酒酵母細胞裂解液的制備分別取經鹽酸胍治療ld，3d，5d稀釋涂平板在 1/2YPD上長出的單菌落，按菌落顏色分組(將同一天的顏色相同的菌落作為一組)，每組挑 取單菌落3 5個接種到10ml YPD液體培養基中，30°C搖床活化18h。然后再以接種 量接種到50ml YPD的液體培養基中，分別進行擴大培養12h。分別離心，5000rpm，5min，去上清收集細胞，然后加入裂解緩沖液(25mM Tris-Cl, pH7. 4,100mM NaCl,50mM KCl,5mM MgC12，4 % 甘油，1 % TritonX-100，2. 5mM EDTA,0. 1% SDS,2mM DTT現用現加，5mM PMSF現用現加)懸浮細胞，再次離心收集細胞。取0. 3ml細 胞放入可密封的樣品管中，加裂解緩沖液適量(0. 6ml)，懸浮細胞，再加鋯珠適量(0. 3g)， 擰緊管蓋密封樣品管，將其置于酵母細胞破碎儀(珠磨儀，MiniBeadbeater-1)中，震蕩 破碎細胞。破碎方法震蕩破碎30s，取出置于冰上60s，再次震蕩破碎30s，再取出置于冰 上60s，如此反復4次。5000rpm，5min離心，收集上清得到蛋白樣品，用蛋白質測定試劑盒 (proteinassay kit)分別測定各個蛋白樣品的濃度。瓊脂糖凝膠電泳用含0. 1% SDS 的 TBE(45mM Tris-硼酸，ImMEDTA，pH 8. 0)配 制1. 5 %瓊脂糖凝膠(12cmX 12cm,稱取0. 45g瓊脂糖加熱溶于30ml #0.1% SDS的TBE 中)，用上樣緩沖液(0. 5XTBE，0. 5% 505，5%甘油，0. 05%溴酚藍)混勻樣品，于42°C水浴 中溫育蛋白樣品lOmin，然后將樣品在含0. 1%SDS的TBE電泳緩沖液的作用下，進行1. 5% (12X12)的瓊脂糖凝膠電泳，100V，4°C電泳至凝膠前沿。再將電泳完的凝膠中的蛋白在轉 移緩沖液(48mM甘氨酸，39mM Tris,0. 0375% SDS，20%甲醇)的作用下，濕法電轉(恒壓 100V,60min)到PVDF膜上，進行免疫印跡反應，最后曝光X光片獲得圖像信息。4)結果分析用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析目標帶的分子量和凈光 密度值。如圖2所示。結論由圖2的結果可以看出，經SDD-AGE結合蛋白印跡的方法，我們可以看出鹽 酸胍作用不同天數下不同菌落顏色的細胞內的Sup35p的狀態。由X光片的信息可以看出，
6同為白色或者粉色菌落，1天，3天和5天下的相同顏色菌落內的Sup35p的聚集狀態是不一 樣的。經過5天的鹽酸胍作用，雖然還有個別的白色菌落出現，但是在蛋白水平，Sup35p聚 集體的分子量已經大大減小。這種聚集體分子量變化的信息同時也在另一方面極為重要地 反映出了待測藥物對于朊病毒聚集體的抑制及降解能力。這是使用傳統的分析方法所不能 實現的。實施例3定量檢測菲啶對朊病毒的作用效果1)釀酒酵母細胞的活化同實施例2 ；2)抗朊病毒藥物的初篩選取2ml無菌凍存管，分別加入鹽酸胍，菲啶，0. 9ml YPD培養液以及0. lml調試好 的酵母細胞懸液，使鹽酸胍的終濃度為0. 5mM(在此濃度下，鹽酸胍對朊病毒沒有治愈作 用，但是和別的藥物同時作用起到增效劑的作用)、使菲啶的終濃度為0. 2mM。在24°C的條 件下，水浴搖床振蕩培養，每天定時取適量的前一天凍存管中的酵母細胞放入新的裝有YPD 培養液和待測藥物的無菌凍存管中，振蕩培養1 5天；在待測藥物作用的過程中，適時取出經藥物治療ld，2d，3d，4d，5d的酵母細胞，稀 釋10000倍，取0. lml均勻涂平板到1/2YPD固體培養基上，放24°C溫箱中培養5 8d，觀 察菌落顏色的變化，經1 5天的治療，菌落顏色從白色逐漸變為粉色和紅色，初步判斷菲 啶對朊病毒具有治療效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量檢測菲啶的作用效果方法同實施例24)結果分析用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析目標帶的分子量和凈光 密度值。如圖3所示。結論由圖3的結果可以看出，經SDD-AGE結合蛋白印跡的方法，我們可以看出菲 啶作用不同天數下不同菌落顏色的細胞內的Sup35p的狀態。由X光片的信息可以看出，同 為白色或者粉色菌落，1天，3天和5天下的相同顏色菌落內的Sup35p的聚集狀態是不一樣 的。經過5天的菲啶作用，雖然還有個別的白色菌落出現，但是在蛋白水平，Sup35p聚集體 的分子量已經大大減小。這種聚集體分子量變化的信息同時也在另一方面極為重要地反映 出了待測藥物對于朊病毒聚集體的抑制及降解能力。這是使用傳統的分析方法所不能實現 的。根據實施例2、實施例3以及圖2、圖3可以看出，本發明采取的SDD-AGE/Western Blot方法不僅可以確定目的蛋白在分布和數量方面變化，也能精確的確定藥物作用下朊病 毒聚集體在大小上的變化，從而在蛋白質的水平判斷藥物對朊病毒的作用效果，進而為在 分子機理和細胞學上的探討抗朊病毒藥物的作用機理提供可能。實施例2和實施例3用已知的抗朊病毒藥物鹽酸胍和菲啶對本發明的方法進行了 驗證。本發明的方法適用于在次級藥物篩選中精確定量的檢測其抗朊病毒的作用效果，對 于某一新的化合物或已知的藥物，可以按本發明的步驟，通過初篩選來初步判斷其是否具 有抗朊病毒的作用，經初步判斷后，可以進一步采用SDD-AGE/Western blot的方法，來定量 檢測其抗朊病毒的作用效果。
權利要求
一種在蛋白質水平精確定量檢測抗朊病毒藥物作用效果的方法，其特征在于步驟如下1)釀酒酵母細胞的活化取釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae ATCC 208719)接入YPD液體培養基中，30℃水浴振蕩培養18h，然后進行酵母菌初始OD值的調試，調制菌懸液OD600＝0.5；2)抗朊病毒藥物的初篩選取無菌凍存管，加入待測藥物、YPD液體培養基以及調試好的釀酒酵母細胞菌懸液，在24℃的條件下，振蕩培養，每天定時取前一天凍存管中的釀酒酵母細胞放入新的裝有YPD液體培養基和待測藥物的無菌凍存管中，振蕩培養1～5天，每天取菌懸液少量稀釋涂平板到1/2YPD固體培養基上，通過觀察菌落顏色的變化初步判斷待測藥物的治療效果；3)定量檢測抗朊病毒藥物的作用效果釀酒酵母細胞裂解液的制備取2)步中，經藥物治療不同時間后稀釋涂平板在1/2YPD上長出的單菌落，按菌落顏色分組，每組挑取3-5個單菌落接種到10ml YPD液體培養基中活化18h，然后再以1％的接種量接種到50ml YPD液體培養基中擴大培養12h，離心收集細胞，然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細胞，離心收集上清得到蛋白樣品；瓊脂糖凝膠電泳用含0.1％SDS的TBE配制1.5％瓊脂糖凝膠，用含0.5％SDS的上樣緩沖液于42℃溫育蛋白樣品10min，然后將蛋白樣品在100V，4℃的條件下電泳至凝膠前沿，再將蛋白濕法電轉移到PVDF膜上，進行免疫印跡反應，并曝光X光片獲得圖像信息；4)用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析。
全文摘要
本發明涉及一種在蛋白質水平精確定量檢測抗朊病毒藥物作用效果的方法。采用的技術方案是1)釀酒酵母細胞的活化；2)抗朊病毒藥物的初篩選將待測藥物、YPD液體培養基以及調試好的釀酒酵母細胞菌懸液，振蕩培養1～5天，通過菌落顏色的變化初步判斷待測藥物的治療效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量檢測抗朊病毒藥物的作用效果；4)用全自動圖像分析系統Dolphin-DOC進行圖像掃描，分析。本發明可精確地在蛋白質水平通過檢測細胞內朊病毒蛋白聚集體的可溶性變化來評估藥物的作用效果；通過定量檢測朊病毒蛋白聚集體的分子量大小的變化，完成在蛋白質的水平上判斷藥物對朊病毒的作用大小。
文檔編號G01N33/561GK101858910SQ20101013200
公開日2010年10月13日 申請日期2010年3月25日 優先權日2010年3月25日
發明者蘭萬軍, 宋堯, 宋有濤, 李輝 申請人:遼寧大學