專利名稱：一種蛋白印記膜再生液的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白印記膜再生液的制備方法，屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
蛋白印跡是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，其基本 原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色 的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。具體試驗 方法為經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素膜 或聚偏氟乙烯膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類 型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反 應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離 的特異性目的基因表達的蛋白成分。在蛋白印記中完成了一抗二抗結合和后續的化學發光檢測后，有時還需要檢測其 它蛋白進行比較。蛋白印跡膜再生液中的特殊成份可解離膜上抗原與抗體的結合，但不影 響轉移到膜上的蛋白，隨后，可以使用不同的抗體進行下一輪蛋白印記實驗，檢測其它蛋 白。當需要進行多次蛋白檢測時，采用本方法與重新電泳、轉膜相比，不僅節省樣品、材料和 時間還可以消除重新上樣帶來的誤差，增強試驗的可比性。傳統分子克隆上介紹的蛋白印記膜再生方法對抗原洗脫強度過大，常常會導致轉 移到固相載體例如硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜)上的蛋白信號的減弱。并且含有刺激性 強的化學物質巰基乙醇，操作不慎會對操作人員造成危害。而且傳統的配方需要操作時間 較長。
發明內容
本發明的目的是提出一種蛋白印記膜再生液的制備方法，以適用于蛋白印記經過 化學發光檢測的硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜的重復利用，使得同一張硝酸纖維素膜或聚 偏氟乙烯膜可以采用不同種類的抗體進行下一輪蛋白印記檢測。本發明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度 為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質量百分比濃度為；(2)用鹽酸調節上述水溶液的PH值為2。本發明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，其優點是1、在蛋白印記中完成了一抗二抗結合和后續的化學發光檢測后，有時還需要檢測 其它蛋白進行比較。本發明方法制備的蛋白印記膜再生液中的特殊成分可以解離膜上抗原 和抗體的結合，避免對轉移到膜上的抗原蛋白產生影響，使得同一張膜可以采用不同種類 的抗體進行下一輪蛋白印記檢測。2、用本發明方法制備的蛋白印記膜再生液的效力強，能高效特異地解離抗原與抗體的結合，但對結合到膜上的蛋白作用溫和，幾乎不會影響膜上的蛋白。3、本發明方法制備的蛋白印記膜再生液中不含有β-巰基乙醇，無毒無味，對實驗操作者沒有毒害。4、本發明方法制備的蛋白印記膜再生液使用方法簡單，(什么操作)操作快速，比 傳統的方法簡便快捷。5、本發明方法制備的蛋白印記膜再生液儲存方便，可以室溫保存。
具體實施例方式本發明提出的蛋白印記膜再生液的制備方法，包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度 為25毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質量百分比濃度為；(2)用鹽酸調節上述水溶液的ρΗ值至2。以下是本發明方法的實施例實施例1 配制1升蛋白印記膜再生液的方法(1)分別稱量1. 5克甘氨酸和10克十二烷基磺酸鈉；(2)加入一定體積的超純水，完全溶解；(3)用鹽酸調節ρΗ值至2 ；(4)補加超純水定容至1升。實施例2 配制10升蛋白印記膜再生液的方法(1)用天平分別稱量15克甘氨酸和100克十二烷基磺酸鈉；(2)加入一定體積的超純水，完全溶解；(3)用鹽酸調節ρΗ值至2 ；(4)加超純水定容至10升。以下介紹本發明方法制備的蛋白印記膜再生液的使用方法1、將蛋白印記實驗中經過化學發光法檢測的硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜充分 浸入本發明方法制備的蛋白印記膜再生液中，室溫孵育15-30分鐘并搖動。注意優化孵育時間和溫度可以獲得較佳的結果，通常，高親和力的抗體將會需要 更長的洗膜時間如30分鐘以上，在37度孵育會獲得較好效果。2、取出硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜，用磷酸鹽緩沖液沖洗膜一次，然后搖動洗 滌5-10分鐘。3、檢測抗體是否去除的方法如下(1)檢測是否完全去除辣根過氧化物酶標記二抗將硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯 膜置于新的蛋白印記膜再生液中，洗膜，X光膠片曝光并顯影，如果膠片上沒有顯示條帶，說 明二抗已經成功地從抗原或者一抗上去除；(2)檢測是否完全去除一抗將硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜孵育在辣根過氧化 物酶標記的二抗中，用洗滌緩沖液洗滌，X光膠片曝光并顯影，膠片上沒有顯示條帶，說明一 抗已經去除。
4、如果步驟3檢測到條帶，則需重復步驟2，再次洗滌5-15分鐘。注意許多抗原抗體系統需要增加溫度或者延長時間才能完全去除。優化洗膜時 間和溫度來確保完全去除抗體而不破壞抗原。5、在確定硝酸纖維素膜或聚偏氟乙烯膜上抗體已經完全洗掉后 ，重新封閉，即可 以進行下一輪蛋白印記實驗。
權利要求
一種蛋白印記膜再生液的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質量百分比濃度為1％；(2)用鹽酸調節上述水溶液的pH值為2。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白印記膜再生液的制備方法，屬于生物檢測技術領域。首先將甘氨酸和十二烷基磺酸鈉分別稱量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩爾濃度為20毫摩爾/升，十二烷基磺酸鈉的質量百分比濃度為1％；用鹽酸調節上述水溶液的pH值為2。用本發明方法制備的蛋白印記膜再生液的效力強，能高效特異地解離抗原與抗體的結合，但對結合到膜上的蛋白作用溫和；再生液中不含有β-巰基乙醇，無毒無味，對實驗操作者沒有毒害；使用方法簡單，操作快速；儲存方便，可以室溫保存。
文檔編號G01N33/68GK101833008SQ201010129820
公開日2010年9月15日 申請日期2010年3月19日 優先權日2010年3月19日
發明者俞萍, 孫克非, 李曉晨, 龍晶 申請人:天根生化科技(北京)有限公司