以癌特異性抗原為靶的抗體的制作方法

專利名稱：以癌特異性抗原為靶的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于癌癥治療的抗體、特征為含有該抗體作為有效成分的癌癥治療用藥物組合物、癌的檢測方法、癌檢測試劑盒。
背景技術：
已知腫瘤細胞根據細胞的種類而表達特有的抗原蛋白質(以下可稱為腫瘤相關抗原)。因此，人們嘗試研究以該腫瘤相關抗原為靶，開發針對腫瘤的新型治療方法。已知對于腫瘤相關抗原顯示特異性抗原-抗體反應的單克隆抗體可以誘導各種機體免疫反應 (抗體依賴性細胞介導細胞毒活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒活性(CDC)等)，攻擊癌細胞， 誘導細胞死亡，因此，能夠開發出對腫瘤治療有用的單克隆抗體。但是，已知對腫瘤的治療有效的單克隆抗體僅限于轉移性乳癌、急性骨髓性白血病、難治性慢性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤等幾種腫瘤，人們希望獲得可用于其它腫瘤的治療的單克隆抗體。為了獲得對腫瘤的治療有效的單克隆抗體，通過對在腫瘤細胞中特異性表達的蛋白質進行鑒定，獲得以該蛋白質為抗原的單克隆抗體，這是有效的方法。人oculospanin是作為表達序列標志(EST)克隆，由在視網膜色素上皮和眼球脈絡膜中表達的基因獲得的蛋白質(Molecular Vision, (2002)8,25-220) 人oculospanin 基因具有1068bp的開放閱讀框，人oculospanin含有355個氨基酸，由DNA序列推定的分子量為36. 4kDa，人oculospanin與腫瘤的關系尚不明確。

發明內容
本發明發現了在癌中特異性表達的基因，其目的在于提供通過檢測該基因的表達而檢測癌的方法，該檢測方法中使用的癌檢測試劑盒，與該基因的表達產物特異性結合、 具有細胞毒活性的抗體，含有該抗體作為有效成分的癌癥治療用藥物組合物。本發明人在探索在人的癌組織中特異性表達的基因的過程中，發現功能尚不明確的人oculospanin基因的表達量在黑素瘤細胞中顯著增加，從而提供了使用該基因的癌的檢測方法、癌檢測試劑盒以及含有抗人oculospanin抗體的癌癥治療用藥物組合物，完成了本發明。S卩，本發明包含(1)抗體，該抗體與人oculospanin特異性結合，對于表達該蛋白質的細胞具有細胞毒活性；(2)抗體，該抗體與含有序列表中SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列的蛋白質和/或含有序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的蛋白質特異性結合，對于表達該蛋白質的細胞具有細胞毒活性；(3) (1)或O)的抗體，其特征在于細胞毒活性為抗體依賴性細胞介導細胞毒活性；(4) (1)或O)的抗體，其特征在于細胞毒活性為補體依賴性細胞毒活性；(5) (1)或O)的抗體，其特征在于細胞毒活性為補體依賴性細胞介導細胞毒活性；(6)⑴或⑵的抗體，其特征在于細胞毒活性為誘導編程性細胞死亡；(7) (1)-(6)中任一項的抗體，其特征在于所述抗體為單克隆抗體；(8) (7)的抗體，其特征在于所述抗體由小鼠雜交瘤03B8-2C9-4F3 (FERM BP-08627)生成；(9) (1)-(8)中任一項的抗體，其特征在于所述抗體為人源化抗體；(10) (1)-(7)中任一項的抗體，其特征在于所述抗體為完全人抗體；(11) (I)-(IO)中任一項的抗體，其特征在于所述抗體為IgG抗體；(12)癌的檢測方法，該方法包含下述步驟1)-4)1)由受試者采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟、2)由正常人采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟、3)測定來自上述步驟1)的總RNA組分和來自上述步驟2~)的總RNA組分中下述 a)或b)中任一項的多核苷酸表達量的步驟a)含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的多核苷酸，b)與含有與上述a)的多核苷酸互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸、4)分析由上述步驟幻測定來自上述步驟1)的總RNA組分和來自上述步驟2)的總RNA組分之間的多核苷酸表達量的差異，檢測上述步驟1)的受試者的癌的步驟；(13)癌的檢測方法，該方法包含下述步驟1)-3)1)對由受試者采集的檢體中含有序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質和/或含有序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的蛋白質的表達量進行測定的步驟、2)測定由正常人采集的檢體中至少任意一種上述步驟1)所述的蛋白質的表達量的步驟、3)分析由上述步驟1)檢測的蛋白質的表達量與由上述步驟幻測定的該蛋白質的表達量的差異，檢測受試者的癌的步驟；(14) (12)或(13)中任一項的方法，其特征在于所述癌為皮膚癌；(15) (12)或(13)中任一項的方法，其特征在于所述癌為黑素瘤；(16) (12)、(14)和(15)中任一項的方法，其特征在于測定多核苷酸的表達量的方法為RNA印跡法、斑點印跡法、狹線印跡法、RT-PCR、RNA酶保護測定或連綴轉錄測定；(17) (12)、(14)和(15)中任一項的方法，其特征在于測定多核苷酸的表達量的方法是使用通過DNA制備的基因芯片或陣列，其中所述DNA含有來自檢體的、互補的DNA群或該DNA群的各DNA的部分序列；(18) (13)-(15)中任一項的方法，其特征在于蛋白質表達量的測定方法是使用與該蛋白質特異性結合的抗體或配體；(19) (13)-(15)中任一項的方法，其特征在于蛋白質表達量的測定方法為蛋白質印跡法、斑點印跡法、狹線印跡法或固相酶聯免疫定量法(ELISA法)；(20)癌檢測試劑盒，該癌檢測試劑盒包含選自下述1) -3)的至少一種1)用于特異性擴增含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的多核苷酸的 15-30個堿基長度的連續的寡核苷酸引物、2)與含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的多核苷酸在嚴謹條件下雜交，用于檢測該多核苷酸的15個核苷酸或以上的連續的多核苷酸探針、3)固定有含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的多核苷酸的固相化試樣；(21)癌檢測試劑盒，該癌檢測試劑盒包含下述1)和2、的至少一種1)與含有序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質和/或含有序列表中 SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的蛋白質特異性結合，用于檢測該蛋白質的抗體、2)可與上述1)的抗體結合的二次抗體；(22) (20)或的試劑盒，其特征在于所述癌為皮膚癌；(23) (20)或的試劑盒，其特征在于所述癌為黑素瘤；(24)癌癥治療用藥物組合物，其特征在于該組合物含有(I)-(Il)的抗體的至少任意一種；(25)癌癥治療用藥物組合物，該組合物包括具有與序列表中SEQID NO. 1所示的核苷酸序列或與該序列的部分序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸；(26) (24)或0 中任一項的藥物組合物，其特征在于所述癌為皮膚癌；(27) (24)或05)中任一項的藥物組合物，其特征在于所述癌為黑素瘤。


圖1的上圖是表示各種細胞株內人oculospanin基因的表達量的圖表。圖1的下圖是表示健康人皮膚樣本和黑素瘤樣本中人oculospanin基因的表達量的圖表。圖2的上圖是表示健康人皮膚樣本和來自皮膚組織的黑素瘤樣本中人 oculospanin基因的表達量的圖表。圖2的下圖是表示健康人皮膚樣本和來自淋巴結組織的黑素瘤樣本中人oculospanin基因的表達量的圖表。圖3是表示來自健康人淋巴結樣本和來自淋巴結組織的黑素瘤樣本中人 oculospanin基因的表達量的圖表。圖4是表示人oculospanin基因產物在NIH3T3細胞中的表達的圖。圖5是表示使用了人oculospanin表達細胞的抗人oculospanin抗體的抗體依賴性細胞毒活性的圖。
具體實施例方式本說明書中，具有癌癥治療效果的化合物是指具有抑制癌的生長的活性、使癌縮小的活性的化合物。本說明書中，“癌”和“腫瘤”以相同的含義使用。本說明書中，術語“基因”不僅指DNA，也包含其mRNA、cDNA及其cRNA。因此，本發明中的“人oculospanin基因”包含人oculospanin的DNA、mRNA、cDNA和cRNA。本說明書中，術語“多核苷酸”以與“核酸”相同的含義使用，也包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸和引物。本說明書中，“多肽”與“蛋白質”未加區別地使用。本說明書中，“RNA組分”是指含有RNA的組分。本說明書中，“細胞”也包含動物個體內的細胞、培養細胞。本說明書中，“細胞癌化”是指細胞喪失對接觸抑制現象的感受性或者顯示支架非依賴性增殖等，顯示細胞的異常生長，將所述顯示異常生長的細胞稱為“癌細胞”。本說明書中，與人oculospanin所具有的細胞的癌化活性等具有同等機能的蛋白質也稱為人oculospanin。本發明中的術語癌基因(Oncoge)除癌基因之外，也包含癌前期基因、原癌基因。本發明中的“細胞毒”是指以任意的形式導致細胞病理性變化，不限于直接的外傷，指DNA切斷或堿基二聚體的形成、染色體的切斷、細胞分裂裝置的損傷、各種酶活性的降低等所有細胞結構或機能上的損傷。本發明中的“細胞毒活性”是指引起上述細胞毒。本發明中，“在嚴謹的條件下雜交”是指在68°C、在市售的雜交溶液ExpressHyb 雜交溶液(Clontech公司制造)中進行雜交，或者是使用固定有DNA的濾膜、在0. 7-1. OM NaCl存在下、在68°C下進行雜交，然后在68°C使用0. 1-2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度SSC 溶液含有150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)進行清洗，由此可進行鑒定的條件或在與其同等的條件下雜交。1.人 oculospanin(1)人oculospanin基因特異性表達的確認對人oculospanin基因在人的各種細胞株群中基因表達量進行分析，結果本發明人發現與其它組織相比，在黑素細胞中顯示顯著高的表達量，并且，與正常的黑素細胞相比，在黑素瘤中的表達量顯著增加。例如，比較黑素細胞、成淋巴細胞、格利雅細胞、上皮細胞之間人oculospanin的表達量，本發明人所發現在黑素細胞中表達量顯著高，另外，將正常的皮膚細胞與黑素瘤中的人oculospanin表達量進行比較，則黑素瘤中人oculospanin 表達量顯著高。因此可認為人oculospanin與細胞的癌化和/或癌細胞的增殖有關。S卩，通過測定人oculospanin在各細胞和/或各組織中的表達量，可以判定起因于人oculospanin 過量表達而發生的癌變和/或癌細胞的增殖的狀態。上述癌例如有皮膚癌、特別是黑素瘤。 只要是人oculospanin的表達量比在其它組織中有顯著增殖的癌，也可以適用于皮膚癌以外的癌。人oculospanin基因的開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示。人oculospanin的cDNA在GenBank中以 Homo sapiens oculospanin (OCSP) mRNA (登錄號ΝΜ_0. 31945)注冊，注冊于 GenBank 的 cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0. 3所示，ORF表示為SEQ IDN0. 3中核苷酸編號 65-1129。另外，與注冊于GenBank的人oculospanin的氨基酸序列同一的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0. 4所示。人oculospanin的氨基酸序列也包括含有1個或多個氨基酸置換、缺失、附加的氨基酸序列，與人oculospanin具有同等生物活性的蛋白質。2.癌的檢測方法人oculospanin在癌細胞、特別是黑素瘤中可見高表達，因此可認為與細胞、特別是皮膚細胞的癌化和/或癌細胞的增殖有關。“檢體”是指可由受試者或臨床檢體等中得到的血液、體液、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臟、口腔、咽頭、口唇、舌、牙齦、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臟、膽囊、胰臟、鼻、肺、骨骼、軟骨組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結、肌肉、脂肪組織等組織或排泄物等的試樣，但本發明中更優選皮膚或淋巴結。(1)利用人oculospanin基因的表達量的癌檢測方法利用人oculospanin基因的表達量的癌檢測方法是具體包含以下步驟1)_4)的方法。1)由受試者采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟；2)由正常人采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟；3)測定上述步驟1)的總RNA組分和上述步驟2)的總RNA組分中人oculospanin 基因表達量的步驟；4)由上述步驟3)測定來自上述步驟1)的總RNA組分和來自上述步驟2)的總RNA 組分之間的基因表達量，分析其表達量的差，檢測上述步驟1)的受試者的癌的步驟。以下具體說明各步驟。a)步驟1)由受試者采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟；由檢體提取總RNA組分時，可采取以下方法回收細胞，然后迅速地轉移至RNA提取步驟。所述方法有將通過符合適當的實驗倫理基準的方法獲得的、來自人的組織用RNA提取溶劑(例如苯酚等含有具有使RNA酶失活的作用的成分的溶劑)直接溶解，或者不破壞該組織的細胞用刮棒小心刮取，或者使用胰蛋白酶等蛋白質分解酶平穩地從組織中提取細胞等方法。RNA提取方法可以采用硫氰酸胍·氯化銫超速離心法、硫氰酸胍·熱酚法、鹽酸胍法、酸性硫氰酸胍 苯酚 氯仿法(Chomczyns ki,P. and Sacci，N.，Anal. Biochem. (1987)， 162,156-159)等，優選酸性硫氰酸胍·苯酚·氯仿法。還可以按照試劑所附說明書使用市售的RNA提取試劑(例如ISOGEN(Nippon Gene制造)、TRIZOL試劑(Gibco BRL制造))寸。根據需要，進一步優選將所得總RNA組分純化為只有mRNA以備使用。純化方法沒有特別限定，例如可以將mRNA吸附于生物素化的低聚(dT)探針上，再利用生物素/鏈霉抗生物素之間的鍵，在固定有鏈霉抗生物素的順磁珠上捕捉mRNA，洗滌操作，然后通過洗脫 mRNA來純化mRNA。還可以采用使mRNA吸附于低聚(dT)纖維素柱上，接著將其洗脫、純化的方法。不過，本發明的方法中，這些mRNA的純化步驟不是必須的，只要可檢測出作為檢測對象的多核苷酸的表達，可以將總RNA組分用于以后的步驟。b)步驟2、由正常人采集檢體，由該檢體提取總RNA組分的步驟；本發明中，正常人是指沒有癌癥的人。是否為正常人，可以測定人oculospanin 的濃度，看其濃度是否在預先確定的正常人的值的數值范圍內來判定，通過預先研究人 oculospanin的表達量與正常人的癌的形成率的相關關系，通過測定由受試者采集的檢體中的人oculospanin表達量，即可以判定受試者是否為正常人。從正常人體內制備總RNA 組分的步驟可以與上述步驟1)同樣地進行。c)步驟3)測定上述步驟1)的總RNA組分和上述步驟2)的總RNA組分中人 oculospanin基因表達量的步驟；這里，人oculospanin基因的表達量以與含有序列表中SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列的多核苷酸、或者含有與序列表中SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸的表達量來表示。對于人oculospanin基因的表達量的測定方法——使用固相化試樣的測定方法以及其它幾種測定方法進行說明。(a)使用固相化試樣的測定方法(i)固相化試樣固相化試樣例如有以下。①基因芯片可使用將以數據庫上的EST (表達序列標志)序列或mRNA序列為基礎合成的反義寡核苷酸固相化的基因芯片。這樣的基因芯片可以使用Affymetrix公司制造的基因芯片 (Lip Shutz, R. J.等.，Nature Genet. (1999)，21，supplement，20-24)，但并不限于此，可以按照公知的方法制備。對來自人細胞的mRNA進行分析時，優選來自人的基因芯片，例如可以使用Affymetrix公司制造的人U95系列或U133系列。但是并不限于此，例如也可以使用來自近緣種動物的芯片。②固相化有由人總RNA或由特定的組織得到的總RNA制備的cDNA或RT-PVR產物的陣列或膜濾器上述cDNA或RT-PCR產物如下獲得以人的EST數據庫等序列信息為基礎制備引物，通過該引物實施反轉錄酶促反應或PCR來克隆。該cDNA或RT-PCR產物也可以利用扣除法(Diatchen ki, L，等，Proc. Natl, Acad. Sci, USA(1996)93，6025-6030)、差別顯示法(Liang, P.，等，Nucleic Acids Res.，(1992)23,3685-3690)等，預先選擇有腫瘤的人和沒有腫瘤的人之間表達量不同的總RNA。陣列或濾膜還可以使用市售的產品(例如 IntelliGene =Takara Bio公司制造等)。還可以使用市售的點樣儀(例如GMS417 arrayer Ta kara Bio公司制造等)，通過固相化來制備上述cDNA或RT-PCR產物。(ii)探針的制備和分析標記探針可以不使用特定的mRNA克隆，而使用將所表達的全部的mRNA進行了標記的探針。用于制備探針的起始材料可以使用未經純化的mRNA，優選使用由上述的方法純化的Poly (A)+RNA。以下，對使用各種固相化試樣時的標記探針的制備方法和檢測、分析方法進行說明。①Affymetrix公司制造的基因芯片根據Affymetrix公司制造的基因芯片所附的說明書(Affymetrix公司表達分析技術手冊)制備生物素標記的cRNA探針。接著根據Affymetrix公司制造的基因芯片所附的說明書(表達分析技術手冊)，使用Affymetrix公司制造的分析裝置(GeneChip Fluidics Station 400)進行雜交和分析，檢測抗生物素蛋白發光并進行分析。②陣列通過反轉錄酶促反應，由Poly (A)+RNA制備cDNA時，需要標記cDNA，以便可檢測出 cDNA，用熒光染料標記時，通過加入用熒光染料(例如Cy3、Cy5等)標記的d_UTP等來熒光標記cDNA。此時，如果用不同的染料分別標記來自黑素瘤細胞的Poly (A)+RNA和來自對照細胞的Poly (A)+RNA,則在之后雜交時可以將兩者混合使用。例如使用Takara Bio (株)生產的陣列時，可以按照該公司的說明進行雜交和洗滌，用熒光信號檢測儀(例如GMS418陣列掃描儀(Takara Bio (株)制造等)檢測熒光信號，然后進行分析。不過，所使用的陣列并不限于市售的產品，可以自制，也可以是特別制備的。③膜濾器通過逆轉錄酶反應，由Poly(A)+RNA制備cDNA時，可以通過加入放射性同位素(例如d-CTP等)制備標記探針，再按照常規方法進行雜交，使用例如市售的膜濾器制造的微陣列一Atlas systenKClontech公司制造)進行雜交和清洗，然后使用分析裝置(例如 Atlas Image =Clontech公司制造等)進行檢測、分析。上述①-③中任一項的方法都是在同一批次的固相化試樣上進行來自人各種組織的探針雜交。此時，除所使用的探針不同以外，雜交的其它條件均相同。使用熒光標記探針時，如果用分別不同的熒光染料標記探針，則一個固相化試樣上可以一次與兩種探針的混合物雜交，并可以讀取熒光強度(Brown, P.O.等.，Nature Genet.，(1999)21， supplement,p.33-37)。(b)其它測定方法除上述以外的測定方法有扣除克隆法(參照實驗醫學別冊新基因工程手冊、羊土社發行(1996)，32-35頁)、差別顯示法(基礎生化學實驗法4核酸 基因實驗II.應用編、東京化學同人0001)，125-1 頁)、使用報道基因的方法(氯霉素乙酰轉移酶(例如使用pCAT3-BasiC載體=Promega公司制造)、β -半乳糖苷酶(例如使用ρ β gal-Basic Promega公司制造)、分泌型堿性磷酸酶(例如使用pSEAP2_Basic =Clontech公司制造)、 綠色熒光蛋白(例如使用pEGFP-1 =Clontech公司制造))，但不限于這些。步驟4)由上述步驟幻測定來自上述步驟1)的總RNA組分和來自上述步驟2)的總RNA組分的基因表達量，分析其表達量的差，檢測上述步驟1)的受試者的癌的步驟。來自正常人的的檢體和來自受試者的檢體之間人oculospanin表達量的差異進行分析，可以判定在人oculospanin的表達量顯著增加的檢體中，癌、特別是皮膚癌、更進一步，黑素瘤存在的可能性高，可以檢測出癌。表達量顯著增加例如是指使用Affymetrix 公司的microarray Suite Ver. 3. O進行分析時，來自黑素瘤細胞的基因的平均差異值比正常黑素細胞顯著增加的情況。另外，測定人oculospanin基因的濃度，分析其濃度是否在預先確定的正常人的值的數值范圍，超過預先確定的正常人的值的數值范圍，則判定為有癌，由此可檢測癌，并且通過預先研究人oculospanin的表達量與正常人的癌的形成率的相關關系，通過測定由受試者采集的檢體中人oculospanin的表達量，可以判定受試者是否為正常人。(3)利用人oculospanin的表達量(蛋白質表達量)的癌檢測方法具體來說，利用人oculospanin的表達量的癌的檢測方法是包含以下步驟1)_3) 的方法。1)測定由受試者采集的檢體中人oculospanin表達量的步驟、2)測定由正常人采集的檢體中上述1)的蛋白質的表達量的步驟、3)對由上述步驟1)測定的蛋白質的表達量與由上述步驟幻測定的該蛋白質的表達量的差異進行分析，檢測受試者的癌的步驟。以下，具體說明各步驟。a)步驟1)測定由受試者采集的檢體中人oculospanin表達量的步驟(a)由檢體制備蛋白質測定用試樣
檢體可如下制備根據需要進行高速離心，除去不溶性的物質，然后如下制成 ELISA/RIA用試樣、蛋白質印跡用試樣。ELISA/RIA用試樣例如可直接使用回收的皮膚或淋巴結，或者使用用緩沖液適當稀釋后的物質。蛋白質印跡用(電泳用)試樣例如可直接使用皮膚或淋巴結的提取液，或者用緩沖液稀釋，與含有SDS-聚丙烯酰胺電泳用的2-巰基乙醇的樣品緩沖液(Sigma公司制造)混合。進行斑點/狹線印跡時，例如可以使用印跡裝置等，使回收的皮膚或淋巴結提取液本身、或者用緩沖液稀釋后的物質直接吸附于膜上。(b)試樣的固相化為了特異性檢測由上述得到的試樣中的蛋白質，可通過免疫沉降法、利用配體的鍵合的方法等使其沉淀，不經固相化即可檢測，也可以使要檢測的該試樣固相化。使蛋白質固相化時，在蛋白質印跡法、斑點印跡法或狹線印跡法中使用的膜可以是硝基纖維素膜 (例如BioRad公司制造等)、尼龍膜(例如Hybond-ECL(A mershamPharmacia公司制造) 等)、棉膜(例如blot absorbent filters (BioRad公司制造)等)、或者聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜(BioRad公司制造等)等。為了通過ELISA法/RIA法進行蛋白質的檢測·定量，可以在專用的96孔板(例如Immunoplate. Maxisorp (Nunc公司制造)等)中加入試樣或其稀釋液(例如用含0. 05% 疊氮化鈉的磷酸緩沖生理鹽水(以下稱為“PBS”)稀釋后的產物)，在4°C -室溫下過夜，或在37°C靜置1-3小時，使蛋白質吸附于孔內底面并固相化。抗人oculospanin抗體可采用常規方法(例如參照新生化學實驗講座1、蛋白質1、389-397頁、199 ，通過將人oculospanin或選自人oculospanin的氨基酸序列的任意多肽免疫動物，采集機體內生成的抗體并純化來獲得。另外，按照公知的方法(例如 Kohler and Milstein, Nature 256,495-497,1975,Kennet,R. ed. ,Monoclonal Antibody, p. 365-367,1980, Prenum Press, N, Y.)，通過使生成抗人oculospanin抗體的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞融合，構建雜交瘤，獲得單克隆抗體。作為抗原的人oculospanin可以通過基因操作，使人oculospanin基因在宿主細胞中生成來獲得。具體來說，制備可表達人oculospanin基因的載體，將其導入宿主細胞， 使該基因表達，然后純化表達的人oculospanin。(c)人oculospanin表達量的測定人oculospanin的表達量以含有序列表中SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列的蛋白質的表達量表示。表達量的測定可以使用上述抗人oculospanin抗體，采用蛋白質印跡法或斑點/ 狹線印跡法等公知的方法測定。b)步驟2、測定由正常人采集的檢體中上述1)的蛋白質的表達量的步驟由正常人采集的檢體中的人oculospanin表達量的測定可采用與上述步驟1)同樣的方法進行。c)步驟幻對由上述步驟1)測定的蛋白質的表達量與由上述步驟2~)測定的該蛋白質的表達量的差異進行分析，檢測受試者的癌的步驟對來自正常人的檢體和來自受試者的檢體之間人oculospanin的表達量的差異進行分析，可以判定在人oculospanin表達量顯著增加的檢體中，癌、特別是皮膚癌、更進一步、黑素瘤存在的可能性高，可以檢測出癌。另外，測定人oculospanin的濃度，分析其濃度是否在預先確定的正常人的值的數值范圍，超過預先確定的正常人的值的數值范圍，則判定為有癌，由此可檢測癌，通過預先研究人oculospanin表達量與正常人的癌的形成率的相關關系，通過測定由受試者采集的檢體中人oculospanin的表達量，可以判定受試者是否為正常人。3.人 oculospanin 基因禾口人 oculospanin 的鑒定人oculospanin基因和人oculospanin在人的正常組織間，在黑素細胞中表達量顯著增加，并且，與正常黑素細胞相比，在黑素瘤中表達量顯著增加。研究人oculospanin的機能的方法是首先，通過集落雜交法等公知的方法，從來自表達人oculospanin的細胞的人cDNA文庫中獲得全長cDNA。將該全長cDNA導入小鼠或人細胞中，使其高表達，研究是否對細胞產生影響。為了使cDNA在動物個體內表達，可以采用將所得全長cDNA整合到病毒載體中施用于動物的方法。通過病毒載體導入基因的方法例如有將cDNA整合到反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒等DNA病毒、或RNA病毒中整合并導入的方法。其中優選使用反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒的方法。非病毒性的基因導入方法有將表達質粒直接施用于肌肉內的方法(DNA疫苗法)、脂質體法、脂轉染法、微量注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，其中，優選DNA疫苗法、脂質體法。將全長cDNA導入來自人、小鼠、大鼠等的肌細胞、肝細胞、脂肪細胞、或肌細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞等，使其高表達，可以對培養細胞進行各目標細胞所具有的機能、 具體地說，糖或脂質的產生或攝取、或者調節糖原的積蓄等糖脂質代謝的機能，或者對于細胞的形態有什么樣的影響的研究。相反，還可以將要試驗的基因的mRNA的反義核酸導入細胞，研究這對各目標細胞的機能或形態有什么樣的影響。將全長cDNA導入動物或細胞時，將該cDNA整合到含有適當的啟動子和與表達有關的序列的載體中，由該載體轉化宿主細胞。脊椎動物細胞的表達載體通常可以具有位于要表達的基因的上游的啟動子、RNA的剪切位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列等，還可以根據需要具有復制起點。該表達載體的例子有具有SV40的早期啟動子的 pSV2dhfr (Subramani, S.等·，Mol. Cell. Biol.，(1981)，1,854-864 頁)、反轉錄病毒載體 pLNCX、pLNSX、pLXIN、pSIR(Clonteeh 公司制造)、粘粒載體 pAxCw(Takara Bio 公司制造)等，但不限于此。該表達載體可以通過二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖法(Luthman， H andMagnusson, G. (1983)，Nucleic Acids Res. 11，p. 1295-1308)、磷酸鈣-DNA 共沉淀法(Grabam, F. L. and van der Eb, A. J. (1973)，Virology, 52, p. 456-457)和電脈沖穿孔法(Neumann, Ε.等.，(1982)，EMBO J. 1，p. 841-845)等，整合到猴的細胞 COS 細胞 (Gluzman, Y. (1981)，Cell 23，175-182，(ATCC CRL-1650))或中國倉鼠卵巢細胞(CH0 細胞，(ATCCCCL-61))的二氫葉酸還原酶缺失細胞株(Urlaub, G. and Chasin，L. Α.，Proc.， Natl. Acad. Sci, USA(1980) 77，4126-4220頁)等中，但不限于此。可以獲得上述所需的轉化體。在正常動物中，通過基因操作可以制備使目標基因高表達的轉基因動物，研究對細胞的形態有什么樣的影響。相反，可以在具有黑素瘤的動物中制備對象基因遭到破壞的
11敲除動物，判定細胞的狀態。4.人oculospanin基因和/或人oculospanin基因檢測試劑盒人oculospanin基因和/或人oculospanin可以使用選自以下1)-5)的至少一種的試劑盒進行檢測。1)用于使含有序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的多核苷酸特異性擴增的 15-30個堿基長度的連續的寡核苷酸引物；2)與含有序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的、用于檢測該多核苷酸的15個核苷酸或以上的連續的多核苷酸探針；3)可與含有序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的多核苷酸雜交的固相化試樣；4)與含有序列表中SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的蛋白質特異性結合、用于檢測該蛋白質的抗體；5)可與上述4)的抗體結合的二次抗體。上述1)的引物可以根據人oculospanin基因的核苷酸序列(序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列)，使用市售的引物設計軟件(例如Wisconsin GCG package Version 10. 2)等，按照常規方法，容易地設計并擴增。例如為了擴增含有序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的多核苷酸，上述引物可以使用含有序列表中SEQ ID N0. 5所示核苷酸序列的寡核苷酸與含有序列表中SEQ ID N0. 6所示核苷酸序列的寡核苷酸的組合。另外，上述2~)的探針是與人oculospanin特異性雜交的多核苷酸，為100-1500個堿基長度， 優選300-600個堿基長度。這些引物或探針可由適當的標記進行標記(例如酶標記、放射性標記、熒光標記等)，也可以附加接頭。上述幻的固相化試樣可通過將上述2~)的探針固定在玻璃板、尼龍膜等固相上來制備。這樣的固相化試樣的制備方法已經在“2.癌的檢測方法”一項中的“(1)利用人 oculospanin基因的表達量的癌的檢測方法”項下“(1)使用固相化試樣的測定方法”中進行了說明，例如有基因芯片、cDNA陣列、寡聚體矩陣(oligo-array)、膜濾器等。本發明的試劑盒還可以含有耐熱性DNA聚合酶、dNTP(dATP、dCTP、GTP, dTTP的混合物)和緩沖液。耐熱性DNA聚合酶的例子有Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(寶酒造社制造)、Tth DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等。緩沖液根據所使用的DNA聚合酶來選擇， 根據需要，可以添加Mg2+等。上述4)和5)的抗體可通過上述“2.癌的檢測方法”一項中的“(3)利用人 oculospanin表達量(蛋白質表達量)的癌的檢測方法”項或“5.抗人oculospanin抗體的制備”項的方法制備。該抗體可由適當的標記進行標記(例如酶標記、放射性標記、熒光標記等)。本發明的試劑盒可用于檢測人oculospanin基因和/或人oculospanin的檢測， 也可用于判定有無癌、抑制癌的增殖的物質的篩選。5.抗人oculospanin抗體的制備(1)抗原的制備用于制備抗人oculospanin抗體的抗原有人oculospanin或其含有至少6個連續的部分氨基酸序列的多肽、或者向其中附加任意的氨基酸序列或載體的衍生物。
人oculospanin可以從人的腫瘤組織或腫瘤細胞中直接純化使用，還可以通過體外合成人oculospanin、或者通過基因操作在宿主細胞中生成而獲得。具體的基因操作中，將人oculospanin整合到可表達的載體中，然后在含有轉錄或翻譯所必需的酶、底物和能量物質的溶液中合成，或者通過轉化其它的原核生物或真核生物的宿主細胞使人 oculospanin表達，由此可得到該蛋白質。人oculospanin的cDNA的核苷酸序列記載于文獻(Graeme ffistow,Steven L. Bernstein,Μ. Keithffyatt,Robert N. Fariss,Amita Behal, Jeffrey W. Touchman, GerardBouffard, Don Smith, and Katherine Peterson (2002), Expressed sequence tag analysis of human RPE/choroids for the NEIBankProject Over 6000non-redundant transcripts, novel genes and splicevariants, Molecular Vision 8 :205-220)，在GenBank中以登錄號NM_031945注冊，其ORF記載于序列表的SEQ ID NO. 1中。人oculospanin的cDNA可通過所謂的PCR法獲得，所述PCR法例如是以表達人oculospanin的cDNA文庫為模板，使用特異性擴增人oculospanin cDNA的引物進行聚合酶鏈反應(以下稱為“PCR”)“參照 Sai ki,R. K.，等·，(1988), Science 239，487-49”。多月太的體夕卜合成例如有:Roche Diagnostics公司制造的rapidtranslation SyStem(RTS)，但不限于此。以使用RTS的情況為例，其合成是將目標基因克隆到由T7啟動子控制的表達載體中，將其添加到體外反應系統中，則最初通過T7RNA聚合酶，模板DNA 轉錄為mRNA，然后通過大腸桿菌溶解液中的核糖體等進行翻譯，在反應液中合成目標多肽 (Biochemica,1,20-23(2001)，Biochemica,2,28-29(2001)) 原核細胞的宿主例如有大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。將目標基因轉化這些宿主細胞內時，用含有來自與宿主相適應的種的復制子、即復制起點和調節序列的質粒載體轉化宿主細胞。載體優選具有可使轉化細胞具有表現型選擇性的序列的載體。例如，大腸桿菌常用K12菌株等，載體通常使用PBR322或pUC系的質粒，但并不限于這些，可以使用任何公知的各種菌株和載體。對于大腸桿菌，啟動子有色氨酸(trp)啟動子、乳糖(Iac)啟動子、色氨酸 乳糖 (tac)啟動子、脂蛋白(Ipp)啟動子、多肽鏈延伸因子Tu(tufB)啟動子等，任何啟動子都可用于目標多肽的生產。枯草桿菌例如優選207-25菌株，載體優選使用pTUB 228 (Ohmura, K.等.，(1984)， J. Biochem. 95,87-93)等，但不限定于這些。通過連接編碼枯草桿菌α -淀粉酶的信號肽序列的DNA序列，也可以在菌體外進行分泌表達。真核細胞的宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、酵母等的細胞，脊椎動物細胞例如常使用猴的細胞 COS 細胞(Gluzman，Y. (1981),Cell 23,175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠成纖維細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1650)或中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞、ATCC CCL-61)的二氫葉酸還原酶缺失細胞株(Urlaub, G. and Chasin, L. Α. (1980)，Proc.，Natl. Acad. Sci. USA 77,4126-4220頁)等，但不限定于此。脊椎動物的表達載體可以具有通常位于要表達的基因上游的啟動子、RNA的剪切位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列等，還可根據需要具有復制起點。該表達載體的一個例子有具有巨細胞病毒早期啟動子的P⑶NA 3. 1 (Invitrogen公司制造)、具有SV40的早期啟動子的 pSV2dhfr (Subramani，S.等.，(1981)，Mol. Cell. Biol. 1,854-864)等，但不限于這些。以使用COS細胞或NIH3T3細胞作為宿主細胞的情況為例，其中表達載體可以使用具有SV40復制起點，在COS細胞或OTH3T3細胞中可自主增殖，且具備轉錄啟動子、轉錄終止信號和RNA剪切位點的表達載體。該表達載體可通過DEAE-葡聚糖法(Luthman，H andMagnusson, G. (1983)，Nucleic Acids Res. 11，p. 1295-1308)、磷酸鈣-DNA 共沉淀法 (Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973)，Virology，52，p. 456-457)、以及電脈沖穿孔法 (Neumann, Ε.等.，(1982)，EMBO J. 1，p. 841-845)等，整合到 COS 細胞或 NIH3T3 細胞中， 即可得到上述所需的轉化細胞。另外，使用CHO細胞作為宿主細胞時，可以將表達載體和可表達發揮抗生素G418抗性標志機能的neo基因的載體例如如pRSVneo (Sambrook, J.等.， (1989) :Molecular Cloning A LaboratoryManual“ Cold Spring Harbor Laboratory,NY) 或 pSX2neo (Southern，P. J.，and Berg, P. (1982)，J. Mol. Appl. Genet. 1，327-341)等共轉染，通過選擇G418抗性集落來獲得穩定生產目標多肽的轉化細胞。上述得到的轉化體可按照常規方法進行培養，通過該培養，可在細胞內或細胞外生產目標多肽。該培養所使用的培養基可以根據所采用的宿主細胞，適當選擇常用的各種培養基，例如如果是上述COS細胞，則可以使用在RPMI1640培養基或Dulbecco改良fegle 培養基(以下稱為“DMEM”)等培養基中根據需要添加胎牛血清等血清成分而得的培養基。通過上述培養，轉化體的細胞內或細胞外生產的重組蛋白可以通過利用該蛋白質的物理性質或化學性質等的各種公知的分離操作法進行分離、純化。該方法的具體例子有 通過通常的蛋白質沉淀劑進行的處理，超濾，分子篩色譜(凝膠過濾)、吸附色譜、離子交換色譜、親和層析、高效液相色譜(HPLC)等各種液相色譜，透析法，以上的組合等。通過使所表達的重組蛋白與含有6個殘基的組氨酸連接，可以以鎳親合柱進行高效純化。通過將上述方法組合，可以簡便地、大量地制備高收率、高純度的目標多肽。(2)抗人oculospanin單克隆抗體的制備與人oculospanin特異性結合的抗體的例子是與人oculospanin特異性結合的單克隆抗體，其獲得方法如下。制備單克隆抗體時，通常必須有下述的操作步驟。即，(a)作為抗原使用的生物體高分子的純化、(b)通過向動物注射抗原進行免疫，然后采集血液，檢測其抗體效價，確定脾臟摘出時間，然后制備抗體生成細胞的步驟、(c)骨髓瘤細胞(以下稱為“骨髓瘤”)的制備、(d)抗體生成細胞與骨髓瘤的細胞融合、(e)生成目標抗體的雜交瘤群的選別、(f)分離成單一細胞克隆(克隆)、(g)根據情況，進行用于大量制備單克隆抗體的雜交瘤的培養、或者對移植了雜交瘤的動物的飼養、(h)對上述制備的單克隆抗體的生理活性及其結合特異性的探討，或者作為標記試劑的特性檢定等。以下，按照上述步驟詳述單克隆抗體的制備方法，但該抗體的制備方法并不受此限制，例如也可以使用脾細胞以外的抗體生成細胞和骨髓瘤。
(a)抗原的純化抗原可以使用以上述方法制備的人oculospanin或其一部分。也可以以由人 oculospanin表達重組細胞制備的膜組分或人oculospanin表達重組細胞本身、以及使用本領域周知的方法進行化學合成的本發明的蛋白質的部分肽作為抗原使用。(b)抗體生成細胞的制備將在步驟(a)中得到的抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或者鉀明礬等助劑混合， 以此作為免疫原，對實驗動物進行免疫。實驗動物可以隨意使用公知的雜交瘤制備方法中使用的動物。具體來說，例如可以使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。從與摘出的抗體生成細胞融合的骨髓瘤細胞的容易獲得性等角度考慮，優選以小鼠或大鼠作為被免疫動物。 對于實際使用的小鼠和大鼠的系統沒有特別限定，當為小鼠時，例如可以使用A、AKR、BALB/ c、BDP、ΒΑ、CE, C3H、57BL，C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HTI, LP、NZB, NZW、RF、R III、SJL, SWR、WB、129 等，當為大鼠時，例如可使用 Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer 等。這些小鼠和大鼠例如可由日本Clea、日本Charles River、日本SLC、The Jackson Laboratories等實驗動物飼養銷售商購得。其中，如果考慮到與后述骨髓瘤細胞的融合適性，特別優選小鼠采用BALB/c系統，大鼠采用low系統作為被免疫動物。另外，考慮到抗原在人和小鼠之間的同源性，優選使用排除自身抗體的機體功能下降的小鼠，即優選使用自身免疫疾病小鼠。這些小鼠或大鼠在免疫時的周齡優選5-12周齡，進一步優選6-8周齡。用人oculospanin或其重組體對動物進行免疫時，例如可采用Weir， D. Μ. Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III., Blackwell Scientific Pub Ii cat ions, Oxford (1987), Kabat, E. A. andMayer, Μ. Μ. , Experimental Imm unochemistry, Charles C ThomasPublisher Springfield Illinois (1964)等中i羊細i己載的公知的方法。如果具體給出這些免疫方法中適合本發明的方法，則例如如下。即，首先將作為抗原的膜蛋白組分或表達抗原的細胞施用于動物的皮內或腹腔內。為了提高免疫效率，優選兩者結合使用，前半期進行皮內施用，后半期或只在最后進行腹腔內施用，這樣可特別提高免疫效率。抗原施用時間根據被免疫動物的種類、個體差異等而不同，通常優選抗原施用次數為3-6次、施用間隔為2-6周，進一步優選施用次數為3-4次、施用間隔為2-4 周。過度增加施用次數，則浪費抗原，另外施用間隔過大，則因動物的老化而導致細胞的活性降低，不優選。抗原的施用量根據動物的種類、個體差異等而不同，通常為0.05-5ml、優選0. l-0.5ml左右。追加免疫自上述的抗原施用1-6周后、優選2-4周后、進一步優選2-3 周后進行。該追加免疫的時期比第6周遲，或者比第1周還早，則追加免疫效果小。進行追加免疫時的抗原施用量根據動物的種類、大小等而不同，例如為小鼠時，通常為0. 05-5ml, 優選0. 1-0. 5ml，進一步優選0. 1-0. 2ml左右。不必要的大量施用不僅使免疫效果降低，對于被免疫動物也不好。自上述追加免疫1-10天后、優選2-5天后、進一步優選2-3天后，無菌操作，由被免疫動物摘出含有抗體生成細胞的脾細胞或淋巴細胞。此時測定抗體效價，將抗體效價足夠高的動物作為抗體生成細胞的供給源使用，這樣可以提高以后的操作效率。這里使用的抗體效價的測定方法有RIA法、ELISA法、熒光抗體法、被動血凝法等各種公知的技術，從檢測靈敏度、迅速性、準確性和操作自動化的可能性等角度考慮，更優選RIA法或ELISA法。關于本發明中的抗體效價的測定，例如ELISA法可通過以下的順序進行。首先將純化或部分純化的抗原吸附于ELISA用96孔板等固相表面，再用與抗原無關的蛋白質、例如牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)覆蓋未吸附抗原的固相表面，洗滌該表面后，使其接觸作為第一抗體的、分步稀釋的試樣(例如小鼠血清)，使上述抗原與試樣中的單克隆抗體結合。再加入作為第二抗體的酶標記的抗小鼠抗體的抗體，使其與小鼠抗體結合，洗滌后加入該酶的底物，底物分解、顯色，測定由此導致的吸光度的變化，計算抗體效價。來自 這些脾細胞或淋巴細胞的抗體生成細胞的分離可按照公知的方法(例如 Kohler 等·，Nature,256,495,1975 ；Kohler 等·，Eur J. Immunol. ,6,511,1977 ；Milstein 等·，Nature，266，550，1977 ；Walsh, Nature, 266,495,1977)進行。例如，當為脾細胞時，可采用將細胞細細切碎，用不銹鋼網過濾，然后使其懸浮于Eagle極限必需培養基(MEM)，分離抗體生成細胞這樣的常規方法。(c)骨髓瘤細胞(以下稱為“骨髓瘤”)的制備對于在細胞融合中使用的骨髓瘤細胞沒有特別限制，可以由公知的細胞株中適當選擇使用。不過，考慮到從融合細胞中選擇雜交瘤時的便利性，優選使用該選擇步驟已得到確立的HGPRT(次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)缺失株。即為來自小鼠的 X63-Ag8 (X63)、NSI_Ag4/l (NSl)、P3X63_Ag8. Ul (P3U1)、X63_Ag8. 653 (X63. 653)、 SP2/0-Agl4(SP2/0) ,MPCl 1-45. 6TG1. 7(45. 6TG)、F0、S149/5XX0、BU. 1 等，來自大鼠的 210. RSY3. Ag. 1.2. 3 (Y3)等，來自人的 U266AR(SK0_007)、GM1500 · GTG-A12 (GM1500)、UC729-6、 LICR-L0ff-HMy2 (HMy2) ,8226AR/NIP4-1 (NP41)等。這些HGPRT缺失株例如可由美國菌種保藏中心(ATCC)購得。這些細胞株在適當的培養基、例如8-氮鳥嘌呤培養基[RPMI-1640培養基中加入谷胺酰胺、2-巰基乙醇、艮他霉素以及胎牛血清(以下稱為“FCS”)，在得到的培養基中加入 8_氮鳥嘌呤而得的培養基]、Iscove改良Dulbecco培養基(以下稱為“ IMDM”)、或Dulbecco 改良Eagle培養基(以下稱為“DMEM”)繼代培養，但在細胞融合之前3_4天起在正常培養基[例如含有10% FCS的ASF104培養基(味之素(株)制造)]繼代培養，融合當天要確保2X IO7或以上的細胞數。(d)細胞融合抗體生成細胞與骨髓瘤細胞的融合可以按照公知的方法(Weir，D. Μ. Handbook of Experimental Immunology Vol. I.II.III. , BlackwellScientific Publications, Oxford (1987), Kabat, Ε. A. , and Mayer, Μ. M. Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964)等)，在不會極度降低細胞的存活率的條件下適當實施。這樣的方法例如可以采用在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中將抗體生成細胞與骨髓瘤細胞混合的化學方法、利用電刺激的物理方法等。其中，上述化學方法的具體例子如下所示。即，使用聚乙二醇作為高濃度聚合物溶液時，在分子量為1500-6000、優選 2000-4000的聚乙二醇溶液中、在30-40°C、優選35-38°C的溫度下將抗體生成細胞和骨髓瘤細胞混合1-10分鐘、優選5-8分鐘。(e)雜交瘤群的選擇對于由上述融合細胞得到的雜交瘤的選擇方法并沒有特別限制，通常使用 HAT(次黃嘌呤 氨基喋呤 胸苷)選擇法[Kohler 等.，Nature，256，495(1975) ；Milstein 等，Nature 266,550(1977)]。該方法對于使用在氨基喋呤中不能存活的HGPRT缺失細胞株的骨髓瘤細胞得到雜交瘤時有效。即，通過將未融合細胞和雜交瘤在HAT培養基上培養，可以選擇性地只使同時對氨基喋令也具有抗性的雜交瘤存活，且使其增殖。(f)分離為單一細胞克隆(克隆)雜交瘤的克隆方法例如可以使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、有限稀釋法等公知的方法(例如參照 Barbara，B. M. and Stanley, Μ. S. Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman andCompany, San Francisco (1980))。該克隆方法是稀釋至孑L 板的每一個孔中含有1個雜交瘤進行培養的有限稀釋法、在軟瓊脂培養基中培養并回收集落的軟瓊脂法、通過顯微操作器一個個挑取細胞進行培養的方法、通過細胞分選儀分離1 個細胞的“分選克隆”等。這些方法中，特別優選有限稀釋法。該方法中，在微孔板上接種來自大鼠胚胎的成纖維細胞株、或者正常小鼠脾細胞、胸腺細胞、腹水細胞等的飼養細胞。另一方面，預先將雜交瘤在培養基中稀釋為0. 2-0. 5個/0. 2ml，分別向各孔中加入0. Iml該稀釋的雜交瘤懸浮液，每隔一定期間(例如每隔3天)將約1/3的培養基更換成新的培養基， 持續培養2周左右，這樣可使雜交瘤的克隆增殖。在確認具有抗體效價的孔中，例如將通過有限稀釋法進行的克隆過程重復2-4 次，將穩定后可確認具有抗體效價的細胞株選擇為抗人oculospanin單克隆抗體生成雜交瘤細胞株。將這樣克隆的雜交瘤細胞株之一命名為03B8-2C9-4F3，于2004年2月17日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目 1番地1中央第6)，保藏號為FERM BP-08627。(g)通過培養雜交瘤制備單克隆抗體通過培養這樣選擇的雜交瘤，可以高效獲得單克隆抗體，但優選培養之前對要生成目標單克隆抗體的雜交瘤進行篩選。該篩選可采用已知的方法。本發明的抗體效價的測定例如可根據ELISA法，按照以下的順序進行。首先，將純化或部分純化的人oculospanin或者表達人oculospanin的細胞吸附于ELISA用96孔板等固相表面，再用與抗原無關的蛋白質、例如牛血清白蛋白(以下稱為“BSA”)覆蓋未吸附抗原的固相表面，洗滌該表面后，使其接觸作為第一抗體的、分步稀釋的試樣(例如小鼠血清)，使上述抗原與試樣中的抗oculospanin抗體結合。再加入作為第二抗體的酶標記的抗小鼠抗體的抗體，使其與小鼠抗體結合，洗滌后加入該酶的底物，底物的分解、顯色，通過測定由此導致的吸光度的變化等計算抗體效價。這樣的篩選可以在上述雜交瘤克隆之后進行，也可以在之前進行。由以上的方法得到的雜交瘤可以在液氮中或-80°C以下的冷凍庫中以冷凍狀態保存。克隆終止的雜交瘤可以將培養基由HAT培養基轉換成正常培養基進行培養。大量培養可以通過使用大型培養瓶的旋轉培養或滾動培養進行。使用凝膠過濾等本領域技術人員周知的方法純化該大量培養中的上清，由此可得到與本發明蛋白質特異性結合的單克隆抗體。向相同系統的小鼠(例如上述BALB/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔內注射雜交瘤，使該雜交瘤增殖，由此可以得到大量含有本發明的單克隆抗體的腹水。腹腔內施用時，事先(3-7 天前)施用2，6，10，14_四甲基十五烷(pristine)等礦物油，則可得到更大量的腹水。 例如預先向與雜交瘤相同系統的小鼠腹腔內注射免疫抑制劑，使T細胞失活，20天后，使IO6-IO7 個雜交瘤克隆細胞懸浮于不含有血清的培養基中(0.5ml)，并腹腔內施用，通常在腹部膨脹、腹水積存時由小鼠采集腹水。通過該方法，可得到與培養液中相比約為10倍或以上濃度的單克隆抗體。由上述方法得到的單克隆抗體例如可通過Weir，D.M. =Handbookof Experimental Immunology Vol. I, II, III,Blackwell ScientificPublications,Oxford(1978)記載的方法純化。即硫酸銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法、親和層析法等。這些方法中，通過將硫酸銨鹽析法重復3-4次、優選3-6次，可以純化單克隆抗體。但是該方法中，純化單克隆抗體的收率極低。因此，通過對進行了 1-2次硫酸銨分級法的粗提純單克隆抗體進行至少一種、優選兩種選自凝膠過濾法、離子交換色譜法、親和層析法等的方法，可以以高收率獲得高純度純化的單克隆抗體。硫酸銨鹽析法與其它方法的組合和順序有a)硫酸銨鹽析法_離子交換色譜法_凝膠過濾法、b)硫酸銨鹽析法-離子交換色譜法_親和層析法、c) 硫酸銨鹽析法_凝膠過濾法_親和層析法等，為了高純度且高收率獲得單克隆抗體，特別優選上述c)的組合。作為簡便的純化方法，可以利用市售的單克隆抗體純化試劑盒(例如MabTrap GII 試劑盒；Pharmacia)等。上述所得單克隆抗體對人oculospanin具有高的抗原特異性。(h)單克隆抗體的檢定

上述所得單克隆抗體的同型和亞類的確定可如下進行。首先鑒定法有烏赫特朗尼氏法(Ouchterlony)、ELISA法或RIA法。烏赫特朗尼氏法簡便，但單克隆抗體濃度低時需要濃縮操作。而采用ELISA法或RIA法時，將培養上清直接與吸附有抗原的固相反應，再使用作為第二抗體的與各種免疫球蛋白同型、亞類對應的抗體，由此可以鑒定單克隆抗體的同型、亞類。另外，作為更簡便的方法，還可以利用市售的鑒定用試劑盒(例如Mouse Typer kit ；BioRad 制造)等。蛋白質的定量可通過由福林-酚試劑法、以及280nm下的吸光度[1.4(0D280)= 免疫球蛋白lmg/ml]計算的方法進行。(3)人源化抗人oculospanin抗體的制備免疫球蛋白G(以下簡稱為“IgG”)由各2條分子量約為23000的輕多肽鏈(以下稱為“輕鏈”)、分子量約為50000的重多肽鏈(以下稱為“重鏈”)構成。重鏈、輕鏈都具有保留有含約110個殘基的氨基酸序列的區的重復結構，這些構成IgG的立體結構的基本單元(以下稱為“結構域”)。重鏈和輕鏈分別由連續的4個和2個結構域構成。重鏈、輕鏈中，氨基末端的結構域與其它的結構域相比，各抗體分子間的氨基酸序列的變異大，將該結構域稱為可變域(以下稱為“V結構域”)。IgG的氨基末端中，重鏈、輕鏈的V結構域互補性結合，形成可變區。而其它的結構域整體形成恒定區。各種動物種的恒定區都具有特征性序列，例如小鼠IgG的恒定區與人IgG的恒定區不同，因此小鼠IgG在人的免疫系統內被識別為異物，結果，發生人抗小鼠抗體(以下稱為“HAMA”)應答(參照Schrof等.，Cancer Res.，45，879-85 (1985))。因此，小鼠抗體不能反復施用于人。為將這樣的抗體施用于人， 需要在保持抗體特異性的同時，對抗體分子進行修飾，以便不發生HAMA應答。X射線晶體結構分析結果表明通常，上述結構域的結構是含有3-5條β鏈的反平行β片層雙層重疊，形成長圓筒狀。可變區中，重鏈、輕鏈的V結構域分別各集合成3個環，形成抗原結合部位。該各環被稱為互補決定區(以下稱為“CDR”)，其氨基酸序列的變異最顯著。可變區⑶R以外的部分通常具有保持⑶R的結構的作用，被稱為“支架”。Kabat 等人收集眾多重鏈、輕鏈的可變區的一級序列，根據序列的保守性，制成了將一級序列分類為 CDR 和支架的表(Kabat 等，SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIHpublication, No. 91-3242，Ε. A.)。并將各支架分類為氨基酸序列具有共通特征的多個亞群。還發現人與小鼠之間存在對應的支架。由上 述IgG的結構特征有關的研究，人們提出以下的人源化抗體的制備方法。研究初期階段，人們提出了將來自小鼠抗體的可變區與來自人的恒定區連接而成的嵌合抗體(參照 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81，6851-6855，(1984))。但是，這樣的嵌合抗體依然含有很多非人氨基酸殘基，因此在特別長時間施用時，可能誘導HAMA應答(參照 Begent 等·，Br.J. Cancer,62，487，(1990))。關于進一步減少有可能對人表達HAMA應答的來自非人哺乳動物的氨基酸殘基的方法，有人提出了只將⑶R部分整合到來自人的抗體中的方法(參照Nature，型丄，522-525， (1986))，但通常為了對抗原保持免疫球蛋白活性，只移植CDR是不夠的。另一方面，Chothia等人采用X射線晶體結構分析數據，于1987年發現了 (i)CDR的氨基酸序列中存在與抗原直接結合的部位和保持CDR自身結構的部位， CDR的立體結構被分類為多種典型的模式(規范結構)；(ii)規范結構的分類不僅由CDR，也由支架部分特定位置的氨基酸種類確定(參照 J. Mol. Biol. , 196,901-917, (1987))。根據以上認識，采用CDR移植法時，除CDR的序列之外，一部分支架的氨基酸殘基也顯示了移植到人抗體中的必要性(參照日本特表平4-502408號)。通常，具有要移植CDR的來自非人哺乳動物的抗體被定義為“供體”，移植CDR的一側的人抗體被定義為“受體”，本發明也依從該定義。實施CDR移植法時要考慮的是盡可能保留CDR的結構，保持免疫球蛋白分子的活性。為了實現該目的，需要注意以下兩點(i)選擇屬于哪一種亞群的受體；(ii)從供體的支架中選擇哪一種氨基酸殘基。Queen等人提倡當供體支架的氨基酸殘基符合以下基準的至少其中之一時，該氨基酸與CDR序列一起移植到受體的設計方法(參照日本特表平4-502408)。(a)受體的支架區中的氨基酸在其位置上為稀少，供體的對應的氨基酸在受體的上述位置上為普通。(b)該氨基酸緊鄰一個⑶R。(c)在立體免疫球蛋白模型中，該氨基酸在CDR的約3 A以內具有支鏈原子，并且可與抗原或與人源化抗體CDR相互作用。編碼本發明的抗人oculospanin單克隆抗體的重鏈或輕鏈的DNA如下獲得由生產上述抗人oculospanin單克隆抗體的雜交瘤細胞制備mRNA，通過反轉錄酶將該mRNA轉換為cDNA，然后分別分離編碼該抗體的重鏈或輕鏈的DNA。進行mRNA提取時，可以采用硫氰酸胍·熱酚法、硫氰酸胍-鹽酸胍法等，優選硫氰酸胍·氯化銫法。由細胞制備mRNA，則通過以下的方法實施首先制備總RNA，使用低聚 (dT)纖維素或低聚(dT)膠乳珠等Poly(A)+RNA純化用載體，由該總RNA進行純化的方法；或者使用該載體，由細胞溶胞產物直接純化的方法。總RNA的制備方法可以采用堿蔗糖密度梯度離心法[參照 Dougherty，W. G. and Hiebert, Ε. (1980) Virology 101，466-474]、硫氰酸胍·酚法、硫氰酸胍·三氟化銫法、苯酚· SDS法等，優選使用硫氰酸胍和氯化銫的方法 [參照 Chirgwin，J. M.，等.(1979) Biochemistry 18,5294-5299]。可以以如上得到的Poly(A)+RNA為模板，通過反轉錄酶促反應合成單鏈cDNA鏈， 然后由該單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。該方法可采用Sl核酸酶法[參照Efstratiadis，
A.，等.(1976)Cell，7，279-288]、GubIer/Hoffmann 法[參照 Gubler，U. and Hoffman,
B.J. (1983)Gene25, 263-269] >0kayama/Berg^ [ Okayama,H. and Berg,P. (1982)Mol. Cell. Biol. 2,161-170]等，本發明中，優選以單鏈cDNA為模板進行聚合酶鏈反應(以下稱為 “PCR，，)[參照 Saiki，R. K.，等.(I988) Science239，487_49]的所謂 RT-PCR 法。將這樣得到的雙鏈cDNA整合到克隆載體中，將所得重組載體導入大腸桿菌等微生物中進行轉化，可以以四環素抗性或胺芐青霉素抗性等為指標，選擇轉化體。大腸桿菌的轉化可通過Hanahan法[參照 Hanahan，D. (1983) J. Mol. Biol. 166，557-580]，S卩、向氯化鈣、 氯化鎂或氯化銣共存而制備的感受態細胞中加入該重組DNA載體的方法實施。使用質粒作為載體時，必須具有上述抗藥性基因。也可以使用質粒以外的克隆載體、例如λ系的噬菌體等。由上述得到的轉化細胞株中選擇具有編碼目標抗人oculospanin單克隆抗體的各亞單元的cDNA的細胞株，該方法可以采用例如下示的各種方法。由上述RT-PCR法特異性擴增目標cDNA時，可以省略這些操作。(a)使用聚合酶鏈反應的方法要了解目標蛋白質的氨基酸序列的全部或部分時，則合成與該氨基酸序列的一部分對應的有義鏈和反義鏈的寡核苷酸引物，將它們組合，進行聚合酶鏈反應[參照Saiki， R.K.，等· (1988) Science 239，487-49]，擴增編碼目標抗人oculospanin抗體重鏈或輕鏈亞單元的DNA片段。這里所使用的模板DNA例如可使用通過反轉錄酶促反應，由生產抗人 oculospanin單克隆抗體的雜交瘤的mRNA合成的cDNA。這樣制備的DNA片段可以利用市售的試劑盒，直接整合到質粒載體中，也可以將該片段用32P、35S或生物素等標記，使用其作為探針，進行集落雜交或噬菌斑雜交，由此可以選擇目標克隆。例如，研究本發明的抗人oculospanin單克隆抗體各亞單元的部分氨基酸序列的方法優選采用以下方法使用電泳或柱層析等周知的方法分離各亞單元，然后利用自動蛋白質測序儀(例如島津制備所(株)制造的PPSQ-10)等，分析各亞單元的N末端氨基酸序列。由如上得到的目標轉化細胞株采集編碼抗人oculospanin單克隆抗體蛋白質各亞單元的cDNA的方法可按照公知的方法[參照Maniatis, T.，等.(1982) in" Molecular Cloning A Laboratory Manual" ColdSpring Harbor Laboratory, NY.]實施。例如可以通過從細胞中分離相當于載體DNA的組分，從該質粒DNA中切取編碼目標亞單元的DNA區來進行。(b)使用合成寡核苷酸探針的篩選方法要了解目標蛋白質的氨基酸序列的全部或部分時(該序列可以是多個連續的特異性序列即可，也可以是目標蛋白質的某一區)，合成與該氨基酸序列對應的寡核苷酸(此時可以采用參考密碼子使用頻率而推測的核苷酸序列、或將推斷的核苷酸序列組合的多個核苷酸序列，當為后者時，使其含有次黃嘌呤核苷，則可以減少其種類)，以此為探針(用 32P、35S或生物素等標記)，使其與變性固定有轉化細胞株的DNA的硝基纖維素濾膜雜交，分選得到的陽性細胞株。這樣得到的DNA的序列的確定例如可通過Maxam-GiIbert的化學修飾測序法[參照Maxam，A. M. and Gilbert,W. (1980) in" Methods in Enzymology" 65，499-576]或雙脫氧核苷酸鏈終止法[參照 Messing，J. and Vieira，J. (1982) Gene 19，269-276]等來實施。 近年來，使用熒光染料的自動堿基序列確定系統得到普及(例如PerkinElmer Japan公司制造的測序機器人“CATALYST 800”和373A型DNA測序儀等)。通過利用這樣的系統，可以效率良好且安全地進行DNA核苷酸序列的確定操作。 由這樣確定的本發明的DNA的各核苷酸序列以及重鏈和輕鏈的各N末端氨基酸序列數據， 可以確定本發明的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的全部氨基酸序列。免疫球蛋白的重鏈和輕鏈都含有可變區和恒定區，可變區進一步含有互補決定區 (以下稱為“CDR”；重鏈·輕鏈各3處)以及與它們相鄰連接的支架區(重鏈 輕鏈各4 處)。其中，恒定區的氨基酸序列與抗原的種類無關，在免疫球蛋白亞類相同的抗體間是共通的。另一方面，已知可變區、特別是CDR的氨基酸序列是各抗體所特有的，通過對很多抗體的氨基酸序列數據進行比較研究，可知CDR的位置、支架序列的長度在屬于相同亞群的抗體亞單元之間大致類似[參照Kabat, Ε. A.，等.(1991) in" Sequence ofProteins of Immunological Interest Vol. II" :U. S. Department ofHealth and Human Services]。 因此例如通過將抗人oculospanin單克隆抗體的抗體重鏈和輕鏈的各氨基酸序列與它們公知的氨基酸序列數據進行比較，可以確定各氨基酸序列中的CDR或支架區和恒定區的位置。已知FRH1、即重鏈最N末端一側的支架區的鏈長比常規(30個氨基酸)短，例如該支架區有最小為18個氨基酸的例子[參照前述的Kabat等人的文獻]。因此，本發明的抗體中， 在無損抗人oculospanin抗體的機能的條件下，重鏈N末端的支架區的鏈長可以為18個氨基酸或以上、30個氨基酸或以下，優選30個氨基酸。對與上述確定的輕鏈或重鏈的各CDR相同的氨基酸序列、或者具有其中連續的部分氨基酸序列的肽進行人工改性操作，使該CDR接近在抗人oculospanin抗體分子中形成的立體結構，由此可以單獨使其具有與人oculospanin的結合活性[例如參照美國專利第 5331573號公報]。因此，這樣的經改性的、與CDR相同的氨基酸序列、或具有其中連續的部分氨基酸序列的肽也包含在本發明的分子中。制備使氨基酸序列中的任意一個或兩個或以上的氨基酸缺失而得到的變異體時，可以按照盒式突變法[參照岸本利光、“新生化學實驗講座2 ·核酸III重組DNA技術” 242-251]等進行。上述各種DNA例如可以按照磷酸三酯法[HunkapilIer，M.，等.(1984)Nature 310,105-111]等常規方法，通過核酸的化學合成來制備。所需氨基酸的密碼子是公知的， 其選擇可以隨意，例如，可以考慮所使用的宿主的密碼子的使用頻率，按照常規方法確定。 這些核苷酸序列密碼子的部分變異可以按照常規方法、通過利用含有編碼所需變異的合成寡核苷酸的引物進行的位點專一性誘變導入法(位點專一誘變法)[參照Mark，D. F.， 等.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,5662-5666]等進行。 某種DNA是否與編碼本發明的抗人oculospanin單克隆抗體的重鏈或輕鏈的DNA 雜交，這例如可以照隨機引物法[參照Feinberg，A. P. and Vogelstein, B. (1983)Anal. Biochem. 132，6-13]或切口平移法[參照Maniatis，T.，等.(1982) in" Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.]等,使用用[α -32P] dCTP 等標記的探針DNA，通過下述的實驗來研究該DNA。首先，將要研究的DNA吸附于例如硝基纖維素膜或尼龍膜等上，再根據需要進行堿變性等處理，然后通過加熱或紫外線等固相化。將該膜浸于含有6 X SSC (IX SSC為0. 15M 氯化鈉、0.015M檸檬酸三鈉溶液)和5% Denhardt溶液、0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)的預雜交溶液中，在55°C保溫4小時或以上，然后將之前制備的探針加入到同樣的預雜交溶液中，使最終比活性為lX106cpm/ml，在60°C保溫過夜。然后將膜在室溫下用6XSSC洗滌5 分鐘，將該操作重復多次，再用2 X SSC洗滌20分鐘，然后進行放射自顯影。利用上述的方法，可以由任意的cDNA文庫或基因組文庫分離與編碼本發明的人源化抗人oculospanin抗體的重鏈或輕鏈的DNA雜交的DNA[參照Maniatis，T.，等.(1982) in" Molecular Cloning ALaboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory,NY.]。通過將如上得到的各DNA分別整合到各表達載體中，可以導入原核生物或真核生物宿主細胞中，可使各基因在這些宿主細胞中表達。表達方法可以按照與上述[5.抗人 oculospanin抗體的制備]項中的“(1)抗原的制備”的方法相同的方法進行。在轉化體的細胞內或細胞外生產的、含有抗人oculospanin抗體蛋白質的組分可以通過利用該蛋白質的物理性質或化學性質等的各種公知的蛋白質分離操作法進行分離、 純化。所述方法具體例如可采用由通常的蛋白質沉淀劑進行的處理，超濾，分子篩色譜(凝膠過濾)、吸附色譜、離子交換色譜、親和層析、高效液相色譜(HPLC)等各種色譜，透析法以及它們的組合等。為了將抗人oculospanin小鼠單克隆抗體人源化，必須設計可變區的氨基酸序列，使所確定的CDR序列全體和FR序列的一部分氨基酸殘基移植到人抗體中。該設計按照以下的方法進行。以往，進行人源化設計時，受體的亞群的選擇指針選擇需要考慮以下兩點a)幾乎直接使用具有天然的氨基酸序列的公知的人抗體的重鏈、輕鏈的天然組合。b)保留重鏈、輕鏈所屬的亞群的組合，但重鏈、輕鏈分別使用來自不同的人抗體， 與供體的重鏈、輕鏈氨基酸序列的相同性高的氨基酸序列或共有序列。本發明中，可以按照上述進行，但也可以采用與其不同的C)的方法。c)不考慮亞群的組合，從人抗體的一級序列文庫中選擇與供體FR相同性最高的重鏈、輕鏈的FR。通過這些選擇方法，供體和受體之間的FR部分的氨基酸的相同性至少可以為70%或以上。通過采用該方法，可以更減少由供體移植的氨基酸殘基的數，可以減少 HAMA應答誘導。對于由抗體分子的一級序列預測三級結構的操作(以下將該操作稱為“分子建模”)，其預測精度是有限度的，對于該供體所屬的亞群中僅偶爾出現的氨基酸殘基的作用無法充分確定。按照Queen等人的方法，判斷在所述位置上應選擇供體、受體哪一種的氨基酸殘基，這通常是困難的。c)的選擇法可以顯著減少這樣進行判斷的情況。本發明人通過提供用于鑒定來自供體的FR的氨基酸的新型方法，可進一步改良該人源化方法。其中，所述來自供體的FR的氨基酸對于保持供體的CDR的結構和機能很重要。選擇了輕鏈和重鏈各自的人受體分子之后，選擇由供體的FR移植的氨基酸殘基的方法如下所示。將供體和受體的氨基酸序列并列比較，當在兩者的FR相應的位置上氨基酸殘基不同時，必須決定要選擇哪一種殘基，該選擇中，必須在無損來自供體的CDR的立體結構的條件下進行選擇。Queen等人在上述日本特表平4-502408號中提倡FR上的氨基酸殘基符合以下要件的至少其中之一時，要將該氨基酸殘基與CDR序列一起移植到受體的方法1)受體的人FE區中的氨基酸在該位置較少，供體所對應的氨基酸在受體的上述位置為普通；2)該氨基酸緊鄰一個⑶R ； 3)在立體免疫球蛋白模型中，預測該氨基酸可以在CDR的約3人以內具有支鏈原子，并且可以與抗原或人源化抗體CDR相互作用。這里，2)所示的殘基常顯示3)的性質，因此本發明中，要刪除該2)的要件，另外新設置2種要件。即，本發明中，對于與CDR —起移植的供體的FR上的氨基酸殘基，當為a)受體的FR中的氨基酸在該位置為稀少，供體的該對應的氨基酸在該位置為普通；b)在立體結構模型中，可以預想該氨基酸與CDR的構成氨基酸原子和抗原或要移植的CDR環相互作用；c)該位置是規范分類決定殘基；d)該位置構成重鏈和輕鏈的接觸面；時，可以由供體的FR移植該氨基酸殘基。a)的要件中，按照上述Kabat的表，對于相同亞類的抗體，將在該位置以90%或以上的頻率出現的氨基酸定義為“普通”，將以低于10%的頻率出現的氨基酸定義為“稀少”。c)的要件中，對于是否是“該位置為規范分類決定殘基”，可以按照上述Chothia 的表決定。關于b)、d)的要件，必須預先進行抗體可變區的分子建模。關于分子建模用軟件，只要是市售的，可以采用任何一種，可優選使用AbM(Oxford Molecular Limited公司制造)。分子建模的預測精度是有一定限度的，因此，本發明中，通過參照各種抗體可變區的X射線結晶分析的實驗結果，將由分子建模得到的結構預測的準確度分為2個階段。本發明中，在由AbM等分子建模軟件構建的可變區的立體結構中，兩個原子間的距離比各自的范德瓦爾斯半徑的和再加上0. 5人的值還短時，則推定該兩個原子間為范德瓦爾斯接觸。主鏈和支鏈的酰胺氮、羰基氧等極性原子間距離比氫鍵的平均距離2. 9人再加上0.5 A的距離還短時，可以推定它們之間存在氫鍵。并且，具有相反的電荷的原子間比2.85 A再加上0.5 A的距離短時，可以推定它們之間形成離子對。另一方面，由各種抗體可變區的X射線晶體結構分析的實驗結果可知與亞群無關，可見與CDR高頻率接觸的FR上的位置在輕鏈上特定為1、2、3、4、5、23、35、36、46、48、49、 58、69、71、88 號的位置，在重鏈上為 2、4、27、28、29、30、36、38、46、47、48、49、66、67、69、71、 73、78、92、93、94、103號的位置(數字均表示前述Kabat等人的文獻中定義的氨基酸序號。 以下也同樣)。適用與分子建模同樣的基準時，在公知的三分之二的抗體可變區中可見這些位置的氨基酸殘基與CDR的氨基酸殘基的接觸。基于以上認識，b)的“在立體結構模型中， 可以預想該氨基酸與CDR的構成氨基酸原子和抗原或要移植的CDR環的相互作用”是指以下的要件。分子建模中，可預見FR和CDR具有接觸的可能性的FR的位置與X射線晶體分析中高頻率檢測出FR和CDR的接觸的任意位置一致時，則供體的氨基酸殘基的移植優先。除此之外，不考慮該要件b)。

d)的“該位置構成重鏈和輕鏈的接觸面”是指以下的要件。由各種抗體可變區的 X射線晶體結構分析的實驗結果可知在輕鏈上36、38、43、44、46、49、87、98號的氨基酸殘基，在重鏈上37、39、45、47、91、103、104號的氨基酸殘基可見進行高頻率的重鏈-輕鏈之間的接觸。分子建模中，可預見重鏈-輕鏈之間接觸的可能性、且其位置與上述的任意位置一致時，則供體的氨基酸殘基的移植優先。除此以外的情況不考慮該要件d)。編碼本發明的人源化抗人oculospanin抗體的重鏈和輕鏈可變區的DNA可通過以下的方法制備。例如，化學合成含有60-70個核苷酸的該DNA的部分核苷酸序列的多個多核苷酸片段，使其在有義側和反義側互相不同，然后將各多核苷酸片段退火，通過DNA連接酶結合，可得到具有編碼所需人源化抗人oculospanin抗體的重鏈和輕鏈的可變區的DNA的 DNA。其它方法還有從人淋巴細胞中分離編碼受體可變區的全部氨基酸序列的DNA， 按照本領域所周知的方法對編碼CDR的區進行核苷酸置換，導入限制酶切序列。用相應的限制酶切斷該區，然后合成編碼供體CDR的核苷酸序列，通過DNA連接酶結合，可得到具有編碼所需人源化抗人oculospanin抗體的重鏈和輕鏈的可變區的DNA。本發明中，優選以下所述的重疊延伸PCR法(Horton等.，Gene, 77,61-68, (1989))，可得到具有編碼所需人源化抗人oculospanin抗體的重鏈和輕鏈的可變區的 DNA。S卩，將分別編碼要連接的2種氨基酸序列的2種DNA作為㈧和(B)。化學合成在(A)的5’ 一側退火的20-40個核苷酸的有義引物(以下，將該引物稱為(C))、和在(B) 的3’ 一側退火的20-40個核苷酸的反義引物(以下，將該引物稱為(D))。再將(A)的3’ 一側的20-30個核苷酸和在(B)的5’ 一側的20-30個核苷酸連接，合成嵌合型有義引物 (以下將該引物稱為(E))和與其互補的反義引物(以下將該引物稱為(F))。以含有(A)的適當的載體DNA為底物，通過進行使用有義引物(C)和嵌合型反義引物(F)的PCR，可得到 (A)的3，末端附加有(B)的5，末端一側的20-30個核苷酸的DNA(將該新得到的DNA稱為 (G))。同樣，以含有⑶的適當的載體DNA為底物，通過進行使用反義引物⑶和嵌合型有義引物(E)的PCR，可得到⑶的5’末端附加有㈧的3’末端一側的20-30個核苷酸的DNA (將該新得到的DNA稱為(H))。這樣得到的(G)和(H)在(G)的3，一側的40-60個核苷酸和(H)的5’ 一側的40-60個核苷酸中保持互補的核苷酸序列。將擴增的(G)和(H) 混合進行PCR時，在第1次的變性反應中，(G)和(H)成為單鏈，之后的退火反應中，幾乎所有的DNA都恢復原狀，但一部分DNA在互補的核苷酸序列區形成退火的雜DNA雙鏈。之后的延伸反應中，突出的單鏈部分得到修復，可得到(A)與(B)連接的嵌合型DNA(以下將該 DNA稱為(I))。再以該⑴為底物，使用有義引物(C)和反義引物⑶進行PCR，由此可擴增(I)。本發明中，可以將編碼抗人oculospanin單克隆抗體的重鏈和輕鏈的CDR區的DNA 和編碼人免疫球蛋白IgG的FR區的DNA、以及編碼人免疫球蛋白IgG的分泌信號的DNA分別作為(A)和(B) —個個進行上述的連接反應。所需的氨基酸的密碼子是公知的，其選擇也可以是任意的，例如可以考慮所使用的宿主的密碼子的使用頻率，按照常規方法確定。這些核苷酸序列密碼子的一部分變異可以按照常規方法，利用含有編碼所需變異的合成寡核苷酸的引物，根據位點專一突變(參照 Mark，D. F.，等.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,5662-5666)等進行。因此，化學合成各引物時，通過預先導入點突變設計各引物，可以得到編碼所需抗人oculospanin抗體的重鏈和輕鏈的可變區的DNA。 將這樣得到的本發明的各DNA分別整合到表達載體中，由此可轉化原核生物或真核生物。并且，通過向這些載體導入適當的啟動子和表現型有關的序列，可以使各基因在各宿主細胞中表達。通過上述方法，可以容易地以高收率、高純度制備重組抗人oculospanin抗體。(4)抗人oculospanin完全人抗體的制備完全人抗體是指只具有來自人的染色體的抗體的基因序列的人抗體。抗人 oculospanin完全人抗體可以采用以下方法獲得使用人抗體生成小鼠的方法，其中所述人抗體生成小鼠具有含人抗體H鏈和L鏈的基因的人染色體片段(參照Tomizuka， K.等·，Nature Genetics,16, p.133-143,1997 ；Kuroiwa, Y.等·，Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998 ；Yoshida, H. φ . , Animal Cell Technology =Basic and AppliedAspects vol. 10,p.69-73(Kitagawa, Y. , Matuda, T. and Iijima, S. eds. ), Kluwer Academic Publishers,1999 ；Tomizuka, K.等.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000等)、獲得從人抗體文庫選擇的來自噬菌體展示的人抗體的方法(參照Wormstone， I. Μ. φ · ， InvestigativeOphthalmology&Visuiil Science. 43(7), p. 2301-8,2002 ； Carmen,S.等·，Briefings in Functional Genomics and Proteomics,1(2),p. 189-203, 2002 ；Siriwardena, D.等·，Ophthalmology,109(3)，p.427-431，2002 等)。驗證這樣制備的重組抗人oculospanin抗體與人oculospanin特異性結合的方法例如優選與對小鼠免疫時進行的抗體效價評價同樣的ELISA法。6.含有抗人oculospanin抗體的藥物由按照上述的“5.抗人oculospanin抗體的制備”項中記載的方法得到的抗人 oculospanin抗體中可以得到中和人oculospanin生物活性的抗體或特異性毒害表達人 oculospanin的癌細胞的抗體。這些抗體抑制生物體內的人oculospanin的生物活性、即抑制細胞的癌化，因此可以作為藥物、特別是作為癌癥治療劑使用。體外的抗人oculospanin 抗體導致的人oculospanin生物活性中和的活性例如可以通過過量表達人oculospanin的細胞中的癌化抑制活性來測定。例如，可以對過量表達人oculospanin的小鼠成纖維細胞株NIH3T3進行培養，以各種濃度向培養系中添加抗人oculospanin抗體，測定對轉化灶形成、集落形成和球形增殖的抑制活性。體外的抗人oculospanin抗體導致的癌細胞的毒活性例如可通過抗人oculospanin抗體對過量表達人oculospanin的細胞所顯示的抗體依賴性細胞毒活性、補體依賴性細胞毒活性或補體依賴細胞介導性毒活性測定。例如對過量表達人oculospanin的293T細胞進行培養，以各種濃度向培養系中添加抗人oculospanin抗體，再添加小鼠脾細胞，測定培養適當的時間后對人oculospanin過量表達細胞的細胞死亡誘導率。利用實驗動物的體內抗人oculospanin抗體對癌的治療效果例如可以將該抗人 oculospanin抗體施用過量表達人oculospanin的轉基因動物，測定癌細胞的變化。 這樣得到的中和人oculospanin生物活性的抗體或特異性毒害表達人 oculospanin的癌細胞的抗體可用作藥物、特別是以癌癥治療為目的的藥物組合物，或者用作上述疾病的免疫學診斷的抗體。癌的種類優選皮膚癌或皮膚癌的一種——黑素瘤，但不限于這些。本發明也提供藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的抗人oculospanin抗體與藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或助劑。本發明的藥物組合物中可接受的制劑所用的物質優選施用量、施用濃度對于被施用藥物組合物者為非毒性。本發明的藥物組合物可以含有用以改變、維持或保持pH、滲透壓、粘度、透明度、 顏色、等滲性、顏色、滅菌性、穩定性、溶解率、釋放率、吸收率、滲透率的制劑用物質。制劑用物質可例舉以下甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸等氨基酸類，抗菌劑，抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等抗氧化劑，磷酸、檸檬酸、硼酸緩沖液、碳酸氫鹽、 Tris-鹽酸溶液等緩沖劑，甘露醇、甘氨酸等填充劑，乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑，咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β -環糊精、羥丙基_環糊精等絡合劑，葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑，單糖類、二糖類、葡萄糖、甘露糖或糊精等其他碳水化合物，著色劑，芳香劑，稀釋劑， 乳化劑，聚乙烯吡咯烷等親水聚合物，低分子量多肽、成鹽的反荷離子、苯扎氯胺、苯甲酸、 水楊酸、硫柳汞、苯乙烯基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、chlorhexidine、山梨酸或過氧化氫等防腐劑，甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑，甘露醇或山梨醇等糖醇，懸浮齊U，PEG，脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯，Triton、氨丁三醇 (tromethamine)、卵磷脂或膽留醇等表面活性劑，蔗糖、山梨醇等穩定劑，氯化鈉、氯化鈣、 甘露糖醇_山梨糖醇等彈性增強劑，輸送劑，稀釋劑，賦形劑和/或藥學上的助劑。這些制劑用的物質的添加量優選相對于抗人oculospanin抗體的重量為0. 01-100倍、特別優選 0. 1-10倍添加量。制劑中的優選的藥物組合物的組成可由本領域技術人員根據適用疾病、 適用施用形式等適當決定。藥物組合物中的賦形劑或載體可以是液體，也可以是固體。適當的賦形劑或載體可以是通常用于注射用水或生理鹽水、人工腦脊髓液或非經口施用的其它的物質。也可以將中性的生理鹽水或含有血清白蛋白的生理鹽水用作載體。藥物組合物中可以含有PH 7. 0-8. 5的Tris緩沖液或pH 4. 0-5. 5的乙酸緩沖液或山梨醇或其它化合物。本發明的藥物組合物可以以所選擇的組成、以所需的純度、以適當的藥劑形式、以凍干品或液體儲備。 含有抗人oculospanin抗體的藥物組合物可以以使用蔗糖等適當的賦形劑制成凍干品的形式成型。本發明的藥物組合物可以制備成非經口施用，也可以制備成經口的消化道吸收用。制劑的組成和濃度可由施用方法決定，本發明的藥物組合物中所含的抗人oculospanin 抗體對人oculospanin的親和性、即對于與人oculospanin的解離系數(Kd值)，親和性越高(Kd值低)，則可減少對人的給藥量，越可發揮藥效，因此基于該結果，可以確定本發明的藥物組合物對人的給藥量。在將人型抗人oculospanin抗體施用于人時，給藥量可以是在 1-30 天每天施用 0. l-100mg/kg。本發明的藥物組合物的形式有包括輸液在內的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、 透皮吸收劑等。7.直接相互作用的物質的探討本發明的另外一個實施 方案包含為了獲得抑制人oculospanin活動的物質而以該蛋白質的立體結構為基礎進行藥物設計的方法。這樣的方法作為合理性藥物設計法而為人所知，可用于高效抑制或活化酶活性等的機能，與配體、輔助因子、或DNA的結合等的化合物的探索。已知這樣的例子有已經上市的抗HIV劑——蛋白酶抑制劑。對于本發明的人 oculospanin的立體結構分析，可以利用X射線結晶分析或核磁共振法等通常已知的方法。 并且為了探索抑制人oculospanin機能的物質，也可以進行利用計算機藥物設計(CADD) 的設計。已知其例子有有望作為慢性關節類風濕治療的新型基因新藥的、抑制AP-I的功能的低分子化合物(國際專利申請公開W099/58515號)等。通過這樣的方法，通過與人 oculospanin直接結合、或者抑制人oculospanin與其它因子的相互作用，可獲得抑制人 oculospanin機能的物質。另一種實施方案涉及伴隨本發明的人oculospanin的多肽、即人oculospanin的伙伴蛋白。即，本發明涉及調節人oculospanin活性的伙伴蛋白的篩選。該篩選方法的一個方案包含使受試蛋白試樣與人oculospanin接觸，選擇與人 oculospanin結合的蛋白質的步驟。這樣的方法例如有使用純化的人oculospanin，進行與其結合的蛋白質的親和純化的方法。以下例舉一個具體方法的例子以含有6個組氨酸的序列作為親和標志，與人oculospanin融合，將其與細胞提取液(預先用鎳-瓊脂糖柱置換，取直接通過該柱的組分)在4°C溫育12小時，然后向該混合物中另行加入鎳-瓊脂糖載體，在4°C溫育1小時。用清洗緩沖液充分洗滌鎳-瓊脂糖，然后加入IOOmM咪唑，使與人 oculospanin特異性結合的細胞提取液中的蛋白質溶出并純化，確定其結構。這樣，直接與人oculospanin結合的蛋白質，以及不具有與人oculospanin的結合活性、但其亞單元直接與人oculospanin結合的蛋白質形成復合體，可以純化間接與人oculospanin結合的蛋白質[實驗醫學別冊、生物手冊系列5 “轉錄因子研究法” 215-219頁(羊土社發行)]。另外一種方法可以通過Far-Western印跡法[實驗醫學別冊、“新基因工學手冊” 76-81 (羊土社發行)]或使用酵母或哺乳類動物的雙雜交系統法[實驗醫學別冊、“新基因工學手冊” 66-75 (羊土社發行)；“Checkmate哺乳動物雙雜交系統”(Promega公司制造)]進行克隆，但并不限于這些方法。這樣，如果可以得到與人oculospanin直接或間接相互作用的伙伴蛋白的cDNA， 則可用于抑制人oculospanin與該伙伴蛋白的相互作用的物質的功能性篩選。具體來說， 例如制備人oculospanin與谷胱甘肽硫轉移酶的融合蛋白，使其與用抗谷胱甘肽硫轉移酶抗體包覆的微孔板結合，然后，使生物素化的該伙伴蛋白與該融合蛋白接觸，通過鏈酶抗生物素蛋白化堿性磷酸酶檢測與該融合蛋白的結合。添加生物素化的該伙伴蛋白時，也添加受試物質，選擇促進或抑制融合蛋白與該伙伴蛋白結合的物質。該方法可以獲得與融合蛋白直接作用的物質或與該伙伴蛋白直接作用的物質。融合蛋白與該伙伴蛋白的結合是間接的，當有任何的其它因子介入時，例如在含有該因子的細胞提取液存在下，同樣地進行上述測試。這種情況下，也可以用于與該因子作用的物質的選擇。所得伙伴蛋白具有抑制人oculospanin的機能的活性時，可以按照已述的應用人 oculospanin基因的表達載體的實驗方法，進行抗癌劑、例如可用于前列腺癌的治療劑的候選物質的篩選。所得伙伴蛋白具有抑制人oculospanin的機能的活性時，具有編碼上述抑制因子的核苷酸序列的多核苷酸可以用于癌的基因治療。這樣的多核苷酸例如可如下獲得分析經鑒定的抑制因子的氨基酸序列，合成含有編碼該氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸探針，進行cDNA文庫或基因組文庫的篩選。 另外，具有人oculospanin機能抑制活性的肽來自隨機合成的人工肽文庫時，可以化學合成含有編碼該肽的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。基因治療中，將編碼這樣得到的抑制因子的基因整合到例如病毒載體中，使具有該重組病毒載體的病毒(無毒化處理)感染患者。患者體內產生抗癌基因，具有癌細胞增殖的抑制機能，因此可以治療癌癥。將基因治療劑導入細胞內的方法可以適用利用病毒載體的基因導入方法、或非病毒性基因導入方法(日經科學、1994年4月號，20-45頁、實驗醫學增刊，12(15) (1994))的任何方法。通過病毒載體導入基因的方法例如有反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、辛德畢斯病毒等DNA病毒或RNA病毒中整合并導入編碼抑制因子或其突變體的DNA的方法。其中特別優選使用反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒的方法。非病毒性的基因導入方法有將表達質粒直接施用于肌肉內的方法(DNA疫苗法)、脂質體法、脂轉染法、微量注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，其中，特別優選 DNA疫苗法、脂質體法。為了使基因治療劑實際發揮藥物作用，有將DNA直接導入體內的體內法和由人取得某種細胞，在體外將DNA導入該細胞，將該細胞重新植回體內的來自體內的離體實驗法 (日經科學，1994年4月號，20-45頁，月刊藥事，36 (1)，23-48 (1994)、實驗醫學增刊，12 (15) (1994))。例如該基因治療劑通過體內法施用時，可根據疾病、癥狀等，由靜脈、動脈、皮下、 皮內、肌內等適當的施用途徑施用。體內法施用時，該基因治療劑通常制成注射劑等，也可以根據需要加入常用的載體。制成脂質體或膜融合脂質體(仙臺病毒-脂質體)的形式時， 可制成混懸劑、冷凍劑、離心濃縮冷凍劑等脂質體制劑。與序列表的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列或與該序列的部分序列互補的核苷酸序列可用于所謂的反義治療。反義分子可以使用與序列表的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的一部分互補、通常含有15-30mer的DNA，或者其硫代磷酸酯、磷酸甲酯或嗎啉并衍生物等穩定的DNA衍生物，2’ -0-烷基RNA等穩定的RNA衍生物。通過 進行微量注射、脂質體膠囊化，或者利用具有反義序列的載體使其表達等本發明的技術領域中周知的方法，可將這樣的反義分子導入到細胞中。這樣的反義療法對于因序列表的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列所編碼的蛋白質的活性增加過多而引起的疾病的治療有效。 可用于含有上述反義寡核苷酸的藥物的組合物可通過醫藥上可接受的載體的混合等公知的方法制備。這樣的載體和制備方法的例子記載于Applied Antisense Oligon ucleotide Technology(1998Wiley_Liss，Inc.)。含有反義寡核苷酸的制劑可以是其本身或與適當的藥理學上可接受的賦型劑、稀釋劑等混合，通過片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑等經口、或通過注射劑、栓劑、貼劑或外用劑等非經口施用。這些制劑可通過使用以下的添加劑，按照周知的方法制備賦型劑(例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物)；玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、α淀粉、糊精等淀粉衍生物；結晶纖維素等纖維素衍生物；阿拉伯樹膠；葡聚糖；普魯蘭等有機系賦型劑；以及輕質硅酸酐、合成硅酸鋁、硅酸鈣、 甲基硅鋁酸鎂等硅酸鹽衍生物；磷酸氫鈣等磷酸鹽；碳酸鈣等碳酸鹽；硫酸鈣等硫酸鹽等無機系賦型劑)、潤滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等硬脂酸金屬鹽；滑石粉；膠態二氧化硅；蜂蠟、鯨蠟等蠟類；硼酸；己二酸；硫酸鈉等硫酸鹽；乙二醇；富馬酸；苯甲酸鈉； DL亮氨酸；月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂等月桂基硫酸鹽；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸類； 以及上述淀粉衍生物)、粘結劑(例如羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、以及與上述賦型劑同樣的化合物)、崩解劑(例如低取代羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、內部交聯羧甲基纖維素鈉等纖維素衍生物；羧甲基淀粉、羧甲基淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮等化學改性淀粉、纖維素類)、乳化劑(例如膨潤土、V字膠等膠性粘土 ；氫氧化鎂、氫氧化鋁等金屬氫氧化物；月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈣等陰離子表面活性劑；苯扎氯銨等陽離子表面活性劑；以及聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、 蔗糖脂肪酸酯等非離子表面活性劑)、穩定劑(對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等對羥基苯甲酸酯類；氯丁醇、芐醇、苯乙醇等醇類；苯扎氯銨；苯酚、甲酚等酚類；硫柳汞；脫氫乙酸；以及山梨酸)、矯味矯臭劑(例如通常使用的甜味劑、酸味劑、香料等)、稀釋劑等。將本發明的化合物導入患者的方法除上述之外還可以使用膠態分散系。膠態分散系有望獲得提高化合物的體內恒定性的效果、將化合物高效地輸送到特定的臟器、組織或細胞的效果。膠態分散系可以是通常使用的，對此并沒有限定，例如有以高分子復合物、納米囊、微球、珠、以及水包油系乳化劑、膠束、混合膠束和包括脂質體的以脂質為基質的分散系，優選具有將化合物高效地輸送到特定的臟器、組織或細胞的效果的多個脂質體、人工膜的小囊(Mannino等·，Biotechniques, 1988,6,682 ;Blume and Cevc,Biochem. et Biophys. Acta,1990,1029,91 ；Lappalainen等·,Antiviral Res. ,1994,23,119 ；Chonn and Cullis, Current Op. Biotech.，1995，6，698)。0. 2-0. 4μπι大小范圍的單層脂質體可以包被相當大比例的含有巨大分子的水性緩沖液，化合物被該水性內膜包封，可以以生物學活性的形式輸送到腦細胞中(Fraley 等·，Trends Biochem. Sci.，1981，6，77)。脂質體的組成通常是將脂質、特別是磷脂、尤其是相轉變溫度高的磷脂與1種或多種膽固醇復合而成。可用作生產脂質體的脂質的例子包含磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、鞘脂類、磷脂酰乙醇胺、腦苷脂和神經節苷脂等磷脂酰化合物。特別有用的是二酰基磷脂酰甘油，這里，脂質部分含有14-18個碳原子、特別是16-18個碳原子并飽和(14-18個碳原子鏈的內部沒有雙鍵)。代表性的磷脂包含磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。包括脂質體的膠態分散系的打靶可以是被動的或主動的任何形式。被動打靶可利用脂質體原本的向含有血竇的臟器的網狀內皮系統細胞中分布的傾向來實現。另一方面 ，主動的打靶例如有將病毒的蛋白質外殼(Morishita等.，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.)，1993，90，8474)、單克隆抗體(或其適當的結合部分)、糖、糖脂或蛋白質(或其適當的寡肽片段)等特定的配體與脂質體結合；或者除天然存在的局部部位以外，為了實現向臟器或細胞型中分布而改變脂質體的組成，由此修飾脂質體的方法等。打靶的膠態分散系的表面可以以各種方法修飾。在由脂質體打靶的傳遞系統中，為了在與脂質的雙分子層緊密相伴中保持目標配體，脂基可以被攝入到脂質體的脂質雙分子層中。為了使脂鏈與目標配體結合，可以使用各種連接基團。與在所需的細胞上明顯地發現有本發明的寡核苷酸的輸出的特定細胞表面分子結合的目標配體例如可以是(1)與在所需的細胞中明顯表達傳輸的特定的細胞受體結合的激素、生長因子或其適當的寡肽片段；或者(2)與目標細胞上明顯發現的抗原性表型特異性結合的多克隆或單克隆抗體、或其適當的片段(例如Fab ； F(ab’)2)。2種或更多種的生物活性劑可以在單一的脂質體內部復合并施用。也可以將提高內容物在細胞內的穩定性和/或打靶的藥物追加到膠態分散系。其使用量根據癥狀、年齡等而不同，經口施用時，每次施用的下限為Img(優選 30mg)，上限2000mg(優選1500mg)；注射時，可以通過皮下注射、肌內注射或靜脈注射施用每次的下限為0. Img (優選5mg)，上限為IOOOmg (優選500mg)。以下例舉實施例，詳細、具體地說明本發明，但本發明并不限于這些實施例。 下述實施例中，如無特別說明，關于基因操作的各項操作按照“分子克隆(Molecular Cloning)，，(Sambroo k, J. , Fritsch, Ε. F. andManiatis, Τ. , published by Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)記載的方法進行，或者使用市售的試劑或試劑盒時，按照市受品的說明書使用。[實施例1]在癌細胞中特異性表達的基因的選別對于具有與序列表SEQ ID NO. 1部分重復的核苷酸序列的EST探針(Affymetrix GeneChip HG-133 probe 223795_at :Affymetrix 公司制造)，使用 Genelogic 公司制的數據庫(GeneExpress Software SystemRelease 1. 4. 2)進行表達數據分析。對各種細胞株內的人oculospanin基因的表達量進行比較，結果8例黑素細胞與其它細胞株群、即12例血細胞系細胞樣本、6例格利雅細胞株樣本、62例上皮系細胞樣本比較，進行了顯著高的轉錄(P值依次< 0. OOOU= 0. 0007、< 0. 0001、圖1上)。接著，對來自組織的樣本中的人oculospanin基因的表達量進行比較。對66例健康人皮膚樣本以及33例黑素瘤樣本進行轉錄量的比較，結果黑素瘤樣本進行了顯著高的轉錄(P值< 0. 0001 圖1下)。另外，對66例健康人皮膚樣本和12例來自黑素瘤樣本中皮膚組織的樣本進行比較，結果，黑素瘤樣本進行了顯著高的轉錄(P值=0. 0007 圖2上)。另一方面，對66例健康人皮膚樣本和12例來自黑素瘤樣本中淋巴結組織的樣本進行比較，結果，黑素瘤樣本進行了顯著高的轉錄(P值=0. 0003 圖2下)。對13例來自健康人淋巴結的樣本和12例來自黑素瘤樣本中淋巴結組織的樣本進行比較，結果，黑素瘤樣本進行了顯著高的轉錄(P值=0. 0011 圖3)。[實施例2]人oculospanin基因的獲得和表達質粒的構建
a) PCR 反應

可根據常規方法合成具有5' -CACCATGGAGGAGGGGGAGAGGAGCCC-3‘(引物1 序列表 SEQ ID NO. 5)和 5' -GCCCCGGGCGGGTTTGGCAGCGG-3‘(引物 2:序列表 SEQ ID NO. 5) 的序列，以此作為PCR擴增人oculospanineDNA的引物。引物1是人oeulospanin基因的起始密碼子上游附加作為Kozak序列的、有4個堿基CACC寡核苷酸，是由在含有序列表SEQID NO. 1的核苷酸編號1-23的核苷酸序列的5’ 一側附加有4個堿基序列(CACC)的堿基序列形成的寡核苷酸。該CACC序列在向克隆載體中pENTR/D-TOPO整合時與載體3’末端形成互補鏈，因此可以向保持基因的方向性的載體中整合。引物2是由含有序列表SEQ ID NO. 1 的核苷酸編號1043-1065的核苷酸序列的互補鏈形成的寡核苷酸。PCR反應使用PLATINUM Pfx DNA聚合酶(Invitrogen公司制備)，按照所附說明書進行。具體來說，向0. 1 μ 1所得第一鏈cDNA中添加各1. 5μ 1的lOpmol/μ 1濃度的合成引物1和合成引物2、5μ 1 IOXPfx擴增緩沖液、1. 5μ 1 IOmM dNTP MixU μ 1 50mM MgS04、0. 5μ 1PLATINUM Pfx DNA 聚合酶、10 μ IlOX PCRx 增強子溶液、28. 9 μ 1 滅菌純凈水，制備 50μ1 PCR 反應溶液。PCR 反應通過 Peltier ThermalCycler TPC-200DNA En gine (MJ Research公司制造)進行。首先在94°C加熱2分鐘，然后繼續在94°C加熱30 秒，在65°C加熱2分鐘，將上述溫度循環進行5次，接著將94°C 30秒、60°C 40秒、68°C 1 分20秒的溫度循環進行5次，接著再將94°C 30秒、55°C 40秒、68°C 1分20秒的溫度循環進行5次，接著將94°C 30秒、50°C 40秒、68°C 1分20秒的溫度循環進行35次，最后在68°C保溫10分鐘，然后在4°C保存。關于目標cDNA，將反應物用1. 5%瓊脂糖凝膠進行電泳，確認 NM_031945cDNA(1069bp)的擴增后，使用 S. N. A. P. UV-Free GelPurification Kit (Invitrogen公司制備)，按照所附說明書，由瓊脂糖凝膠純化DNA。關于純化的cDNA的濃度，使用ID圖像分析軟件3. 5版本(ID Image Analysis Software Version 3.5)(柯達數碼科學(KodakDigtal Science)EDAS290 柯達公司制造)，以 Ikb DNA Ladder (invtrogen 公司制造)為濃度標準品進行測定。b)人 oculospa nin cDNA 向 pENTR/D-TOPO 載體的克隆使用pENTR Direetional Τ0Ρ0 Cloning Kit (Invitrogen 公司制造)，按照所附說明書，將由實施例2a)得到的NM_031945cDNA克隆到pENTR/D-TOPO載體中。將 NM_031945cDNA與pENTR/D-TOPO載體混合，在室溫下溫育30分鐘，其中pENTR/D-T0P0 載體在試劑盒所附的反應緩沖液中與拓撲異構酶結合。使用所得的反應物轉化OneShot T0P10 Chemically Competent Ε. coli (Invitrogen 公司制備)，在含有 50 μ g/ml 卡那霉素的LB瓊脂培養基上培養。結果，選擇顯示卡那霉素抗性并生長的大腸桿菌集落，在含有Iml 50 μ g/ml卡那霉素的液體TB培養基中、在37°C培養過夜，利用Montage PlasmidMiniprep96 Kit(Millipore)分離純化質粒DNA。對于所得質粒DNA，使用BigDye Terminator v3. O Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，按照實際盒所附說明進行反應，然后通過ABI PRISM 3100DNA測序儀(Applied Biosystems)進行核苷酸序列分析，從而確認GenBank中登錄號(具有登錄號NM_031945所示的核苷酸序列的開放閱讀框的cDNA(SEQ ID NO. 1)) 被整合到了 pENTR/D-TOPO載體中。接著，使用GATEWAY 系統向表達用載體pcDNA3. 1/DEST40 (Invitrogen)進行基因的轉移。即，用 TE 緩沖液將 4μ1 GATEWAY LRClonase Enzyme Mix (Invitrogen 公司制備)、4 μ 1 LR 反應緩沖液、O. 3 μ g pENTR/D-T0P0-NM_031945、0. 3 μ g pcDNA3. 1/DEST40 制備成20μ 1，在25°C反應1小時后，加入2μ 1蛋白酶K 37°C反應10分鐘。使用所得反應物轉化大腸桿菌OneShot TOPlO Chemically CompetentE. coli (Invitrogen公司制備)，在含有50 μ g/ml胺芐霉素的LB瓊脂培養基上培養。結果，選擇顯示胺芐霉素抗性并生長的大腸桿菌集落，在含有IOOml 50 μ g/ml胺芐霉素的液體TB培養基中、在37°C培養過夜，利用 Plasmid MAXI Kit (QIAGEN 公司制備)分離純化質粒 DNA (pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945)。[實施例3]人oculospanin基因導入細胞并表達的人oculospanin基因產物的確認、以及作為免疫原的人oculospanin表達細胞的膜組分的制備a)質粒 pcDNA3. 1-DEST40_NM_031945 轉染 NIH3T3 細胞如下所述，將實施例2所得質粒pcDNA3. 1-DEST40_NM_031945轉染NIH3T3細胞。 對NIH3T3細胞的轉染使用(株)Invitrogen制備的Lipofectamine 2000試劑，通過脂轉染進行。即，首先使細胞在6孔板中增殖至半匯合。將細胞用不含抗生素、含有10%胎牛血清的DMEM清洗，然后再加入200μ1不含抗生素、含有10%胎牛血清的DMEM。接著， 向1. 5ml Eppendorf離心管中加入100 μ 1無血清培養基(DMEM)、由上述方法回收的質粒 2 μ g DNA(pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945)，混合。在另外的 1. 5ml Eppendorf 離心管中加入96 μ 1無血清培養基(DMEM)、4 μ 1 Lipofeetamine 2000試劑并混合。將DNA溶液與 Lipofectamine脂轉染溶液混合，在室溫下放置20分鐘。然后將DNA-Lipofectamine混合液加到細胞中，在37°C、5% CO2下進行培養。4小時后，向細胞中加入Iml含有10%胎牛血清的DMEM，在37°C、5% CO2下培養過夜。b)pcDNA3. 1-DEST40_NM_031945 在 NIH3T3 細胞中表達的確認回收上述得到的細胞培養物。將用不含cDNA的陰性對照或 pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945 轉染得到的 NIH3T3 細胞用 PBS (-)緩沖液((株)Invitrogen 制備)清洗。將細胞溶解于含有SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)用的2-巰基乙醇的樣品緩沖液(BioRad公司制備)，使用12. 5%聚丙烯酰胺凝膠(e PAGEL E-T12. 5L、ATT0(株) 制備)，在還原條件下進行SDS-PAGE。電泳后，在轉印緩沖液(192mM甘氨酸、20%甲醇、25mMTris)中，使用凝膠膜轉印裝置(Marysol公司制造、NP7513)，在4°C、120分鐘、200mA的條件下，將條帶由聚丙烯酰胺凝膠上轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司制備)上。 使用抗v5標記抗體((株)Invitrogen制備)，對轉印后的PVDF膜進行蛋白質印跡分析。即，首先將PVDF膜用blockace ((株)雪印制造)封閉(室溫下30分鐘，1次)， 然后裝入塑料袋(商品名Hybribag、CosmoBio (株)制造)，添加抗V5標記抗體(稀釋 1000倍)、5mlbl0CkaCe，在室溫下振蕩1小時。1小時后，取出膜，用含有0. 05%吐溫20 的PBS(以下稱為“0. 05%吐溫20-PBS”)清洗(在室溫下清洗15分鐘，清洗1次，接著進行2次5分鐘的清洗)，然后將膜轉移到新的塑料袋中，將辣根過氧化物酶標記抗兔IgG抗體(Amersham Pharmacia制備)用0. 05%吐溫20-PBS稀釋為5000倍，加入30ml所得溶液，在室溫下振蕩1小時。1小時后，取出膜，用0. 05%吐溫20-PBS按照15分鐘X 1次、 5分鐘X4次清洗。清洗后，將膜置于塑料薄膜上，用ECL蛋白質印跡檢測溶液(Amersham Pharmacia)，檢測結合有抗V5標記抗體的條帶(將膜置于塑料薄膜上，在ECL蛋白質印跡檢測溶液中浸泡1分鐘，然后感光X射線膠片(1分鐘))。結果，通過抗V5標記抗體，檢測出導入了 pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945質粒DNA得到的NIH3T3細胞的特異性條帶(圖4)。c)質粒 pcDNA3. 1-DEST40_NM_031945 轉染 BALB-3T3 細胞將BALB-3T3細 胞(美國菌種保藏中心No. CCL-163)在3片裝有含10%胎牛血清 (Gibco公司制備)(以下稱為“CS”)的Dulbecco改性Eagle培養基(以下稱為“DMEM”;日水制藥(株)制造)的細胞培養用培養皿(培養面積500cm2;住友Bakelite(株)制造) 中、在 37°C、5% CO2 下培養至半匯合，然后將 pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945 轉染 BALB-3T3 細胞。對BALB-3T3細胞的轉染使用(株)Gene Therapy Systems制造的Gen印orter 2 轉染試劑，通過脂轉染進行。即，用無血清培養基(DMEM)清洗細胞，然后加入500ml無血清培養基(DMEM)。接著在 50ml Falcon tube 中加入 6ml New DNA diluent、240 μ g 按照上述方法回收的質粒 DNA(pcDNA3. 1-DEST40_NM_031945)，混合。向另外的 50ml Falcon tube 中加入4. 8ml無血清培養基(DMEM)、和1200 μ IGen印orter 2試劑，混合。將DNA溶液與 Geneporter 2溶液混合，在室溫下放置20分鐘。然后將DNA-Gen印orter 2混合液加入到細胞中(4ml/皿)，在37°C、5% 0)2下培養。4小時后，向細胞中加入50ml/皿含20% 牛血清的DMEM，在37°C、5% CO2下培養過夜。d)細胞膜組分的制備將由上述方法培養的細胞用PBS(-)緩沖液((株)Irwitrogen制備)清洗。使用細胞刮(住友bakelite (株)制造)回收細胞，懸浮于7ml 5mMTris緩沖液pH 8.0中。在 4°C將細胞溶液放置30分鐘。用Dounee TypeB勻漿器(30沖程)破碎細胞。用1000G離心10分鐘，回收上清。將上清用超速離心機(日立(株)制造)、以78000G離心100分鐘， 回收沉淀。通過蔗糖密度梯度濃縮膜組分。即，將沉淀溶解于0.3ml 57%蔗糖0.25M Tris 緩沖液PH 8.0中。轉換成超離心管，在該細胞溶液上倒入3ml 37. 2%的57%蔗糖0. 25M Tris緩沖液pH 8.0、1.5ml 0. 25M 57%蔗糖0. 25M Tris緩沖液pH 8.0。通過超速離心機以75500G離心16小時。由上方各回收ImL管中的溶液。向各組分中添加IOmL 5mM Tris 緩沖液PH 8. 0，以78000G超速離心1小時，回收沉淀。向沉淀中加入500 μ L 5mM Tris緩沖液pH 8.0，用Dounce Type B勻漿器(10沖程)使細胞溶液均勻。通過在表達確認一項中說明的蛋白質印跡法鑒定細胞膜組分，以此作為免疫原。[實施例4]小鼠的免疫和細胞融合(4-1)免疫將Iml實施例3中所得人oculospanin表達細胞的膜組分溶液(總蛋白質量 IOOyg)腹腔內施用4-10周齡的BALB/c雌性小鼠(購自日本SLC公司)。2周后將同樣的膜組分溶液(20μ g蛋白質/小鼠)腹腔內施用，進行追加免疫。(4-2)細胞融合從追加免疫3天后的小鼠體內摘出脾臟，將其放入IOml含有20mM HEPES緩沖液 (pH 7. 3)、350mg/ml碳酸氫鈉、0. 05mM β -巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50 μ g/ml鏈霉素、 300 μ g/ml L-谷氨酸的無血清 RPMI 1640 培養基(10. 4g/l，RPMI 1640〃 Nissui " (1)日水制藥(株)制造)(以下稱為“無血清RPMI培養基”)中，用匙在篩網(細胞篩網=Falcon 公司制造)上搗碎。將通過篩網的的細胞懸浮液離心，使脾細胞沉淀，然后將該細胞用無血清RPMI培養基清洗2次，懸浮于無血清RPMI培養基，測定細胞數。同樣將用含有10% FCS (Gibco BRL公司制備)的ASF104培養基(味之素(株)制備)(以下稱為“含血清ASF培養基”)，在37°C、5%二氧化碳存在下進行培養的、細胞濃度不超過1 X IO8細胞/ml的骨髓瘤細胞NSl (美國菌種保藏中心TIB-18)用無血清RPMI培養基清洗，懸浮于無血清RPMI培養基中，測定細胞數。將相當于3 X IO7個細胞的NSl細胞懸浮液與相當于3 X IO8個細胞的脾細胞懸浮液混合，離心后完全除去上清。以下的細胞融合操作是一邊將裝有沉淀的塑料離心管在裝有溫水的燒杯中保溫在37 °C，一邊實施。一邊用移液管的先端部攪拌沉淀，一邊向該沉淀中緩慢加入lml50% (w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim公司制造)，然后分兩次緩慢加入Iml預先加溫至37°C的無血清RPMI培養基，再添加7ml無血清RPMI培養基。離心后，除去上清，一邊用移液管的先端部緩慢攪拌，一邊加入IOml含10% FCS的次黃嘌呤 氨基喋呤·胸苷培養基(以下稱為“HAT培養基” ；Boehringer Mannheim公司制造)。再添加20ml含10% FCS的HAT培養基，然后向細胞培養用96孔板各分注100 μ 1/孔，在37°C、 5%二氧化碳下培養。7-8天后，以100 μ 1/孔分別向培養基變黃色的孔中加入新的HAT培養基。將這樣得到的融合細胞用于以下通過有限稀釋法進行的篩選。

(4-3)有限稀釋從4-10周齡的BALB/c雌性小鼠(購自日本SLC公司)體內摘出胸腺，然后用匙在篩網(細胞篩網=Falcon公司制造)上搗碎。將通過篩網的的細胞用含10% FCS的次黃嘌呤·胸苷培養基(以下稱為“HT培養基” ；Boehringer Mannheim公司制造)清洗2次。 將相當于1只小鼠的胸腺細胞懸浮于30ml含10% FCS的HT培養基中，以此作為飼養細胞液。將含有以上(4-2)得到的融合細胞的培養液根據細胞密度用飼養細胞液稀釋為10-100 倍，再用飼養細胞液分階段稀釋，使融合細胞的密度為5細胞/ml、1細胞/ml、0. 5細胞/ml。 將這樣制備的各試樣以100μ 1/孔分注到細胞培養用微孔板中，在37°C、5%二氧化碳下培養5天。(4-4)選擇(4-4-1)細胞 ELISA人oculospanin表達細胞的維持培養可用在RPMI 1640培養基(Invitrogen公司制備)中添加有10%胎牛血清(Moregate Biotech公司制備)、20mM HEPES(Sigma公司制備)、55μΜ 2-巰基乙醇(Invitrogen公司制備)的培養基、在37°C、5 % CO2下進行。將對數生長期的人oculospanin表達細胞以2 X IO4個細胞/cm2涂于細胞培養用燒瓶中，培養3天。將這樣制備的人oculospanin表達細胞全部轉移至50ml管中，用HITACHI himac CF8DL、以1，OOOrpm離心5分鐘(離心條件1)。除去上清，使人oculospanin表達細胞在培養基中懸浮，然后使用4%的臺盼藍溶液(Sigma公司制備)計測活細胞數。在培養基中， 制備人oculospanin表達細胞，使活細胞為IO7個細胞/ml，以100 μ 1/孔分注到U底96 孔板。將U底96孔板用HITACHI himac CF8DL、以15000rpm離心1分鐘(離心條件2)， 用200 μ 1 tip抽去上清。敲擊U底96孔板的側面，使人oculospanin表達細胞懸浮，然后用冰冷卻的培養基制備10μ g/ml、5y g/ml、2. 5μ g/ml濃度的雜交瘤培養上清，將其以 100μ1/孔添加。每隔15分鐘，一邊用孔板攪拌器(Fujirebio公司制備)攪拌U底96 孔板，一邊在4°C反應1. 5小時。反應終止后，用離心條件2離心U底96孔板，用200 μ 1 tip抽去上清。在PBS(-)(日水制藥公司制備)中添加5%胎牛血清，將所得溶液(PBS-5% FBS)以200 μ 1/孔添加，用孔板攪拌器攪拌后，用離心條件2離心，用200 μ 1 tip抽去上清。之后再進行2次以上操作。敲擊U底96孔板的側面，使人oculospanin表達細胞懸浮，然后以100 μ 1/孔添加用冰冷卻的PBS-5% FBS稀釋成500倍的過氧化物酶標記抗人 IgG抗體(Kirkegaad&Perry Laboratories公司制備)，用孔板攪拌器攪拌后，用離心條件 2離心，用200μ1 tip抽去上清。之后以200μ 1/孔加入PBS-5% FBS，用孔板攪拌器攪拌后，用離心條件2離心，用200μ1 tip抽去上清。之后再進行2次以上操作。敲擊U底96 孔板的側面，使人oculospanin表達細胞懸浮，然后以100 μ 1/孔添加室溫下的過氧化物酶顯色基質(Nacalai Tesque公司制備)，用孔板攪拌器攪拌10分鐘。用離心條件2離心， 然后以50 μ 1/孔將上清轉移至平底96孔板，用讀板儀(1420 ARVO multilabel counter, PerkinElmer公司制造)測定405nm的吸收。(4-4-2)流式細胞儀將實施例3中得到的人oculospanin表達細胞在含有10% FCS 的RPMI 1640培養基中、在37°C、5% 二氧化碳下培養、增殖，然后將制備成IXlO7個細胞/ml的細胞懸浮液以 50 μ 1/孔分注到U底96孔板(Nimk公司制造)，離心(90X g、4°C、10分鐘)。除去上清， 加入50 μ 1/孔在上述(4-3)中培養的融合細胞的培養上清，攪拌，然后在冰上靜置1小時， 離心(90Xg、4°C、10分鐘)除去上清。以100 μ 1/孔，用流式細胞儀用緩沖液(含有5% FCS.0. 04% (w/v)疊氮化鈉的PBS)清洗沉淀2次，然后加入50 μ 1稀釋為500倍的異硫氰酸熒光素(以下稱為“FITC”)標記山羊抗小鼠IgG抗體IgG組分(Organon Technica公司制備)，以此作為二次抗體，在冰上靜置1小時。離心(90Xg、4°C、10分鐘)除去上清，然后以100 μ 1/孔，用流式細胞儀用緩沖液洗滌沉淀2次，添加50 μ 1 3. 7%福爾馬林溶液，在冰上靜置10分鐘，固定細胞。離心(90Xg、4°C、10分鐘)除去上清，然后再次以100 μ 1/ 孔，用流式細胞儀用緩沖液洗滌，將沉淀以100 μ 1/孔懸浮于流式細胞儀用緩沖液，以此作為流式細胞儀用試樣。用流式細胞儀(Epics Elite ；Coulter公司制造)測定各試樣中的細胞FITC熒光強度(激發波長488nm、檢測波長530nm)。結果，鑒別出顯示比未添加融合細胞培養上清的人oculospanin表達細胞(FITC熒光強度約為0. 3)的FITC熒光強度明顯高(約100-1000)的試樣所對應的融合細胞。(4-5)克隆對上述(4-4)中選擇的細胞群，將上述(4-3)至(4_4) 一系列的步驟重復5次，由此可得到生成單一的抗體的雜交瘤，其中所述抗體與人oculospanin表達細胞結合，但與導入前的細胞不結合。[實施例5]人oculospanin單克隆抗體的純化將實施例4中制備的小鼠_小鼠雜交瘤在IL含有10% FCS的ASF培養基中、在 37°C、5%二氧化碳下培養、增殖至1 X IO6個細胞/ml。將培養液離心(1000rpm、2分鐘)，舍去上清，將沉淀的細胞用無血清ASF培養基洗滌1次，然后再懸浮于IL無血清ASF培養基中，在37°C、5%二氧化碳下培養48小時。將培養液離心(1000rpm、2分鐘)，回收上清，裝入透析管(滲透極限分子量12000-14000 ；Gibco BRL公司制造)，以10倍量的IOmM磷酸鈉緩沖液(PH 8.0)進行透析。使用高效液相色譜裝置(FPLC系統；Pharmacia公司制造)， 按照以下的條件，由該透析管內液粗提純IgG 柱DEAE_瓊脂糖 CL-6B 柱(柱尺寸 IOml ；Pharmacia 制造)溶劑IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0)
流速1ml/分鐘洗脫IM氯化鈉直線濃度梯度(0-50 %、180分鐘)將洗脫液分級分別取5ml，通過使用人oeulospanin蛋白質的ELISA法檢測 oculospanin抗體效價。首先，將由實施例3中得到的人oeulospanin表達細胞制備的膜組分溶液以100 μ 1/孔加入ELISA用96孔板中，在37°C保溫1小時，然后舍去該溶液，將各孔用100 μ 1/孔PBS-吐溫洗滌3次。接著，加入100 μ 1/孔含有2%牛血清白蛋白的PBS，在 37°C保 溫1小時。用100 μ 1/孔PBS-吐溫洗滌3次之后，加入100 μ 1各洗脫組分，在37°C 保溫1小時。再用100 μ 1/孔PBS-吐溫洗滌3次，之后以100 μ 1/孔添加用PBS-吐溫稀釋2000倍的辣根過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(Amersham公司制造)，在37°C反應1小時，用100 μ 1/孔PBS-吐溫洗滌3次。接著，以100 μ 1/孔加入辣根過氧化物酶底物(BioRad制造)，靜置5分鐘，然后用讀板儀測定各孔在415nm的吸光度。結果，收集吸光度大的組分，過2根抗體親和純化柱(Hitrap ProteinG柱、柱體積 5ml ；Pharmacia公司制造)。用25ml/柱的平衡緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0))洗滌柱內之后，用15ml/柱的洗脫緩沖液(0. IM甘氨酸-鹽酸(pH 2.7))洗脫抗體。各洗脫液流入裝有1. 125mlIM Tris-鹽酸(pH 9.0)的試管內，洗脫結束后立即設置于離心管型超濾器(Centripr印10 ；Grace Japan (株)制造)的上部，以3000 X g、在4°C離心2小時，將該離心操作重復5次。第5次的離心進行至過濾器上部的液量為0. 5ml,以該過濾器上部殘留的液體作為抗人oculospanin抗體試樣。[實施例6]細胞毒活性測定抗體依賴性細胞毒活性作為生物活性的指標。用臺盼藍染色法計數人oculospanin表達細胞(實施例3)，然后用含有10% 胎牛血清(Moregate公司制造)的RPMI 1640培養基(Invitrogen公司制備、以下稱為RPMI培養基)制成IXlO6細胞/ml。添加2. 5 μ 1雙(乙酰氧基甲基)2，2 ‘ 6' 2〃 -terpyridine-6,6" - 二羧酸(BATDA 標記試劑、PerkinElmer 公司制造)，充分攪拌，在37°C、5%二氧化碳存在下溫育30分鐘，其中每間隔5分鐘進行顛倒混合的操作。添加IOmlRPMI培養基，攪拌后以1500rpm離心5分鐘，再將該洗滌操作重復2次。將這樣得到的BATDA標記人oculospanin表達細胞再懸浮于10ml RPMI 1640培養基，向各園底96 孔板中鋪50 μ 1 (5 X IO3細胞)，在4°C靜置30分鐘，其中所述園底96孔板中預先添加有用 RPMI1640培養基制成1 μ g/ml的純化抗人oculospanin抗體或雜交瘤培養上清，并在4°C 靜置了 30分鐘。陰性對照孔中添加RPMI 1640培養基，用以代替純化抗人oculospanin抗體或雜交瘤培養上清。效應細胞如下制備。將在lOOng/ml巨噬細胞集落刺激因子(Sigma公司制備) 存在下預先培養了 3天的J774A. 1細胞(大日本制藥)用臺盼藍染色法計數，然后用 RPMI培養基制成IXlO6細胞/ml。向之前的園底96孔板中各鋪100 μ 1 (1 X IO5細胞)， 將孔板以1500rpm離心5分鐘，在37°C、5 %二氧化碳存在下溫育4小時。陽性對照添加TrionX-100,以代替用于完全殺傷BATDA標記人oculospanin表達細胞的效應細胞。溫育4小時后，由各孔取20 μ 1培養上清，轉移至白色96孔板，添加200 μ 1銪溶液 (PerkinElmer)。在室溫下振蕩15分鐘，測定時間分解熒光。各孔的細胞死亡誘導率由以下的計算式計算。細胞死亡誘導率(％ )=(各測試孔的計數-陰性對照孔的計數)/(陽性對照孔的計數-陰性對照孔的計數)X100與只有RBO 1640培養基的對照進行比較，通過添加純化小鼠抗人oculospanin 抗體或雜交瘤上清，可見誘導了人oculospanin表達細胞的細胞死亡。 [實施例7]作為免疫原和抗體檢測系統抗原的人oculospanin表達細胞及其膜組分的制備a)質粒 pEF/DEST51_NM_031945 的構建使用pENTR Directional Τ0Ρ0 Cloning Kit (Invitrogen 公司制造)，按照所附說明書，將由實施例2a)得到的NM_031945cDNA克隆到pENTR/D-T0P0載體中。將 NM_031945cDNA與pENTR/D-T0P0載體混合，在室溫下溫育30分鐘，其中pENTR/D_T0P0 載體在試劑盒所附的反應緩沖液中與拓撲異構酶結合。使用所得的反應物轉化OneShot T0P10 Chemically Competent Ε. coli (Invitrogen 公司制備)，在含有 50 μ g/ml 卡那霉素的LB瓊脂培養基上培養。結果，選擇顯示卡那霉素抗性并生長的大腸桿菌集落， 在含有Iml 50 μ g/ml卡那霉素的液體TB培養基中、在37 °C培養過夜，利用Montage PlasmidMiniprep96Kit (MiIlipore公司制備)分離純化質粒DNA。對于所得質粒DNA，使用 BigDye Terminator v3. O Cycle Sequencing ReadyReaction Kit,按照試劑盒所附說明進行反應，然后通過ABI PRISM3100DNA測序儀(Applied Biosystems)進行核苷酸序列分析，從而確認GenBank登錄號(具有登錄號NM_031945所示的核苷酸序列的開放閱讀框的 cDNA(SEQ ID NO. 1))被整合到了 pENTR/D-T0P0 載體中。接著，使用GATEWAYTM 系統向表達用載體 pcDNA3. 1/DEST40 (Invitrogen 公司制備)進行基因的轉移。即，用TE緩沖液將4μ 1 GATEWAY LR Clonase Enzyme Mix (Invitrogen 公司制備)、4 μ ILR 反應緩沖液、0· 3μ g pENTR/D-T0P0-NM_031945、 0. 3 μ gpcDNA3. 1/DEST40制備成20 μ 1，在25°C反應1小時。反應后，加入2 μ 1蛋白酶K，在 37°C反應10分鐘。使用所得反應物轉化大腸桿菌OneShot T0P10 Chemically Competent Ε. coli (Invitrogen公司制備)，在含有50 μ g/ml胺芐霉素的LB瓊脂培養基上培養。結果，選擇顯示胺芐霉素抗性并生長的大腸桿菌集落，在含有IOOml 50 μ g/ml胺芐霉素的液體TB培養基中、在37°C培養過夜，利用Plasmid MAXI Kit(QIAGEN公司制備)分離純化質粒 DNA(pcDNA3. 1-DEST40-NM_031945)。同樣，使用 GATEWAY 系統向表達用載體 pEF/DEST51_NM_031945 (Invitrogen 公司制備)進行基因的轉移。即，用TE緩沖液將4μ1 GATEWAY LR Clonase Enzyme Mix (Invitrogen 公司制備)、4 μ 1 LR反應緩沖液、0. 3 μ gpENTR/D-T0P0-NM_031945、0. 3 μ g PEF/DEST51制備成20μ 1，在25°C反應1小時。反應后，加入2μ 1蛋白酶K，在37 °C反應10分鐘。使用所得反應物轉化大腸桿菌OneShot T0P10 Chemically CompetentE. coli (Invitrogen公司制備)，在含有50 μ g/ml胺芐霉素的LB瓊脂培養基上培養。結果， 選擇顯示胺芐霉素抗性并生長的大腸桿菌集落，在含有IOOml 50 μ g/ml胺芐霉素的液體 TB培養基中、在37°C培養過夜，利用Plasmid MAXI Kit (QIAGEN公司制備)分離純化質粒 DNA(pEF/DEST51-NM_031945)。b)質粒 pEF/DEST51-NM_031945 轉染 BALB-3T3 細胞和 293T 細胞將BALB-3T3細胞(理研clone A31)在330片裝有含10%牛血清(Gibco公司制備)(以下稱為“BS”)的Dulbecco改性Eagle培養基(以下稱為“DMEM” ；SIGMA公司制造)的細胞培養用150mm培養皿(培養面積148cm2 ；IffAKI公司制造)中、在37°C、5% CO2 下培養至半匯合，然后將pEF/DEST51-NM_031945轉染BALB-3T3細胞。對BALB-3T3細胞的轉染使用(株)Gene Therapy Systems制造的Gen印orter 2轉染試劑，通過脂轉染進行。 艮口，用無血清培養基(DMEM)清洗-次細胞，然后加入20ml無血清培養基(DMEM)。接著在 50ml Falcon管中加入0. 6ml New DNA diluent、24 μ g按照上述方法回收的質粒DNA (pEF/ DEST51-NM_031945)，混合。向另外的50mlFalcon管中加入0. 35ml無血清培養基(Opti-MEM I ；GIBCO公司制備)、和84 μ 1 Gen印orter 2試劑，混合。將DNA溶液與Gen印orter 2 溶液混合，在室溫下放置20分鐘。然后將DNA-Gen印orterTM2混合液加入到細胞中(lml/ 皿)，在37°C、5% CO2下培養。3小時后，交換為20ml/皿含10%牛血清的DMEM，在37°C、 5% CO2下培養過夜。另外，將質粒pEF/DEST51-NM_031945如下導入293T細胞。向293T細胞的導入使用 LIPOFECTAMINE 2000 試劑(Invitrogen)進行。以 2. 5 X IO5 細胞 /9. 2cm2 的密度鋪 293T細胞，在37°C、5% CO2下培養過夜。在5ml聚丙烯制的管中，將10 μ 1 LIPOFECTAMINE 2000試劑與250 μ 1 OPTI-MEM I低血清培養基(Invitrogen公司)混合，在室溫下反應5 分鐘。在另外的5ml聚丙烯制的管中，將4μ g質粒pEF/DEST51-NM_031945與與250 μ 1 OPTI-MEM I低血清培養基混合。將LIPOFECTAMINE溶液與DNA溶液混合，在室溫下反應20 分鐘。除去培養過夜的293T細胞的培養上清，以2ml/9. 2cm2的比例添加不含抗生素、含有10%胎牛血清(Moregate公司)的Dulbecco' s改良Eagle培養基(Gibco公司)。將 LIP0FECTAMINE-DNA混合液添加到293T細胞，在37°C、5%二氧化碳下培養兩天。c)細胞膜組分的制備(10L) 將由上述方法培養的細胞用PBS(-)緩沖液(大日本制藥(株)制備)清洗。使用細胞刮(IWAKI公司制造)回收細胞，懸浮于230ml 5mMTris緩沖液pH 7. 4中。在4°C將細胞溶液放置30分鐘。用Dounce TypeB勻漿器(50沖程)破碎細胞。用離心機(KUB0TA 制造)以1000G離心10分鐘，回收上清。將上清用超速離心機(BECKMAN制造)、以78000G離心100分鐘，回收沉淀。向沉淀中加入14ml 57%蔗糖的Tris緩沖液，覆蓋，以78000G、通過4°C下的蔗糖密度梯度離心 16小時，回收上層的膜組分。即，向膜組分中添加55mL 5mM Tris緩沖液pH 7.4，在41、以 78000G離心60分鐘，回收沉淀。向沉淀中加入1500 μ 1 5mM Tris緩沖液pH 7. 4，用Dounce Type B勻漿器(10沖程)使細胞溶液均勻。通過在表達確認一項中說明的蛋白質印跡法鑒定細胞膜組分。[實施例8]小鼠的免疫和細胞融合a)免疫將1 X IO7個實施例7中所得人oculospanin基因表達細胞腹腔內施用于5周齡的 BALB/c雌性小鼠(購自日本SLC公司)。2、4、6、8周后將同樣的人oculospanin基因表達細胞(IXlO7個細胞/小鼠)腹腔內施用，進行追加免疫。b)細胞融合從追加免疫4天后的小鼠體內摘出脾臟，將其放入IOml含有IOmM HEPES緩沖液 (pH 7. 4)、0. 02mg/ml碳酸氫鈉、300yg/ml L-谷氨酸的無血清MEM培養基(Eagle MEM培養基“Nissui” (1)日水制藥(株)制造9.4g/L)(以下稱為“無血清MEM培養基”)中，用21G’注射針和鑷子處理脾細胞。將該細胞懸浮液離心，使脾細胞沉淀，然后將該脾細胞用無血清MEM培養基清洗2次，懸浮于無血清MEM培養基，測定細胞數。 另一方面，將用含有15% 85(6仍0)公司制備)、30648/1111谷氨酸、0.051111 β -巰
基乙醇的骨髓瘤增殖培養基(以下稱為“ME培養基”)，在37°C、5%二氧化碳存在下進行培養的、細胞濃度不超過1 X IO6細胞/ml的骨髓瘤細胞SP2/0同樣用無血清MEM培養基清洗， 懸浮于無血清MEM培養基中，測定細胞數。將相當于1/5脾臟的細胞的SP2/0細胞懸浮液與全部脾細胞懸浮液混合，離心后完全除去上清。以下的細胞融合操作是在室溫下、在裝有沉淀的塑料離心管中實施的。一邊振蕩離心管，一邊向該沉淀中緩慢添加Iml 40% (w/v)聚乙二醇4000 (Merck公司制備)， 然后分3次緩慢加入9ml預先加溫至37°C的無血清MEM培養基，離心后除去上清，再一邊用移液管的先端部緩慢攪拌，一邊加入含20% FBS的次黃嘌呤·氨基喋呤·胸苷培養基(以下稱為“HAT培養基”;SIGMA公司制造)，使細胞數為2. 5X IO6細胞/ml。向細胞培養用96 孔板各分注100μ 1/孔，在37°C、7%二氧化碳下培養。1天后，向全部的孔添加100μ IHAHAT 培養基，之后每隔2、3天更換。將這樣得到的融合細胞用于以下通過有限稀釋法進行的篩選。c)有限稀釋將含有由上述b)得到的融合細胞的培養液用HAT培養基(克隆2n次或以后改為 HT培養基)分階段稀釋，使細胞的密度為1細胞/孔(10細胞/ml)、5細胞/孔(50細胞/ ml)。將這樣制備的各試樣以100 μ 1/孔分注到96孔板中，在37°C、7%二氧化碳下培養10 天，其中所述96孔板已預先將100 μ IHT培養基分注到各孔中。d)選擇(d-1) ELISA將實施例7所得細胞膜組分以1 μ g/ml分別分注50 μ 1/孔于ΕΙΑ96孔板(C0STAR 公司制造)。在4°C下放置1天，然后充分震蕩孔板內的抗原液，舍去，在PBS(-)中添加 BSA，將所得溶液以80 μ 1/孔添加，將孔板覆蓋，使用前于4°C保存。使用時恢復至室溫，用通入有含0. 1 %吐溫20的PBS (PBS-T)的Serawasher (Bio-Tec公司制造)將孔板洗滌3次。 加入50 μ 1細胞融合后經過10-12天的細胞培養上清，以此作為一次抗體，在室溫下靜置1 小時。一次抗體反應終止后，用PBS-T洗滌3次，向PBS-T中添加0. 5% BSA，將用所得溶液 (抗體稀釋液)稀釋為5000倍的堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG抗體(BIO SOURCE公司制備) 分別添加50 μ 1/孔，在室溫下靜置1小時。二次抗體反應終止后，將回復至室溫的堿性磷酸酶用顯色底物對磷酸硝基苯酯2Na6H20(pNPP、和光純藥工業制備)以lmg/ml的濃度溶解于 PNPP 緩沖液(97ml/l 二乙醇胺、0. lg/1 MgCl2 ·6Η20、ρΗ 9. 8)，以 100 μ 1/ 孔添加。讀板儀(Nunc International公司制造)測定405nm、630nm的吸光度。d-2)流式細胞儀 將實施例7中得到的HEK293培養細胞在含有10% FBS的DMEM培養基中、在37°C、 5%二氧化碳下培養、增殖，轉染后培養24小時，然后將制備成2 X IO7個細胞/ml的細胞懸浮液以50 μ 1/孔分注到V底96孔板(Corning公司制造)，離心(1000 X g、20°C、5分鐘)。 除去上清，加入50 μ 1/孔在上述c)中培養的融合細胞的培養上清，攪拌，然后在冰上靜置 0.75小時，離心(1000Xg、2(TC、5分鐘)除去上清。以150 μ 1/孔，用流式細胞儀用緩沖液(含有5 % FBS的MEM)清洗沉淀2次，然后加入100 μ 1稀釋為33倍的異硫氰酸熒光素(以下稱為“FITC”)標記山羊抗小鼠IgG抗體IgG組分(和光純藥工業制備)，以此作為二次抗體，在冰上靜置0.75小時。離心(1000Xg、20°C、5分鐘)除去上清，然后以150 μ 1/孔，用流式細胞儀用緩沖液洗滌沉淀2次，將沉淀以500 μ 1/孔懸浮于流式細胞儀用緩沖液，以此作為流式細胞儀用試樣。用流式細胞儀(FC500;BECKMAN公司制造)測定各試樣中的細胞 FITC熒光強度(激發波長488nm、檢測波長530nm)。結果，鑒別出顯示比未添加融合細胞培養上清的HEK293transient表達細胞的FITC熒光強度高(約100-1000)的試樣所對應的融合細胞。e)克隆對上述d)中選擇的細胞群，將上述C)至d) —系列的步驟重復2次，由此可得到生成單一的抗體的雜交瘤的幾個克隆，其中所述抗體與HEK293 transient表達細胞結合， 但與導入抗人oculospanin表達質粒前的細胞不結合。這樣克隆的雜交瘤細胞株之一被命名為03B8-2C9-4F3，于2004年2月17日保藏于日本獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏號FERM BP-08627。[實施例9]抗人oculospanin單克隆抗體的純化將實施例8中制備的小鼠_小鼠雜交瘤懸浮于HY培養基，濃度為IX IO6細胞/ ml，在37°C、7%二氧化碳下靜置3天。將這樣得到的培養液離心(1600rpm、5分鐘)，回收上清，在以下的條件下進行IgG的純化。結合緩沖液ρΗ7. 0 (2OmM Na2HPO4 · 12H20,20mMNa2HP04 · 2H20) 洗脫緩沖液pH 3. 0，IOOmM甘氨酸-HCl中和緩沖液pH 9. 0，IM Tris-HCl取所需量蛋白G載體(Amersham Biosciences公司制備)，除去乙醇，然后用超純水清洗2次，用結合緩沖液清洗1次，加入結合緩沖液，制成50%凝膠漿。向雜交瘤上清中加入蛋白G凝膠漿，在4°C旋轉過夜，用結合緩沖液清洗3次。清洗后，加入洗脫緩沖液，洗脫抗體。洗脫液流入裝有洗脫緩沖液的1/10量的中和緩沖液的管內。洗脫液進入樣品離心管型超濾器(Amicon Ultrafree-MC :Millipore公司制造)的上部，在4°C、以5000X g離心20分鐘，將回收至過濾器下部的濾液除去，添加洗脫液，使過濾器上部的液量保持不低于50μ1。將洗脫液全部添加后，一洗脫液的3倍的量加入PBS (-)，與緩沖液交換，以殘留于該過濾器上部的液體作為抗人oculospanin抗體試樣。[實施例10]細胞毒活性測定抗體依賴細胞毒活性作為生物活性的指標。用臺盼藍染色法計數實施例7中制備的人oculospanin表達細胞，然后用含有10%胎牛血清(Moregate公司制造)的RPMI 1640培養基(Invitrogen公司制備、以下稱為RPMI培養基)制成8X 105細胞/0. 4ml。添加40 μ 1鉻-51 (鉻酸鈉、Amersham Bioscience公司制造)，在37°C、5%二氧化碳存在下溫育2小時。添加8ml RPMI培養基，攪拌后以1500rpm離心5分鐘，再將該洗滌操作重復 2次。將這樣得到的鉻-51標記人oculospanin表達細胞再懸浮于4ml RPMI培養基，各向園底96孔板中鋪50 μ 1 (1 X IO4細胞)，在4°C靜置30分鐘，其中所述園底96孔板中預先添加有50 μ 1用RPMI培養基制成為5 μ g/ml的純化抗人oculospanin抗體。陰性對照孔或背景測定孔中添加RPMI培養基，用以代替純化抗人oculospanin抗體。
效應細胞如下制備。即，按照常規方法由BALB/c-nu/nu小鼠(雌性、7周齡)采集脾細胞，用臺盼藍染色法計數，然后用RPMI培養基制成1. 5X IO7細胞/ml。向之前的園底96孔板中各鋪100 μ 1 (1. 5 X IO6細胞)，將孔板以1500rpm離心5分鐘，在37°C、5%二氧化碳存在下溫育4小時。陽性對照中添加2% TrionX-100,以代替用于完全殺傷鉻_51標記人oculospanin表達細胞的效應細胞。背景測定用孔中添加RPMI培養基，以代替效應細胞。溫育4小時后，由各孔取50 μ 1培養上清，轉移至96-well Luma Plate (PerkinElmer 公司制造)。在50°C干燥過夜，通過微孔般閃爍計數儀(TopCourt NTX、PerkinElmer公司制造)測定各孔的鉻-51的量。各孔的細胞死亡誘導率由以下的計算式計算。細胞死亡誘導率(％ )=(各測試孔的計數-背景測定用孔的計數)/(陽性對照孔的計數-背景測定用孔的計數)X100 與陰性對照進行比較，通過添加純化小鼠抗人oculospanin抗體，可見誘導了人 oculospanin表達細胞的細胞死亡(圖5)。產業實用性本發明發現人oculospanin在黑素瘤中的表達量顯著增加，提供使用該基因的癌的檢測方法、癌的檢測試劑盒，還提供具有對人oculospanin表達細胞的細胞毒活性的抗體、含有該抗體的癌治療用藥物組合物。序列表獨立文本SEQ ID N0. 5 人 oculospanin 擴增用 PCR 有義引物。
權利要求
1.單克隆抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與人 oculospanin特異性結合，且對于表達該蛋白質的癌細胞具有細胞毒活性。
2.單克隆抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與含有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質和/或含有序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的蛋白質特異性結合，且對于表達該蛋白質的癌細胞具有細胞毒活性。
3.權利要求1或2的用途，其特征在于所述癌細胞是皮膚癌細胞。
4.權利要求1或2的用途，其特征在于所述癌細胞是黑素瘤細胞。
5.權利要求1或2的用途，其特征在于所述抗體為人源化抗體。
6.權利要求1或2的用途，其特征在于所述抗體為完全人抗體。
7.權利要求1或2的用途，其特征在于所述抗體為IgG抗體。
8.根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述癌癥是皮膚癌或黑素瘤。
全文摘要
一種以癌特異性抗原為靶的抗體。本發明涉及使用癌基因的癌檢測方法、癌癥治療藥和/或具有預防效果的化合物的篩選方法、以及癌癥治療藥和/或預防用藥物組合物。即本發明提供以人oculospanin基因的表達為指標的癌的檢測方法，以及含有特異性識別人oculospanin基因、對于癌細胞具有細胞毒活性的抗體的藥物組合物。
文檔編號G01N33/53GK102151334SQ20101010907
公開日2011年8月17日 申請日期2004年3月9日 優先權日2003年3月10日
發明者市川公久, 平井岳大, 我妻利紀, 福地圭介, 高橋秀 申請人:三共株式會社