專利名稱：一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法
技術領域：
本發明屬于激光共聚焦成像領域，涉及一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外
周神經系統氯成像方法。
背景技術：
氯離子是機體內最豐富的陰離子。調控細胞內外氯離子濃度的氯通道廣泛存在于 機體的細胞膜和細胞器膜。氯通道在細胞多種活動和調節過程如細胞增殖、凋亡、細胞興奮 性調節、pH調節、容量調節和免疫應答中均發揮重要作用。因此，氯離子穩態是維持細胞各 項代謝活動的必要條件， 一旦氯離子穩態被破壞，細胞就會受到功能性或器質性損害甚至 死亡。 激光共聚焦掃描顯微鏡系統是近年推出的集激光技術、電子技術、光學設計及計 算機于一體的影像檢測儀。其特點是照明點和探測點共軛，具有高分辨率和深度識別能力， 可對生物樣品(腦組織切片、活細胞等)進行無損傷光切，并可通過三維重建，得到樣品的 三維立體結構。它的另一個重要的特點是可實時觀察活組織切片及細胞內各種離子的動態 變化。利用激光共聚焦掃描顯微鏡系統觀察腦片或者單個神經元內氯離子濃度的變化是新 的細胞內氯離子濃度檢測方法，能夠可視化檢測不同區域、不同細胞的氯離子濃度水平。
在過去的二、三十年中，氯測定一直局限于電生理學方法，無法進行可視化檢測。 現在，由于指示劑選擇和監測系統方面都獲得了快速的發展，細胞內氯成像探針(縮寫 MQAE，全稱為N_ (Ethoxycarbonylmethyl) -6-methoxyquinolinium bromide)的石開發成功使 得氯離子測定成為可能。但是，如何針對外周神經系統內特定細胞(即神經節細胞)進行 氯離子濃度測定、如何可視化細胞內氯離子濃度、如何實時、動態地監測氯離子濃度變化情 況，國內尚未見報道。本技術的建立將為揭開氯離子生理和病理作用的奧秘提供支持，并為 人類認識和最終戰勝由氯離子穩態失衡造成的臨床疾病提供線索。
發明內容
本發明為一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法。
本發明的目的在于實現3個可能使針對單個外周神經系統內細胞(主要是神經 節細胞)進行氯離子濃度測定成為可能、使細胞內氯離子濃度可視化成為可能、使實時動 態地監測氯離子濃度變化情況成為可能。 針對以上問題，本發明要解決的技術難題主要是兩個第一，如何向外周神經系統 單個神經節細胞導入氯成像探針MQAE，并保證該探針工作正常；第二，如何利用激光共聚 焦顯微鏡記錄細胞內氯離子濃度信號，并保證該結果真實有效。 為此，本發明提供了一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像 方法，按照如下步驟 (1)單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育；
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(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄； (3)校正單個神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。 所述步驟(1)是指將分離得到的外周神經系統單個神經元(即神經節細胞)滴 加到細胞培養用24孔板內預先放置的圓形蓋玻片上。圓形蓋玻片在使用前經濃度為1毫 克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細胞貼附。加入終濃度為5毫摩爾的氯成像探 針(縮寫MQAE，全禾爾為N_(Ethoxycarbonylmethyl)_6_methoxyquinolinium bromide)少 許(100-200微升)。在溫度設置為37t:的恒溫培養箱(最好使用專用細胞培養箱)中培 養20分鐘左右。在此期間，將氧氣和二氧化碳氣同時注入另外的新鮮配制的中性緩沖液 (Krebs-HEPES緩沖液)中。待培養結束后，用此緩沖液置換神經節細胞探針液，以除去細胞 外殘余的氯成像探針(MQAE)(要求洗1次，5分鐘)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
所述步驟(2)是指首先在激光共聚焦顯微鏡成像前，準備中性緩沖液 (Krebs-HEPES緩沖液)，要預先通入濃度為95 %的氧氣和濃度為5 %的二氧化碳氣。然后將 緩沖液經實驗用輸液管勻速輸入灌流槽中，灌流速度不能超過0. 5到1. 0毫升每分鐘。再 將此灌流槽放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上。這時，將步驟(2)所得貼附有神經節細 胞的蓋玻片浸入灌流槽內。用顯微鏡的目鏡選定所需要的部位。開啟共聚焦顯微鏡紫色半 導體激光器，經過顯微鏡上分光鏡過濾得到波長為405納米的紫外光。該束紫外光經顯微 鏡的物鏡聚焦后，能夠激發神經節細胞內的氯成像探針MQAE。氯成像探針MQAE被激發后發 出波長為440納米的發射光，此發射光沿同一光路進入物鏡，穿過分光鏡后在探測針孔處 成像，后經光電倍增管接收、放大后迅速在計算機顯示屏上形成熒光圖像。共聚焦顯微鏡以 電信號的形式記錄圖像后，通過自帶軟件進行圖像處理，最后獲得氯成像圖片。
所述步驟(3)是指此時需要對以上獲得的氯成像結果進行校準。首先將孵育液 更換，換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液。正常人工腦脊液內含有氯化 鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用等摩爾的硫酸鉀鹽替換氯 化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達到我們需要的標準。在這種校正人工腦脊液中 加入氯離子轉運體抑制劑以平衡神經節細胞內外氯離子濃度，同時加入氫離子轉運體抑制 劑以保證測定過程中細胞內酸堿值保持不變。經過抑制劑處理20分鐘后，理論上，這時神 經節細胞內外的氯離子濃度相平衡，就設此時細胞內氯離子濃度為零，即基準值。此時，氯 離子成像探針所發出的熒光強度是最小，我們記之為F。值。然后，我們將酸堿度為中性的校 正人工腦脊液內，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、60毫摩爾和125毫摩爾的氯化鈉， 這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液。需要注意的是，需要在校正緩沖液中同時加 入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細胞膜內外運動。神經節細胞在不同校 正人工腦脊液的孵育下，將產生不同的熒光強度，我們記之為F。值。然后，我們將酸堿度為 中性的校正人工腦脊液內，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、60毫摩爾和125毫摩爾 的氯化鈉，這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液。需要注意的是，需要在校正緩沖液 中同時加入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細胞膜內外運動。腦片在不同 校正人工腦脊液的孵育下，將產生不同的熒光強度，記之為Fa—。熒光強度F^均對應已知 的氯離子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的二維相關系數。最后，緩沖液內 加入150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內染料，使此時熒光強度歸零，記為FSffl。最后， 根據Stern-Volmer公式，F。/Fcl— = K [Cl—]i。其中，[CI—]t代表細胞內氯離子濃度；F。=Fa—_FSCN。 K為Stern-Volmer淬滅常數，代表熒光淬滅率達到50%時的細胞內氯離子濃度 [CI—]"根據以上獲得的數據做出標準曲線，計算出常數K。 實施過程中主要考慮了以下因素(l)采用的MQAE染料為可見光激發，自發熒光 小，對細胞的損害較小，易于通過擴散進入細胞，不易發生滲漏和區室化；(2)實驗體系的 構建適用于激光共聚焦顯微鏡系統，保證該體系的構建更適合于目前實驗室裝備；(3)實 驗中所用試劑的濃度、溫度和時間都經過反復測試，能夠有效避免染料高濃度聚集；(4)本 流程中在指示劑負載前記錄待測細胞的背景熒光，而后從實際測量結果中減去此背景值， 保證自發熒光對結果的影響；(5)激光共聚焦顯微鏡采用激光束作光源，激光束通過照明 針孔和物鏡以聚焦的方式對標本進行層層掃描而收集氯信號，在此過程中，焦平面以外的 散射光線不能通過探測針孔而使測得的氯信號具有很強的空間分辨率。
綜上所述，本發明的優點明確，主要是3點第一，可定量檢測單個外周神經系統 特定細胞(即神經節細胞)內氯離子濃度及其變化情況；第二，對所檢測神經節細胞內氯 離子濃度以熒光形式可視化展示出來；第三，由于采用的氯成像探針MQAE在可見光下被激 發，故自發熒光小，因此保證該種檢測手段對細胞的損害最小，結果更為可靠。
具體實施例方式基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法，按照如下步驟(1) 單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校 正單個神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。
1.單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育 (1)將得到的神經節細胞滴加到細胞培養用24孔板內預先放置的圓形蓋玻片上。 圓形蓋玻片在使用前經濃度為1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細胞貼附。
(2)將終濃度為5毫摩爾的氯成像探針(縮寫MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylme thyl)-6-methoxyquinolinium bromide)少許(100-200微升)加入每個孔中，然后在溫度 設置為37t:的恒溫培養箱(最好使用專用細胞培養箱)中培養20分鐘。
(3)在此期間，將氧氣和二氧化碳氣同時注入另外的新鮮配制的中性緩沖液 (Krebs-HEPES緩沖液)中。待培養結束后，用此緩沖液置換神經節細胞探針培養液，以除去 細胞外殘余的氯成像探針(MQAE)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
2.激光共聚焦顯微鏡成像、記錄； (4)在激光共聚焦顯微鏡成像前，準備中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)，要預先 通入濃度為95%的氧氣和濃度為5%的二氧化碳氣。然后將緩沖液經實驗用輸液管勻速輸 入灌流槽中，灌流速度不能超過1. 5到2. 0毫升每分鐘。 (5)再將此灌流槽放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上。這時，將所得到的貼附有
神經節細胞的蓋玻片浸入灌流槽內。用顯微鏡的目鏡選定所需要的部位。 (6)開啟共聚焦顯微鏡紫色半導體激光器，經過顯微鏡上分光鏡過濾得到波長為
405納米的紫外光。該束紫外光經顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠激發神經節細胞內的氯成像探
針MQAE。氯成像探針MQAE被激發后發出波長為440納米的發射光，此發射光沿同一光路進
入物鏡，穿過分光鏡后在探測針孔處成像，后經光電倍增管接收、放大后迅速在計算機顯示
屏上形成熒光圖像。
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(7)共聚焦顯微鏡以電信號的形式記錄圖像后，通過自帶軟件進行圖像處理，最后 獲得氯成像圖片。 3.校正神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。 (8)將孵育液更換，更換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液。正 常人工腦脊液內含有氯化鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用 等摩爾的硫酸鉀鹽替換氯化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達到我們需要的標準。 在這種校正人工腦脊液中加入氯離子轉運體抑制劑以平衡細胞細胞內外氯離子濃度，同時 加入氫離子轉運體抑制劑以保證測定過程中細胞內酸堿值保持不變。經過抑制劑處理20 分鐘后，理論上，這時神經節細胞內外的氯離子濃度相平衡，就設此時神經節細胞內氯離子 濃度為零，即基準值。此時，氯離子成像探針所發出的熒光強度是最小，我們記之為F。值。
(9)將酸堿度為中性的校正人工腦脊液內，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、 60毫摩爾和125毫摩爾的氯化鈉，這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液。需要注意 的是，需要在校正緩沖液中同時加入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細胞 膜內外運動。神經節細胞在不同校正人工腦脊液的孵育下，將產生不同的熒光強度，記之為 Fa—。熒光強度F^均對應已知的氯離子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的 二維相關系數。 (10)最后，緩沖液內加入150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內染料，使此時熒 光強度歸零，記為F^。 (11)根據Stern-Volmer公式，F。AV = K [Cl—]i。其中，[Cl—]i代表細胞內氯離
子濃度；F。 = Fa—-FSffl。 K為Stern-Volmer淬滅常數，代表熒光淬滅率達到50%時的細胞內
氯離子濃度[cr]i。根據以上獲得的數據做出標準曲線，計算出常數K。 以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定
本發明的具體實施方式
僅限于此，對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫 離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單的推演或替換，都應當視為屬于本發明由所
提交的權利要求書確定專利保護范圍。
權利要求
基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法，其特征在于，按照如下步驟(1)單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正單個神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。
2. 如權利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法，其 特征在于，所述步驟(1)是指將分離得到的外周神經系統單個神經元滴加到細胞培養用24孔板內預先放置的圓形蓋玻片上；圓形蓋玻片在使用前經濃度為1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細胞貼附；加入終濃度為5毫摩爾的氯成像探針100-200微升；在 溫度設置為37t:的恒溫培養箱中培養20分鐘左右；在此期間，將氧氣和二氧化碳氣同時注 入另外的新鮮配制的中性緩沖液中；待培養結束后，用此緩沖液置換神經節細胞探針液，以 除去細胞外殘余的氯成像探針，要求洗1次，5分鐘；之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3. 如權利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法，其 特征在于，所述步驟(2)是指首先在激光共聚焦顯微鏡成像前，準備中性緩沖液，要預先 通入濃度為95%的氧氣和濃度為5%的二氧化碳氣；然后將緩沖液經實驗用輸液管勻速輸入灌流槽中，灌流速度不能超過O. 5到1. O毫升每分鐘；再將此灌流槽放置于激光共聚焦顯 微鏡的載物臺上；這時，將步驟(2)所得貼附有神經節細胞的蓋玻片浸入灌流槽內；用顯微 鏡的目鏡選定所需要的部位；開啟共聚焦顯微鏡紫色半導體激光器，經過顯微鏡上分光鏡 過濾得到波長為405納米的紫外光；該束紫外光經顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠激發神經節 細胞內的氯成像探針MQAE ;氯成像探針MQAE被激發后發出波長為440納米的發射光，此發 射光沿同一光路進入物鏡，穿過分光鏡后在探測針孔處成像，后經光電倍增管接收、放大后 迅速在計算機顯示屏上形成熒光圖像；共聚焦顯微鏡以電信號的形式記錄圖像后，通過自 帶軟件進行圖像處理，最后獲得氯成像圖片。
4. 如權利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法， 其特征在于，所述步驟(3)是指此時需要對以上獲得的氯成像結果進行校準；首先將孵育 液更換，換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液；正常人工腦脊液內含有氯 化鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用等摩爾的硫酸鉀鹽替換 氯化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達到我們需要的標準；在這種校正人工腦脊液 中加入氯離子轉運體抑制劑以平衡神經節細胞內外氯離子濃度，同時加入氫離子轉運體抑 制劑以保證測定過程中細胞內酸堿值保持不變；經過抑制劑處理20分鐘后，這時神經節細 胞內外的氯離子濃度相平衡，就設此時細胞內氯離子濃度為零，即基準值；此時，氯離子成 像探針所發出的熒光強度是最小，我們記之為F。值；然后，我們將酸堿度為中性的校正人 工腦脊液內，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、60毫摩爾和125毫摩爾的氯化鈉，這 樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液；需要注意的是，需要在校正緩沖液中同時加入 三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細胞膜內外運動；神經節細胞在不同校正 人工腦脊液的孵育下，將產生不同的熒光強度，記之為FJ ;熒光強度F^均對應已知的氯 離子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的二維相關系數；最后，緩沖液內加入 150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內染料，使此時熒光強度歸零，記為Fsra ;最后，根據 Stern-Volmer公式，F。/Fd—= K*[Cl—]i ;其中，[CI—]t代表細胞內氯離子濃度；F。 = Fcl—_FSCN ;K為Stern-Volmer淬滅常數，代表熒光淬滅率達到50%時的細胞內氯離子濃度[Cl—]i ;根 據以上獲得的數據做出標準曲線，計算出常數K。
全文摘要
本發明公開了一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統的外周神經系統氯成像方法，按照如下步驟(1)單個神經節細胞與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正單個神經節細胞內氯離子熒光探針MQAE熒光值。本發明的主要優點如下①可定量檢測外周神經系統內單個神經節細胞的氯離子濃度及其變化情況；②對所檢測神經節細胞能夠以熒光形式可視化氯離子濃度；③采用的氯離子熒光探針MQAE在可見光下被激發，故自發熒光小，對神經元的損害較小。
文檔編號G01N21/64GK101788483SQ20101011228
公開日2010年7月28日 申請日期2010年2月23日 優先權日2010年2月23日
發明者千年松, 季茹, 李俊杰, 楊雁靈, 武勝昔, 王亞云, 魏燕燕 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學