專利名稱：基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑及制備方法
技術領域：
本發明屬于一種疾病的檢測試劑，具體涉及用于血吸蟲病檢測的試劑及制備方法。
背景技術：
血吸蟲病仍然是世界性分布的主要寄生蟲疾病，據估計全球76個國家和地區有2 億多人感染，7. 79億人受血吸蟲感染威脅，每年因血吸蟲病死亡的人數超過28萬。我國也 是血吸蟲病流行區，病原體是日本血吸蟲。建國后，由于我國政府的高度控制，血吸蟲病的 流行得到了很好的控制，目前現癥患者約60余萬人，受威脅人群約4000萬。然而隨著經濟 的發展，水利設施的興建、人口的大量流動，全球氣溫變暖可能帶來的流行區的改變，以及 居民對血吸蟲病防范意識的淡漠，我國血吸蟲病防治工作任重而道遠。然而血吸蟲病的診斷至今沒有理想的檢測方法，理想診斷技術的缺乏是確定藥物 化療人群(及個體)的一大障礙，因此，開發高度特異敏感的診斷標志物、尋找新的治療藥 物及高效的疫苗候選分子仍是當前血吸蟲病研究的重要內容。目前血吸蟲病診斷的方法有病原學、免疫血清學和分子生物學。1、病原學檢測，當前即使在發達國家，病原學檢查陽性仍是血吸蟲病診斷的金標 準，主要包括糞便蟲卵檢測和毛蚴孵化法。然而，蟲卵檢查耗時費力，效率低下，極易漏檢， 易污染環境(按照現行國家規定，須在PII生物安全實驗室進行操作)，不易自動化操作，過 程不易標準化。2、分子生物學檢測，因其缺乏特異的探針，易出現假陽性，對實驗條件要求較高， 成本昂貴，不適宜流行區大規模現場使用，目前僅停留在實驗室研究階段。3、免疫血清學檢測，包括環卵沉淀試驗(C0PT)，間接血凝試驗(IHA)，酶聯免疫吸 附試驗(ELISA)等。C0PT和IHA和病原學檢測方法一樣，由于敏感性較低、耗時以及難以標 準化，也沒有得到廣泛的應用和推廣。因此，基于ELISA的血清學方法被發展，這種方法因 其具有高度的特異性、敏感性，且穩定可靠，簡便快速，無需特殊設備，多年來對其進行了大 量的研究，許多抗原或抗體被測試。首先，血吸蟲蟲卵可溶性抗原提取物(SEA)和成蟲抗原 提取物(AWA)被證實特異性不夠理想，因為這些粗提物抗原成分比較復雜。由于這種原因， 使用重組抗原為探針的ELISA得到了廣泛的發展。目前測試的重組抗原主要有日本血吸蟲 谷胱甘肽轉移酶(SjGST)、Sjl4-3-3、Sj22. 6、Sj32等，其中SjGST和Sjl4_3_3聯合檢測用 于血吸蟲病的診斷取得了較為滿意的結果。目前，用于血吸蟲病診斷的試劑盒包括“膠體染料免疫滲濾實驗(DIGFA) ”和“間 接血凝實驗(IHA)”。然而上述試劑所用的抗原均為蟲源性未知的粗制抗原組分。因此試劑 制備周期長，需要活蟲制備抗原，成本較高，同時技術難以標準化，且易出現交叉假陽性反 應。此外，以前的ELISA結果顯示，利用cDNA文庫篩選的SjGST和Sjl4_3_3聯合用于急性 和慢性血吸蟲病的檢測，敏感性分別達到了 94.4% (67/71)和80. 7% (96/119)，特異性達 到了 94. 7%。
發明內容
為了提高血吸蟲病檢測的敏感性和特異性，本發明提供一種用于急、慢性血吸蟲 病檢測的基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑，另一目的是提供一種該試劑的包 被制備方法。實現上述的目的的技術解決方案如下 基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑由下列重組抗原A和重組抗原B按 照11混合配伍組成重組抗原混合物；重組抗原A為重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)3mg/ml重組抗原B為重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)3mg/ml ；重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)，分子量42.8kDa，等電點6. 70，由 398個氨基酸組成ms 1 v tpaf p v f nl vdsayda vlllnddveh lpnalqlaln alkefsevnp kfsdevslipfpqhpskrli fsptgqlntd eadirnvyda avngmlkllk igckspllcc gsfvsapkda qwserne111nav1gayhal ytplevreml pekfpkairf gvmeandsll niakaieegr tlardiggsd permaapkiaeylknaldgl tgvtitinkv dakkyplmaa vnraasvvpr hdgrvvhidy kpssskeidt slflvgkgitfdtggadvka ggimagmhrd kcgaaaiagl mktigllqpt glsvsaalaf vrnsvgeesy vadeiiiarsgqrvrigntd aegrtvmadl lceakekalt aknpflftva tltghviray knytsgyg ；重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)，分子量39.8kDa，等電點6. 60， 由363個氨基酸組成mprf ppy 1 te aqeddlrqia qai capgkgi laadestatm gkr 1 qqi gve nneenrrlyrqllfsadhkl aqnisgvilf eetlhqksdd gktlptllae rhiipgikvd kgvvplagtd netttqglddlasrcaeyrk lgcrfakwrc vlkisshtps yqamlenanv laryasicqq nglvpivepe vlpdgdhdlltaqrvteevl sfvykaladh hvylegtllk pnmvtagqac kkaytpqena latvralqrt vppavpgitflsggqselda tknlneinki pgpkpwaltf sfgralqasv latwqgkken vhaaqeellk lakangaaavgkfegdmgta lgdkslfvan hayD基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑的制備方法如下將上述重組抗原 混合物用PH 9. 6,0. 5mol/L碳酸鹽包被緩沖液稀釋至3 u g/ml，按每孔100 u 1包被于聚苯 乙烯微量反應板，每孔含300ng混合重組抗原，溫度4°C靜置12-14小時，次日棄去孔內包 被液，用含有0. 05% Tween-20的pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次，再用含有 5-10%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每孔200 u 1，37°C封閉1小時，棄干后洗滌3次，制 得基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑。亮氨酸氨基肽酶(LAP)是一金屬肽酶，能夠從蛋白質或多肽的N端水解氨基酸。 LAP在細胞維護、生長發育以及防御上起著重要的作用。在寄生蟲，LAP負責營養的吸收和 免疫調節，被認為是新型的藥物靶點和疫苗候選分子。在曼氏血吸蟲，LAP定位于蟲卵、腸腔 和表膜，出現在生活史各個階段，參與蟲卵的孵化、血紅蛋白代謝和表膜的重構。尤其，LAP 作為優勢抗原能夠被一些寄生蟲感染血清識別。我們發現它在血吸蟲病診斷中具有很高的 價值。果糖二磷酸醛縮酶(FBPA)是糖代謝中重要的糖解酶，裂解1，6_ 二磷酸果糖為
43_磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，因此，它在宿主能量產生過程中是至關重要的，是宿主活動 和生存所必需的。動物實驗證明，FBPA對肝片型吸蟲和曼氏血吸蟲等一些寄生蟲具有免疫 保護作用；值得關注的是，旋盤尾絲蟲、曼氏血吸蟲和惡性瘧原蟲患者血清也篩選出FBPA ； 而且，它在人賈第鞭毛蟲病診斷中顯示有良好的應用前景。因此，以上資料顯示，LAP和FBPA是潛在的診斷候選分子，值得進一步開發它們在 血吸蟲病診斷中的價值。可喜的是，我們利用血清蛋白質組學、在日本血吸蟲患者的血清中篩選出了這兩 種蛋白質的抗體。現今還沒有利用這兩種重組抗原聯合檢測用于血吸蟲病的免疫診斷。用 以上兩種抗原聯合檢測，既保持了重組抗原用于免疫診斷的高度特異性，又增加了用單一 抗原檢測時的敏感性。根據血清蛋白質組學篩選得到的日本血吸蟲LAP(SjLAP)和FBPA(SjFBPA)編 碼基因的開放閱讀框(0RF)，設計引物，從我國流行的日本血吸蟲成蟲轉錄組中克隆 出SjLAP和SjFBPA基因，插入pET-28a原核表達質粒，轉化大腸桿菌BL21，誘導表達出 rSjLAP和rSjFBPA，用親和層析法純化rSjLAP和rSjFBPA，將純化的、適當稀釋的rSjLAP 和rSjFBPA混合包被聚苯乙烯微量反應板，研制成快速間接酶聯免疫實驗(ELISA)試劑 盒，用來檢測病人血清中的特異性抗體。同時用環卵沉淀試驗、可溶性蟲卵抗原包被的 ELISA(SEA-ELISA)、成蟲抗原包被的ELISA(AWA-ELISA)和間接血凝試驗(IHA)進行平行檢 測。在此基礎上，對所研制試劑的檢查方法進一步優化，用棋盤滴定法確立最佳包被抗原量 和最佳血清稀釋倍數，從而實現試劑盒的標準化。再以上述確定的最佳包被抗原量和最佳 血清稀釋倍數對流行區的自然人群血清進行篩查，并與糞檢和目前其他幾種已廣泛應用的 診斷試劑盒做單盲平行檢測，將結果進行分析比較，以評價現場應用價值，最后對試劑盒的 重復性、檢測效率、穩定性和檢測費用進行評估，以期作為產品化的試劑盒進行推廣應用。本發明使用的基于血清蛋白質組學篩選的SjLAP和SjFBPA重組抗原聯合用于急、 慢性血吸蟲病的診斷敏感性分別達到了 98. 和87. 8%，特異性達到了 96. 7%，而且在血 吸蟲病的治療效果評估中，在患者治療后的6個月內，血清中的兩種抗體滴度下降非常明 顯，具有統計學意義(P < 0. 001)，而在治療后6至12月時，有85%的患者血清中的抗體水 平下降至健康人水平。因此，使用本發明，不僅可以對血吸蟲病正確診斷，而且通過動態檢 測患者血清中的兩種抗體水平，還能正確評估患者的治療效果。本發明與現有技術相比的優點在于1、本發明試劑盒中使用的主要檢測工具為基因工程重組的分子抗原重組日本 血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)和重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)聯合用 于血吸蟲病免疫診斷檢測具有特異性高，敏感性強，敏感性分別達到了 94. 4% (67/71)和 80. 7% (96/119)，特異性達到了 94. 7%。2、在血吸蟲病的療效考核中，通過動態監測rSjLAP和rSjFBPA這兩種抗原的患者 血清中的抗體水平，可以正確評估患者的治療效果，至今還未見相關報導。3、本試劑盒檢測方法采用目前廣泛使用的ELISA方法，易于標準化、規模化，可手 工操作，無需特殊設備，也可儀器自動化，操作簡便，檢測成本較低。4、與現有的粗制蟲源性抗原相比，rSjLAP和rSjFBPA制備簡單快速，不需飼養釘 螺和動物感染，大大降低了制備成本。5、由于rSjLAP和rSjFBPA是基因工程技術獲得，對包被抗原的濃度、分子量、等電點，甚至抗原表位以及其他抗原性質明確掌握，避免了粗制 混雜抗原的不穩定性和引起的交叉反應。6、本抗原來自基因工程大腸桿菌，而非動物組織或內臟，不需戳殺實驗動物。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步地描述。實施例基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑是由下列重組抗原A和重組抗原B 按照11混合配伍組成的重組抗原混合物；重組抗原A為重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rS jLAP)3mg/m重組抗原B為重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)3mg/ ml ；重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)，分子量42.8kDa，等電點6. 70，由 398個氨基酸組成ms 1 v tpaf p v f nl vdsayda vl 1 lnddveh lpnalqlaln alkef se vnp kfsdevsiipfpqhpskrli fsptgqlntd eadirnvyda avngmlkllk igckspllcc gsfvsapkda qwsernclllnavlgayhal ytplevreml pekfpkairf gvmeandsll niakaieegr tlardiggsd permaapkiaeylknaldgl tgvtitinkv dakkyplmaa vnraasvvpr hdgrvvhidy kpssskeidt slflvgkgitfdtggadvka ggimagmhrd kcgaaaiagl mktigllqpt glsvsaalaf vrnsvgeesy vadeiiiarsgqrvrigntd aegrtvmadl lceakekalt aknpflftva tltghviray knytsgyg ；重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)，分子量39.8kDa，等電點6. 60， 由363個氨基酸組成mprf ppy 1 te aqeddlrqia qai capgkgi laadestatm gkr 1 qqi gve nneenrrlyrqllfsadhkl aqnisgvilf eetlhqksdd gktlptllae rhiipgikvd kgvvplagtd netttqglddlasrcaeyrk lgcrfakwrc vlkisshtps yqamlenanv laryasicqq nglvpivepe vlpdgdhdlltaqrvteevl sfvykaladh hvylegtllk pnmvtagqac kkaytpqena latvralqrt vppavpgitflsggqselda tknlneinki pgpkpwaltf sfgralqasv latwqgkken vhaaqeellk lakangaaavgkfegdmgta lgdkslfvan hayD基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑的制備方法是，將上述重組抗原混 合物用PH 9. 6,0. 5mol/L碳酸鹽包被緩沖液稀釋至3ii g/ml，按每孔100 yl包被于聚苯乙 烯微量反應板，每孔含300ng混合重組抗原，溫度4°C靜置12-14小時，次日棄去孔內包被 液，用含有0.05%吐溫-20(Tween-20)的pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次，再 用含有5-10%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每孔200iU，37°C封閉1小時，棄干后洗滌 3次，制得基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑板。其中ELISA聚苯乙烯微量反應板、辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG、鄰苯二胺 (0PD)底物A和B液、2mol/L硫酸終止液、PBST洗滌濃縮液(30 X)，均可從市場購得。具體檢測操作如下1、將待檢血清用pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)按1 10稀釋，在上述制備 好的檢測試劑板上每孔加入100 iil稀釋后的血清，37°C孵育1小時；
2、用 0. 05 % 吐溫-20 (Tween-20)的 pH 7. 2-7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌 3 次，吸水紙上扣干；3、再加入用PBS按1 10000稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG 二抗，37°C 孵育1小時；4、用PBST洗滌3次，吸水紙上扣干；5、每孔加0PD底物A和B液各50 u 1，震蕩混勻，37 °C或室溫放置5_10min ；6、每孔滴加50 u 1 2mol/L硫酸終止液終止顯色反應；7、在分光光度計或酶標儀上檢測492nm波長處的光密度值(0D)，0D值大于等于 0. 138為陽性，0D值小于0. 138為陰性。
權利要求
基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑，其特征在于由下列重組抗原A和重組抗原B按照1∶1混合配伍組成重組抗原混合物；重組抗原A為重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP) 3mg/ml重組抗原B為重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)3mg/ml；重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)，分子量42.8kDa，等電點6.70，由398個氨基酸組成mslvtpafpv fnlvdsayda vlllnddveh lpnalqlaln alkefsevnp kfsdevsiipfpqhpskrli fsptgqlntd eadirnvyda avngmlkllk igckspllcc gsfvsapkda qwsernclllnavlgayhal ytplevreml pekfpkairf gvmeandsll niakaieegr tlardiggsd permaapkiaeylknaldgl tgvtitinkv dakkyplmaa vnraasvvpr hdgrvvhidy kpssskeidt slflvgkgitfdtggadvka ggimagmhrd kcgaaaiagl mktigllqpt glsvsaalaf vrnsvgeesy vadeiiiarsgqrvrigntd aegrtvmadl lceakekalt aknpflftva tltghviray knytsgyg；重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)，分子量39.8kDa，等電點6.60，由363個氨基酸組成mprfppylte aqeddlrqia qaicapgkgi laadestatm gkrlqqigve nneenrrlyrqllfsadhkl aqnisgvilf eetlhqksdd gktlptllae rhiipgikvd kgvvplagtd netttqglddlasrcaeyrk lgcrfakwrc vlkisshtps yqamlenanv laryasicqq nglvpivepe vlpdgdhdlltaqrvteevl sfvykaladh hvylegtllk pnmvtagqac kkaytpqena latvralqrt vppavpgitflsggqselda tknlneinki pgpkpwaltf sfgralqasv latwqgkken vhaaqeellk lakangaaavgkfegdmgta lgdkslfvan hay。
2.根據權利要求1所述的基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑的制備方法， 其特征在于將上述重組抗原混合物用PH 9. 6,0. 5mol/L碳酸鹽包被緩沖液稀釋至3 u g/ ml，按每孔100 u 1包被于聚苯乙烯微量反應板，每孔含300ng混合重組抗原，溫度4°C靜置 12-14小時，次日棄去孔內包被液，用含有0. 05% Tween-20的pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液 (PBST)洗滌3次，再用含有5-10%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每孔200 u l，37°C封閉 1小時，棄干后洗滌3次，制得基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑。
全文摘要
本發明涉及基于血清蛋白質組學篩選的血吸蟲病檢測試劑。本發明由重組抗原A和B按照1∶1混合配伍組成重組抗原混合物；重組抗原A為重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)3mg/ml，重組抗原B為重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)3mg/ml；重組日本血吸蟲亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)，分子量42.8kDa，等電點6.70，由398個氨基酸組成，重組日本血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶(rSjFBPA)，分子量39.8kDa，等電點6.60，由363個氨基酸組成。本發明對急、慢性血吸蟲病的敏感性分別達到了94.4％(67/71)和80.7％(96/119)，特異性達到了94.7％；避免了粗制混雜抗原檢測的不穩定性和引起的交叉反應；制備簡單快速，大大降低了制備成本；本抗原來自基因工程大腸桿菌，而非動物組織或內臟，不需戳殺實驗動物。
文檔編號G01N33/53GK101799468SQ20101012885
公開日2010年8月11日 申請日期2010年3月17日 優先權日2010年3月17日
發明者宋曉蓉, 李小月, 沈繼龍, 羅慶禮, 胡元生, 鐘政榮, 聞慧琴 申請人:安徽醫科大學