專利名稱：一種痰液的檢測、分析方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬生物醫學領域，涉及一種痰液的檢測、分析方法，具體涉及一種檢測分析痰液中細胞、細胞因子以及炎癥介質變化的方法。本方法有助于呼吸系統疾病支氣管哮喘的分型和中醫證型的微觀辨證。
背景技術：
臨床醫學研究顯示，支氣管哮喘是由多種炎癥細胞、細胞因子和炎性介質等所促成的慢性氣道炎癥性疾病，屬于中醫學哮病的范疇。中醫學認為“伏痰”是哮病的宿根。其基本病理變化為伏痰遇感引觸，痰隨氣升，氣因痰阻，相互搏結，壅塞氣道，而致痰鳴如吼， 氣息喘促。與現代醫學認為慢性氣道炎癥是哮喘的重要病理基礎一樣，中醫的痰在哮病的發病當中也占據著樞紐的位置。對于哮病發作期，中醫學認為素體陽虛，外感于寒，則發為冷哮；素體陽盛，外感于熱，則發為熱哮，主要以“寒痰、熱痰”等證型進行辨證治療。一般認為，中醫“熱痰證”與呼吸道細菌等病原體感染有著密切的關系。有研究發現熱哮血中性粒細胞往往明顯升高，寒哮嗜酸性粒細胞明顯升高，其反映了血中炎癥細胞的結果，但未見其對哮喘寒痰證和熱痰證氣道局部的炎癥指標進行分析。鑒于中醫“有形之痰”在哮病中的重要性，有關研究領域已在關注哮喘寒痰證和熱痰證患者痰和血中炎癥細胞的變化的關系。目前國內外尚無相關報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種痰液的檢測、分析方法及其用途，具體涉及一種檢測分析痰液中細胞、細胞因子以及炎癥介質變化的方法。本發明針對中醫哮喘寒痰證和熱痰證患者痰和血中炎癥細胞的變化的關系，提供一種利用誘導痰技術對痰液進行檢測、分析的方法。本方法有助于呼吸系統疾病支氣管哮喘的分型和中醫證型的微觀辨證。具體而言，本方法采用誘導痰技術分析哮喘寒痰證和熱痰證患者痰和血中炎癥細胞的變化，并結合相關的炎癥因子及炎性介質的變化，提供用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標，并評價其可靠性。具體而言，本方法采用誘導痰技術使哮喘寒痰證、熱痰證患者咳出深部痰液，對痰液進行細胞學分類計數以及檢測痰上清液和血清中IL-8、IL-5、ECP、IL_4、IL_6、IL-10、 IFN-γ, LTB4、CRP等相關炎癥指標，提供用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標，并評價其可靠性。本方法采用誘導痰技術使患者咳出深部痰液，分析痰液中炎性細胞、相關細胞因子的方法，并與血液中的相關指標進行比較，包括下述步驟1)誘導痰技術根據Pin等的改良方法，制定下述流程①測基礎第一秒用力呼氣量(FEV1)；②吸入沙丁胺醇；③IOmin后再測FEV1作為基礎值；④室溫下超聲霧化器吸入消毒的高滲鹽水；⑤間隔測FEV1和連續監測脈搏血氧飽和度；⑥測得FEV1降低值大于20%基礎值時，暫停霧化吸入試驗；⑦收集霧化吸入后第5、 10、15、20min咳出深部的。2)細胞學檢測鏡下挑選上述痰液黏稠部分，稱重后加入0. 二硫蘇糖醇 (DTT)，置于37°C水浴箱，螺旋振蕩至均勻，離心，制作細胞涂片，染色，光鏡下計數400個以上非立方上皮細胞，分類計數，留取上清液，-70°C冰箱凍存。3)根據哮喘發作期的中醫辨證分類證型，收集符合寒痰證、熱痰證的哮喘患者痰涂片染色，顯微鏡下進行細胞分類計數，檢測痰液和血液嗜酸性粒細胞、中性粒細胞百分比；血常規測定嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分比；用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測痰上清液和血清白介素-8 (IL-8)、IL-5、嗜酸性陽離子蛋白(ECP)、IL_4、IL_6、IL-10、干擾素-Y (IFN- γ )、白三烯B4 (LTB4)、C反應蛋白(CRP)。4)分析比較痰液中炎性細胞、相關細胞因子與血液中的相關指標，獲得用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標。所述的參考指標包括痰上清液和血清中相關炎癥指標嗜酸性粒細胞、嗜酸性陽離子蛋白、中性粒細胞、誘導痰EOS和嗜酸性陽離子蛋白、白三烯B4、TH2和/或C反應蛋白。所述的參考指標可用作制定評價支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰證”微觀辨證指標。經臨床患者檢測、分析，結果顯示，哮喘寒痰證中嗜酸性粒細胞、ECP明顯升高；熱痰證中中性粒細胞明顯升高。提示，誘導痰EOS和ECP可作為哮喘寒痰證微觀辨證的重要指標之一，中性粒細胞作為哮喘熱痰證微觀辨證的重要指標之一，LTB4作為寒痰證的微觀辨證指標的可能性值得進一步研究，哮喘寒痰證可能有TH2優勢型的表現，與嗜酸性粒細胞哮喘表現有類似之處，而CRP等則可能成為人類諸多炎癥性疾病的微觀性指標。本發明所采用誘導痰技術對哮喘“寒痰、熱痰”證進行微觀辨證的方法具有安全、 可靠、重復性好，可反映哮喘氣道局部的炎癥特點，該方法可用于慢性支氣管哮喘及其他呼吸道疾病致病機制、預防和治療以及藥物篩選等的研究。
具體實施方案實施例1病例收集按照中醫辨證分為哮喘寒痰證組、熱痰證組、非寒痰熱痰證組，另設正常人組。測各組外周血細胞分類計數及相關炎癥指標；采用誘導痰技術使患者咳出深部痰液行痰涂片進行細胞分類計數，留取痰上清液檢測相關炎癥指標。主要試劑及儀器10%的氯化鈉(上海旭東海普藥業有限公司)；滅菌注射用水 (上海福達制藥有限公司)；0.1%二硫蘇糖醇(美國calbiochem公司制造，進口分裝)； 瑞士染色液(Amresco) ；IL-4試劑盒、INF- γ試劑盒、IL-6試劑盒、IL-8試劑盒、IL-10試劑盒、ECP試劑盒、CRP試劑盒、LTB4試劑盒、IL-5試劑盒(Biosource進口分裝)；全自動血分析儀(美國雅培CELL-DYN3500R) ；YS9801型醫用超聲霧化器(上海億圣科技有限公司)；低溫冰箱(丹麥Heto ultra Freeze)；臺式電動離心機(80-1型)(上海醫科大學儀器廠)；雙目顯微鏡(olympus)(上海肯強儀器有限公司)；溫控水浴搖床(丹麥heto)；肺功能儀(德國耶格公司)；酶標儀multiscanMK3(芬蘭Thermo electron corporation)；冷凍管(Cryovial T311-2)(基因有限公司)。
1)誘導痰技術按下述流程①測基礎第一秒用力呼氣量(FEV1)；②吸入200 μ g沙丁胺醇；③IOmin后再測 FEV1作為基礎值；④在室溫下超聲霧化器吸入已消毒的高滲鹽水，濃度固定為5%，霧量調整為^il/min，吸入時間控制在20min內；⑤視患者病情嚴重程度不同，可以每間隔^iin測 FEV1和連續監測脈搏血氧飽和度；⑥在霧化吸入期間，患者出現不適或測得FEV1降低值大于20%基礎值時，立即暫停試驗；⑦鼓勵患者于霧化吸入開始后第5、10、15、20min用力咳出深部的痰，或欲咳痰時咳痰；咳前雙氧水漱口，咳于無菌容器中，收集痰液至少Ig以上。2)細胞學檢測在倒置顯微鏡下挑選出黏稠部分，稱重后加入2倍體積的0. 1% 二硫蘇糖醇(DTT)，置于37°C水浴箱，螺旋振蕩15min至均勻，3500r/min(r = 15cm)離心 20min。制作細胞涂片，瑞士染色，光鏡下計數400個以上非立方上皮細胞，進行分類計數。 留取上清液，-70°C冰箱凍存。3)根據哮喘發作期的中醫辨證分類證型，收集符合寒痰證、熱痰證的哮喘患者痰涂片染色，顯微鏡下進行細胞分類計數，檢測痰液和血液嗜酸性粒細胞、中性粒細胞百分比；血常規測定嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分比；用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測痰上清液和血清白介素-8 (IL-8)、IL-5、嗜酸性陽離子蛋白(ECP)、IL_4、IL_6、IL-10、干擾素-Y (IFN- γ )、白三烯B4 (LTB4)、C反應蛋白(CRP)。4)分析比較痰液中炎性細胞、相關細胞因子與血液中的相關指標，獲得用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標。檢測、分析結果顯示血EOS在寒痰證組明顯高于正常組、熱痰證組及非寒痰熱痰證組(P < 0. 01)；血 PMN在各組間差別無統計學意義(P >0.05)；寒痰證組痰EOS明顯高于正常組、熱痰證組與非寒痰熱痰證組(P < 0. 01)。痰PMN在熱痰證組高于寒痰證組、非寒痰熱痰證組及正常人組，有統計學意義(P<0. 05)。表1是各組血、痰中EOS和P麗的比較結果。表 1.
組別η血 EOS(%)血 ΡΜΝ(%)痰 EOS(%)痰 PMN(%)熱痰證組322.60 (4.65) ”·58.66 ±9.220.00 (1.00) “65.12±32.4(ΓΔΑ寒痰證組276.70 (5.45) **ΛΔ55.47 + 4.558.50 (38.25) 一1 44.20±30.94非寒痰熱痰證組312.60 (4.70)56.65 ±7.150.00 (2.00)44.03 ±32. 67正常人組332.00 (2.10)56.19 + 6.730.00 (0.50)44.03 ±28. 65注與正常人組比較Zp < 0. 05廣ρ < 0. 01 ；與非寒痰熱痰證組比較，Δρ < 0. 05， ΔΔρ < 0.01，與寒痰證組比較，aP < 0. 05, aaP < 0.01。IL-8、IL-5、IL_4、IFN- y /IL_4在寒痰證組、熱痰證組、非寒痰熱痰證組和正常人組之間無明顯統計學差異(P >0.05)；痰ECP在寒痰證組和非寒痰熱痰證組均明顯高于正常人組(P <0.05)，組間比較差別無統計學意義(P>0.(^)；痰IL-6在非寒痰熱痰證組明顯高于正常人組，有統計學意義(P < 0. 01)，組間比較無統計學差異(P > 0. 05)；熱痰證組和非寒痰熱痰證組IL-10明顯高于正常人組(P < 0. 05)，兩組間比較，差別無統計學意義 (P > 0. 05) ； IFN- γ在寒痰證組和非寒痰熱痰證組高于正常人組(P < 0. 05)，兩組間比較， 差別無統計學意義(P > 0. 05)；痰上清液LTB4在寒痰證組明顯高于正常組(P < 0. 05)，較其他組也有升高趨勢。表2，表3是寒痰證組、熱痰證組、非寒痰熱痰證組和正常人組痰上清液和血清 IL-8、IL-5、ECP、IL-4、IL-6、IL-10, IFN-γ、LTB4、CRP 的比較結果。表4是血清和痰上清液中各項炎癥指標的相關性。表2.各組痰上清液炎癥指標的比較M^lR)
權利要求
1.一種痰液的檢測、分析方法，其特征在于，采用誘導痰技術獲得哮喘患者咳出的深部痰液，對痰液進行細胞學分類計數以及檢測痰上清液和血清中相關炎癥指標，提供用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標，并評價其可靠性。
2.按權利要求1所述的痰液的檢測、分析方法，其特征在于，其包括下述步驟1)誘導痰技術①測基礎第一秒用力呼氣量FEV1 ；②吸入沙丁胺醇；③IOmin后再測FEV1作為基礎值； ④室溫下超聲霧化器吸入消毒的高滲鹽水；⑤間隔測FEV1和連續監測脈搏血氧飽和度；⑥ 測得FEV1降低值大于20%基礎值時，暫停霧化吸入試驗；⑦收集霧化吸入后第5、10、15、 20min咳出深部的痰液；2)細胞學檢測鏡下挑選上述痰液黏稠部分，稱重后加入0.二硫蘇糖醇(DTT)，置 37°C水浴箱，螺旋振蕩至均勻，離心，制作細胞涂片，染色，光鏡下計數400個以上非立方上皮細胞，分類計數，留取上清液，_70°C冰箱凍存；3)根據哮喘發作期的中醫辨證分類證型，收集符合寒痰證、熱痰證的哮喘患者痰涂片染色，顯微鏡下細胞分類計數，檢測痰液和血液嗜酸性粒細胞、中性粒細胞百分比；血常規測定嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分比；檢測痰上清液和血清中相關炎癥指標；4)分析比較痰液中炎性細胞、相關細胞因子與血液中的相關炎癥指標，獲得用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標。
3.按權利要求1或2所述的痰液的檢測、分析方法，其特征在于，所述的痰上清液和血清中相關炎癥指標為血清白介素_8、IL-5、嗜酸性陽離子蛋白、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素-Y、白三烯B4和C反應蛋白。
4.權利要求1或2所述的方法在制定評價支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰證”微觀辨證指標中的用途。
5.按權利要求4的用途，其特征在于，所述的指標是是嗜酸性粒細胞、嗜酸性陽離子蛋白、中性粒細胞、誘導痰EOS和嗜酸性陽離子蛋白、白三烯B4、TH2和/或C反應蛋白。
6.按權利要求4的用途，其特征在于，所述的哮喘寒痰證中嗜酸性粒細胞和嗜酸性陽離子蛋白升高。
7.按權利要求4的用途，其特征在于，所述的熱痰證中中性粒細胞升高。
全文摘要
本發明屬生物醫學領域，涉及一種痰液的檢測、分析方法及其用途，本方法采用誘導痰技術使哮喘寒痰證、熱痰證患者咳出深部痰液，對痰液進行細胞學分類計數以及檢測痰上清液和血清中相關炎癥指標，提供用于支氣管哮喘中醫“寒痰、熱痰”微觀辨證的參考指標，并評價其可靠性。結果證實，本發明方法具有安全、可靠、重復性好，可反映哮喘氣道局部的炎癥特點，有助于呼吸系統疾病支氣管哮喘的分型和中醫證型的微觀辨證。該方法可用于慢性支氣管哮喘及其他呼吸道疾病致病機制、預防和治療以及藥物篩選等的研究。
文檔編號G01N33/50GK102192976SQ20101011894
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月5日 優先權日2010年3月5日
發明者崔焱, 曹玉雪, 杜懿杰, 董競成 申請人:復旦大學附屬華山醫院