專利名稱：實時靈敏生物大分子檢測新方法及試劑盒制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于納米生物新技術領域，涉及旋轉式ATP馬達構建的納米生物傳感器的 設計、組裝及在病毒、蛋白快速靈敏檢測中的新方法與其對應的檢測試劑盒制備與應用。
背景技術：
本發明人于2004年12月16日提交了題為“可調控分子馬達微動力生物傳感器” 的中國專利申請(
公開日2006年6月21日，CN1789425，已授權)，公開了一種可調控分子 馬達微動力生物傳感器，其包含以下部分(1)旋轉馬達=FtlF1-ATP酶；( 光能轉換裝置 光反應中心與復合物(RC)和泛醌；C3)電子轉換裝置與光能轉換裝置為同一體系；(4)信 號分子輸出裝置由光激發與發射裝置和熒光探針組成；( 能源系統由水，ATP, ADP，無 機磷，和可見光組成；(6)保護層雙層脂膜作位內膜的保護層；(7)支架材料和雙層脂膜的 固定材料。該專利公開了熒光探針可以是位于膜外側的Lipids-熒光素，位于膜內側的熒 光素，分子馬達旋轉是由ATP水解驅動的，其中所述分子馬達旋轉是由能轉換的跨膜電化 學電位差驅動的，或者所述跨膜電化學電位差是由光能或化學能轉換的。在該生物傳感器 中，負載是連接在生物傳感器的分子馬達的三個β亞基上。該專利還公開了所述可調控分 子馬達微動力生物傳感器在生物大分子、病毒分子等的檢測中的應用。
發明內容
本發明是對該中國專利申請號2004100989 . 9的進一步重要改進，主要的區 別(1)在于本發明用旋轉式分子馬達原理的生物傳感器，發明了具有一種全新的功能分 子器件，該器件具備對生物分子進行邊捕捉目標分子，邊旋轉將其捕捉到目標分子實時過 程的功能為一體，發展成為實時靈敏快速檢測新技術；( 對前一專利(中國專利申請號 200410098929. 9)中熒光測定的原理和方法進行了重要的改進，提出了將ATP合酶的合成 過程中的產物ATP作為熒光淬滅劑，結合ATP合酶的合成過程中質子外流引起的膜外pH 改變引起的熒光強度減弱，兩者對熒光的減弱效應在我們的反應條件下具有協同作用；(3) 在分子馬達旋轉驅動的能源方面，本發明將光能轉換技術改進為化學能驅動，此改進將生 物傳感器邊捕捉目標分子，邊測定熒光強度的設想變成可能；(4)本發明與檢測試劑盒制 備新方法結合在一起，使基于旋轉式分子馬達原理的生物傳感器的實際應用成為可能；上 述檢測方法及試劑盒制備技術可廣泛擴展應用于環境、國防、能源、信息等眾多領域，有極 其廣泛的應用價值和巨大的經濟與社會效益。本發明從分子馬達生物傳感器的角度，構建以FtlF1-ATPase蛋白質旋轉分子馬達 為基礎的，以生物素-親和素-生物素為連接成分，以病毒蛋白抗體為捕獲體的高靈敏、快 速檢測體系，產生類似于微動力旋轉捕獲器的效應，明顯縮短了反應時間，采用ATP、質子外 流雙淬滅熒光技術，有效提高了信噪比，采用sol-gel技術(溶膠-凝膠法)提高了生物馬 達生物芯片的均一性，實現了實時靈敏快速檢測。具體地，本發明提供以下各項
1. 一種納米生物傳感器，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase, 其中所述FtlF1-ATPase的ε亞基上連接有生物大分子。2.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述載色體(chromatophores)是來自 (制備自)編號為 ATCC 27502 的嗜熱菌(Thermomicrobium roseum)。3.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述ε亞基是經由抗ε亞基抗體與 所述生物大分子連接。4.根據以上4所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是多克隆抗體或單 克隆抗體。5.根據以上1所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是通過生物素-親 和素-生物素與所述生物大分子連接。6.根據以上1-5中任一項所述的納米生物傳感器，其中所述生物大分子是DNA、小 RNA (小干擾RNA，反義RNA等)、或蛋白質(親和性受體/配體，抗原/抗體)，優選病毒分 子特異性抗原(例如病毒蛋白)的抗體，該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。7.根據以上1-6任一項所述的納米生物傳感器在制備用于檢測生物大分子的試 劑中的應用。8.根據以上7所述的應用，其中所述納米生物傳感器經過了 sol-gel技術(溶 液-凝膠法)處理。9.根據以上7或8所述的應用，其中所述試劑用于96孔芯片型快速靈敏檢測。10.試劑盒，其包含根據以上1-5中任一項所述的納米生物傳感器。在本發明的一個優選實施方案中，所述試劑盒包含在一個隔室中的根據以上1-5 中任一項所述的納米生物傳感器。11.根據以上10的試劑盒，其中所述試劑盒是96孔ELISA過濾性微孔板的形式， 其中所述納米生物傳感器位于所述96孔ELISA過濾性微孔板的各孔中的濾紙上。12.根據以上6所述的納米生物傳感器，其中所述病毒是禽流感病毒(H5N1、HlNl 型)或HIV。另一方面，本發明涉及以下各項1. 一種納米生物傳感器，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase, 其中所述FtlF1-ATPase來自嗜熱菌(ATCC27502)，并且所述FtlF1-ATPase的ε亞基上連接有 病毒蛋白抗體。2.根據以上1的納米生物傳感器，其中所述ε亞基是經由抗ε亞基抗體與所述 病毒蛋白抗體連接，其中所述抗ε亞基抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。3.根據以上2的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是通過生物素_親和 素-生物素與所述病毒蛋白抗體連接。4.根據以上1的納米生物傳感器，AITase合成產物ATP可以作為熒光淬滅劑，而 ATPase旋轉過程中泵出膜外的質子也可以引起膜外熒光的減弱，起到雙淬滅的協同效應；5.根據以上1的納米生物傳感器，其中驅動分子馬達旋轉的能量來自于ATP的生 物化學能，而不是前一專利中的光能轉化為質子梯度，然后驅動分子馬達旋轉，即以化學能 驅動代替光能光驅；
6.根據以上1的納米生物傳感器，其鋪生物芯片時在溶液中用到了 sol-gel技術， 實現了產品的均一性；7.根據以上1-5任一項所述的納米生物傳感器在快速靈敏檢測病毒蛋白中應用， 所述納米生物傳感器用于快速靈敏檢測。本發明還提供應用于病毒蛋白粒子快速靈敏檢測的納米生物機器人的構 建方法，該方法包括如下步驟(步驟后未詳細描述的部分可參見中國專利申請號 200410098929. 9)(1)嗜熱菌載色體(chromatophores)的制備培養嗜熱菌(Thermomicrobiumroseum, ATCC 27502，商購于美國 ATCC 菌種保 藏中心)。培養基1 升水中加入 hast extract 1. Og, Tryptonel. Og, (NH4)2SO4,1. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 247g, KH2PO4 0. 28g, CaCl2 · 2H200. 074g, FeCl3 · 6H20 0. 019g，鹽溶液 1ml。 鹽溶液的配方為 MnCl2 · 4H20 1. 8g, Na2B4O7 · IOH2O 4. 4g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, CuCl2 · H2O 0. 05g, Na2MoO4 · 2H200. 03g, VSO4 · 2H20 0. 03g，用 H2SO4 調 pH 至 2. O。高壓滅菌 15 分鐘。收獲細菌的培養溫度為60°C，搖床轉速為120轉/分，培養對小時，5000g離心 收集。載色體(Chromatophores)的提取將以上收集的細菌用緩沖液(20mM，Tris-HCl， 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0,2mM MgCl2, IOOmM NaCl，10%甘油)洗滌一次，然后再加 入20ml的上述緩沖液，懸浮后，超聲(20%振幅，Cole Parmer CPX 600超聲儀13#探頭)， 超聲5秒，停8秒，超聲有效時間為8分鐘，用上述緩沖液洗滌一次。180，OOOg在4°C離心 90分鐘，沉淀為載色體(Chromatophores)，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPaset5(2) F-DHPE 標記載色體(chromatophore)將360 μ 1的0. 5 μ g/ μ 1以上制備的載色體(chromatophore)(帶有分子馬達的 脂囊泡)加入0. ImM 540 μ 1的Tricine (三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)(pH =8. 0)，充分混勻，加入40μ l，lmg/ml的F-DHPE (熒光探針，購自美國Invitrogen公司，產 品名:fIuorescein-DHPE[N-(fluorescencein-5-thiocarbamoyl)_1，2-dihexadecanoyl-s n-glycero-3-phosphorethanolamine, triethylammonium salt，產品編號:445395), ^ 搖床上放置60分鐘，離心去掉游離的F-DHPE，，14，OOOrpm, 30分鐘，洗1遍，重懸于400 μ 1， 0. ImM 的 Tricine (pH = 6.5),備用。(3) sol-gel溶液(溶膠-凝膠法)制備①將15. 2ml正硅酸乙酯(購自國藥集團 化學試劑有限公司，產品編號=80124192)和80微升0. 07N HCl依次加入3. 6ml去離子水； ②將之置于冰浴上攪拌10分鐘；③室溫超聲20分鐘；④將3. 6ml的去離子水與7. 2ml聚 乙二醇 300 (PEG, Polyethyleneglycol，分子量為 300，購自 Fluka 公司，產品編號=90878, 美國)混勻，緩慢遞加入正硅酸乙酯溶液中；⑤上述溶液經過0.45微米的濾膜過濾；⑥上 述溶液用緩沖液(0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml，ρΗ9· 6)稀釋10倍后備 用。(4)H5m病毒的增殖病毒株為[A/Anhui/1/2005 (H5N1)](參見文獻[董婕，張紅，劉運芝等.中國大陸 首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的實驗室診斷.中華實驗和臨床病毒學雜志， 2006,20 (2) :14-16])，選用10-11日齡的雞胚，畫出氣室和胚位，在氣室接近胚位處涂抹碘酊和酒精進行消毒后，用鋼錐穿一小孔，隨后將注射器針頭沿此小孔插入0. 5-1. Ocm處 (避開血管)，注入0. l_0.2ml接種物。最后用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育。每天翻卵并 檢卵一次。M小時內死亡者廢棄。培養42小時后，收集尿囊腔液體，4000rpm，離心40分 鐘，收集上清，IOOOOOg離心，2h，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)重懸，儲存備用。 H5m單克隆抗體參見文獻[詹愛軍，王新衛，陳枝楠等.抗H5亞型AIV血凝素 單克隆抗體的制備及亞型鑒定.畜牧獸醫醫學，2008，M (6) :8-11])，抗體名稱為H5W單 克隆抗體。(6)分子馬達生物傳感器的芯片及試劑盒制備2μ l，0.5yg/y 1的載色體 (Chromatophores)(帶有分子馬達),0. 25 μ 1制備的sol-gel溶液(可按照本領域已知的 方法或本說明書中以下實施例中描述的方法制備)，與48μ 1緩沖液(0. 16g Na2CO3,NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml, ρΗ9· 6)混合，滴在直徑為0. 5cm的圓形濾紙上(Whatman公司， 產品編號1450090，英國)，室溫干燥12小時備用。濾紙上滴加30μ 1，0. 12μΜ生物素化 的分子馬達ε亞基多抗，37°C連接60分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7. 4)洗滌1 次；力卩30 μ 1，0. 6 μ M親和素，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7. 4)洗滌 1次；加35μ 1,0. 18 μ M生物素化的病毒蛋白抗體，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖 液(PBS，ρΗ7. 4)洗滌2次，室溫干燥12小時備用。圓形濾紙置于96孔ELISA過濾型微孔 板上，該96孔ELISA過濾性微孔板即為本發明中的試劑盒。相對于常規抗原抗體結合的分子擴散、結合的過程，納米生物技術在病毒快速靈 敏檢測領域體現出強勁的活力，構建納米生物傳感器，利用納米生物機器旋轉的特性，將抗 體連接到分子馬達上，旋轉的抗體在溶液體系中運動，從而實現抗體對待測抗原的動態捕 捉，大大縮短抗原抗體的結合時間，并提高檢測的效率，靈敏度較傳統方法顯著提高。鑒于流感病毒(Η5Ν1、Η1Ν1)、艾滋病(HIV)是危險全球人類健康的重大傳染性疾 病，因此對病毒蛋白的快速靈敏檢測對該類疾病的預防及早期治療具有重要意義，因此本 發明構建的ATP馬達旋轉式生物傳感器具有廣闊的國內外應用前景及巨大的市場價值，是 納米生物機器與傳統抗原抗體檢測技術結合之后的一個較大的技術突破，潛在的用戶包括 各大中型醫院的檢驗科，海關進出口檢驗檢疫部門，產品投入使用后將產生直接的經濟效 益。以艾滋病毒PM蛋白檢測試劑盒為例，進口的試劑盒(100人份)價格為約1萬元，而 按成本計算，本發明中生產的試劑盒(100人份)估算成本為50元，以批發價格500元計 算，利潤空間很大。在社會作用方面，納米生物傳感器的廣泛應用，將實現病毒性疾病的快 速檢測，有效遏制Hmi、SARS等病毒性疾病的爆發流行，對HIV等傳染病也能實現早期快速 診斷，為疾病防控提供依據，早期發現攜帶者，保護易感人群，具有很大的社會效益。發明詳述本發明是對中國專利申請號200410098929. 9 (
公開日2006年6月21日， CN1789425，已授權)的進一步改進，區別在于4個方面第一，在本發明中，抗原抗體的結合[捕獲體(病毒蛋白抗體)與抗原的結合]與 分子馬達旋轉啟動與測定是同時進行的，即邊轉邊測，而前一專利中，抗原抗體的結合[捕 獲體(病毒蛋白抗體)與抗原的結合]與分子馬達旋轉的啟動是分兩步進行的，即先結合 再檢測；顯然，本發明的檢測時間大大縮短，而且捕獲抗體隨著分子馬達旋轉，實現了對抗 原分子的動態主動捕捉，提高了檢測靈敏度。
第二，在本發明中，捕獲抗體(第二抗體)通過連接成分與分子馬達的ε亞基連 接，而前一專利是連接在β亞基上，相對于β亞基的上下局部運動而言，ε亞基位于分子 馬達轉動的核心軸上，其運動是360°的全旋轉，因此當捕獲抗體與抗原結合，引起分子馬 達轉動的負荷改變時，這種生物傳感器對信號分子更敏感；第三，在本發明中，采用了熒光雙淬滅技術，即AIPase合成產物ATP可以作為熒 光淬滅劑(圖1)，而AIPase旋轉過程中泵出膜外的質子也可以引起膜外熒光的減弱[Cui Yuanbo, Zhang Fan, Yue Jiachang,等· Detectingproton flux across chromatophores driven by F0F1-ATPase usingN-(fluoreseein-5-thiοcarbamoyl)-1,2-dihexadec anoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt.Analytical Biochemistry, 2005, 344(1) : 102-107]，起到雙淬滅的協同效應；第四，在本發明中，驅動分子馬達旋轉的能量來自于ATP的生物化學能，而不是 前一專利中的光能轉化為質子梯度，然后驅動分子馬達旋轉，即以化學能驅動代替光能光 驅；第五，在本發明中，引入了 sol-gel技術，即溶膠-凝膠法，以正硅酸乙酯和聚乙二 醇(PEG300)的反應產物增加分子馬達生物芯片的穩定性，不易被洗脫，鋪設的產品表面更 加均勻，提高了產品的均一性。第六，試劑盒制備將2 μ 1，0. 5 μ g/ μ 1的chromatophores (帶有分子馬達)， 0. 25 μ 1 制備的 sol-gel 溶液，與 48 μ 1 緩沖液(0. 16g Na2CO3, NaHCO3O. 293g，加水定容到 IOOml, ρΗ9· 6)混合，滴在直徑為0. 5cm的圓形濾紙上(Whatman公司，產品編號=1450090, 英國)，圓形濾紙置于96孔ELISA過濾型微孔板上，室溫干燥12小時備用。濾紙上滴加 30 μ 1，0. 12 μ M分子馬達ε亞基多抗，37°C連接60分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS， ρΗ7· 4)洗滌1次；加30μ 1,0.6 μ M親和素，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS, ΡΗ7. 4)洗滌1次；加35μ 1，0. 18 μ M生物素化的病毒蛋白抗體，室溫連接5分鐘，加100 μ 1 磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7. 4)洗滌2次，室溫干燥12小時備用。圓形濾紙置于96孔ELISA 過濾型微孔板上，該96孔ELISA過濾性微孔板即為本發明中的試劑盒。本發明內容的要點(1)變兩步法為一步法，即前一專利為捕獲抗體與病毒蛋白 結合，然后加入ADP合成啟動緩沖液，啟動分子馬達旋轉，本發明為一步法，邊轉變測，即捕 獲抗體與病毒蛋白的結合的同時，啟動分子馬達旋轉，縮短檢測時間；( 捕獲抗體是通過 連接體系與分子馬達的ε亞基結合，檢測的靈敏度進一步提高；C3)驅動分子馬達旋轉的 能量供應體系由前一專利的光能轉化的質子梯度差驅動變為生物化學能驅動，使用前不用 光照貯能，使用上更為方便；(4) ATP和質子對熒光的雙淬滅效應；( sol-gel對試劑盒加 工的穩定作用。以下對本發明的技術方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發明的各實施方案可 以根據需要以任何方式組合。在本發明的一個實施方案中，提供一種納米生物傳感器(一種生物載色體體系)， 其包括載色體(chromatophore，脂囊泡)，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase,所述 F0F1-ATPase的ε亞基上連接有捕獲抗體。F0F1-ATP合酶是由多亞基組成的復合體，包括膜內的F。部分，基本組成是ab2cn ；膜 外親水F1部分亞基的基本組成是α3β3Υ ε δ。這兩部分分別由2個柄連接中心的柄為Yε復合物，連接F1的α 3β3亞基和Ftl的c亞基；偏心柄為插入膜區的a亞基與膜外ID2亞 基，b2的另一端與δ亞基的C端連接，而δ亞基的N端與F1部分α亞基連接(圖2)。本發明通過生物工程技術將ε亞基與病毒蛋白的捕獲抗體連接，當捕獲抗體捕 獲到病毒蛋白時，分子馬達的負荷改變，引起分子馬達的旋轉改變，即不同的分子馬達負荷 對應不同的旋轉速度，從而對應不同的膜外質子濃度，而膜外的熒光染料(F-DHPE)對ρΗ值 敏感，因此不同的質子濃度會呈現不同的熒光強度。因此可充分利用FtlF1-ATP合酶這一旋 轉分子馬達的特性，廣泛應用于生物傳感器等領域。在本發明的在另一個實施方案中，不同的病毒蛋白抗體可以捕獲對應的病毒蛋 白，從而通過改變不同的捕獲抗體，可以對多種病毒蛋白進行快速靈敏檢測。在本發明的另一個實施方案中，本發明提供一種試劑盒，該試劑盒包含根據本發 明的納米生物傳感器，以及稀釋抗原、啟動分子馬達旋轉的二合一緩沖液。鑒于H5m致死性禽流感和大量傳染性病毒性疾病(人與人之間傳播的Hmi北美 流行株、HIV等)對公共衛生的嚴重危險，對社會、經濟的重大危害，而目前的檢測手段要么 耗時較長(核酸檢測)，要么靈敏度不夠(傳統ELASA法，膠體金法)，因此本發明構建的能 快速靈敏檢測病毒蛋白的納米生物傳感器具有廣闊的國內外應用前景及巨大的市場價值， 是納米生物機器在傳感器及病毒檢測領域的一個較大的技術突破，潛在的用戶包括各大中 型醫院的檢驗科、海關進出口檢驗檢疫部門、各級衛生防疫部門及機關、學校的衛生室，產 品投入使用后將產生直接的經濟效益和巨大的社會效益。
圖1是ATP對F-DHPE熒光淬滅的劑量-效應關系示意圖；圖中曲線由上至下，分別代表ATP濃度為0mM，0. 5mM, 1. OmM, 1. 5mM, 2. OmM, 2. 5mM, 3. OmM, 3. 5mM，而最下方的一條水平線代表體系熒光本底值。結果顯示，隨著反應體系中ATP 濃度的逐步升高，納米生物傳感器標記的F-DHPE熒光強度依次下降，呈現出劑量-效應關 系，這就是ATP對納米生物傳感器標記的F-DHPE熒光的淬滅效應。圖2是分子馬達的(FtlF1-ATP合酶)生物傳感器示意圖； F0F1-ATP合酶是由多亞基組成的復合體，包括膜內的Ftl部分，基本組成是ab2cn ；膜 外親水F1部分亞基的基本組成是α3β3Υ ε δ。這兩部分分別由2個柄連接中心的柄為
Yε復合物，連接F1的α 3β3亞基和Ftl的c亞基；偏心柄為插入膜區的a亞基與膜外ID2亞 基，b2的另一端與δ亞基的C端連接，而δ亞基的N端與F1部分α亞基連接(圖2)。圖3是分子馬達的(FtlF1-ATP合酶)生物傳感器熒光標記示意圖；分子馬達是一種理想的納米動力裝置。分子馬達中，可轉動部分為Y ε和 ，可 方便的進行工程化改造，例如在ε亞基上接上各種病毒蛋白的捕獲抗體，那么可充分利用 F0F1-ATP合酶這一旋轉分子馬達的特性，廣泛應用于病毒快速檢測。當捕獲抗體捕獲到病 毒蛋白時，分子馬達的負荷改變，引起分子馬達的旋轉改變，即不同的分子馬達負荷對應不 同的旋轉速度，從而對應不同的膜外質子濃度，而膜外的熒光染料(F-DHPE)對ρΗ值敏感， 因此不同的質子濃度會呈現不同的熒光強度(圖幻。因此可充分利用FtlF1-ATP合酶這一 旋轉分子馬達的特性，廣泛應用于生物傳感器等領域。圖4是納米生物傳感器對致死型禽流感H5W的實時動態檢測(樣本例數=7)；注圖中上部線條代表病毒組熒光變化曲線；下部線條代表對照組熒光變化曲線，結果顯 示，隨著時間的延長，病毒組熒光下降速度明顯慢于對照組，其機理為病毒組中分子馬達上 連接的捕獲抗體與病毒蛋白粒子結合后，旋轉分子馬達的負荷增大，分子馬達旋轉速度下 降，其對質子的轉運速度減慢，而對PH敏感的熒光染料的熒光強度變化速度減慢；圖5是ADP對納米生物傳感器的啟動效應(樣本例數=3)；注圖中黑色線條代表 OmM ADP組熒光變化曲線；紅色線條代表2mM ADP組熒光變化曲線；藍色線條代表4mM ADP 組熒光變化曲線。結果顯示，隨著時間的延長，隨著反應體系中ADP濃度的逐步升高，高濃 度ADP組熒光下降速度明顯快于對照組，其機理為反應底物(ADP)濃度在一定范圍內的增 加，啟動了納米生物傳感器核心組件分子馬達活性的增加，這就是ADP對納米生物傳感器 的啟動效應。圖6是分子馬達生物傳感器對致死型禽流感H5W的實時動態檢測的組間比較 (樣本例數=7)(注方差齊性檢驗，方差齊(Levene statistic統計檢驗量為0. 625，P = 0. 44 ，對照組與H5W病毒組的組間差異具有顯著性，t = 7. 972，P < 0. 05。表中數據為 檢測熒光強度的下降率(% )。病毒組中的病毒濃度為1000個病毒蛋白粒子/微升。對照 組與H9N2病毒組的組間差異不具有顯著性)。圖7是顯示H5W病毒蛋白濃度與檢測熒光強度的劑量效應關系(注方差齊性檢 驗，總體方差齊(Levene statistic統計檢驗量為0. 440，P = O. 725)，總體方差具有顯著 性差異，F = 15. 763，P < 0. 05，組間差異的方差比較采用LSD法，結果顯示各病毒組與對 照組比較差異均有顯著性。表中數據為熒光掃描儀96孔板掃描測定熒光強度。高濃度組 (100000個病毒蛋白粒子/孔)；中濃度組(10000個病毒蛋白粒子/孔)；低濃度組(1000 個病毒蛋白粒子/孔)；對照組無病毒蛋白粒子。樣本例數為N = 12)。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但不應理解為是對 本發明進行限定。本發明的目的是通過下面的技術方案實現的1.分子馬達及光合作用的復合物(Chromatophores)制備載色體(Chromatophores)的制備與前一專利(中國專利申請號2004100989 . 9) 不同之處在于本發明中的載色體為嗜熱菌載色體(chromatophores)，與前一專利中的光 合菌載色體相比，本發明中的載色體活性更好，穩定性更好，其制備方法為培養嗜熱菌 (Thermomicrobiumroseum, (ATCC27502)商購于美國 ATCC 菌種保藏中心)。培養基1 升水中力口入 Yeast extract 1. 0g, Tryptone 1. 0g, (NH4)2SO4,1. 3g, MgSO4 ·7Η20 0. 247g, KH2PO4 0. 28g，CaCl2 ·2Η20 0. 074g，FeCl3 ·6Η20 0. 019g，鹽溶液 Iml。鹽 溶液配方為 MnCl2 · 4H20 1. 8g, Na2B4O7 · IOH2O 4. 4g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, CuCl2 · H2O 0. 05g, Na2MoO4 · 2H20 0. 03g, VSO4 · 2H200. 03g,用 H2SO4 調 pH 至 2. 0。高壓滅菌 15 分鐘。收獲細菌的培養溫度為60°C，搖床轉速為120轉/分，培養M小時，6000g離心 收集。載色體(Chromatophores)的提取將以上收集的細菌用緩沖液(20mM，Tris-HCl， 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0,2mM MgCl2, IOOmM NaCl，10%甘油)洗滌一次，然后再加入20ml的上述緩沖液，懸浮后，超聲(20%振幅，Cole Parmer CPX 600超聲儀13#探頭)， 超聲5秒，停8秒，超聲有效時間為8分鐘，用上述緩沖液洗滌一次。180，OOOg在4°C離心 90分鐘沉淀為載色體(Chromatophores)。2. F-DHPE 標記載色體(chromatophore)360μ 1，0· 5μ g/μ 1載色體(chromatophore)(帶有分子馬達的脂囊泡)，加入 0. ImM 540μ 1的iTricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)(pH = 8. 0)，充 分混勻，加入40μ l，lmg/ml的F-DHPE(熒光探針，購自美國Invitrogen公司，產品名:flu orescein-DHPE[N-(fluorescencein-5-thiocarbamoyl)_1，2-dihexadecanoyl-sn-glycer o-3-phosphorethanolamine, trie thy lammonium salt，產品編號445395)，室溫搖床上放 置60分鐘，離心去掉游離的F-DHPE,，14，OOOrpm, 30分鐘，洗1遍，重懸于400 μ 1，0. ImM的 Tricine (pH = 6. 5),備用。3. sol-gel溶液(溶膠-凝膠法)制備①將15. 2ml正硅酸乙酯(購自國藥集團 化學試劑有限公司，產品編號=80124192)和80微升0. 07N HCl依次加入3. 6ml去離子水； ②將之置于冰浴上攪拌10分鐘；③室溫超聲20分鐘；④將3. 6ml的去離子水與7. 2ml聚 乙二醇 300 (PEG, Polyethyleneglycol，分子量為 300，購自 Fluka 公司，產品編號=90878, 美國)混勻，緩慢遞加入正硅酸乙酯溶液中；⑤上述溶液經過0. 45微米的濾膜過濾；⑥上 述溶液用緩沖液(0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml，ρΗ9· 6)稀釋10倍后備 用。4.分子馬達生物傳感器的芯片及試劑盒制備2μ 1，0. 5μ g/μ 1的 chromatophores (帶有分子馬達)，0· 25 μ 1制備的sol-gel溶液，與48 μ 1緩沖液(0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml, ρΗ9· 6)混合，滴在直徑為0. 5cm的圓形濾紙上 (Whatman公司，產品編號1450090，英國)，室溫干燥12小時備用。濾紙上滴加30 μ 1， 0. 12 μ M生物素化的分子馬達ε亞基多抗，37°C連接60分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液 (PBS, ρΗ7· 4)洗滌1次；加30μ 1，0.6μΜ親和素，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖 液(PBS，pH7. 4)洗滌1次；加35μ1，0. 18 μ M生物素化的病毒蛋白抗體(單克隆或多克隆 抗體)，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7. 4)洗滌2次，室溫干燥12小 時備用。圓形濾紙置于96孔ELISA過濾型微孔板上，該96孔ELISA過濾性微孔板即為本 發明中的試劑盒。本發明的分子馬達應用于病毒蛋白檢測包括以下步驟(1)嗜熱載色體的制備對嗜熱菌進行加工處理，得到載色體，其上帶有FtlF1-ATP 酶；(2)病毒抗體與分子馬達進行連接。實施例1納米生物傳感器的組裝1. F-DHPE 標記載色體(chromatophore)360 μ 1，0. 5 μ g/μ 1載色體(chromatophore)(帶有分子馬達的脂囊泡)，加入 0. ImM 540μ 1的iTricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)(pH = 8. 0)，充 分混勻，加入40μ l，lmg/ml的F-DHPE (熒光探針，購自美國Invitrogen公司，產品名:fluo rescein-DHPE[N-(fluorescencein-5-thiocarbamoyl)_1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero -3-phosphorethano !amine, trie thy lammonium salt,產品編號445395),室溫搖床上放置60分鐘，離心去掉游離的F-DHPE,，14，OOOrpm, 30分鐘，水洗1遍，重懸于400 μ 1,0. ImM的 Tricine (pH = 6. 5),備用。2.納米生物傳感器安裝病毒蛋白捕獲抗體2 μ 1，0. 5 μ g/ μ 1的chromatophores (帶有分子馬達)與48 μ 1緩沖液(緩沖液 制備0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml, ρΗ9· 6)混合，滴在直徑為0. 5cm的 圓形濾紙上(Whatman公司，美國)，室溫干燥12小時備用。濾紙上滴加30 μ 1，0. 12 μ M分 子馬達ε亞基多抗，37°C連接60分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 4)洗滌1次；加 30 μ 1，0. 6 μ M親和素，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7. 4)洗滌1次；加 35μ 1,0. 18 μ M生物素化的病毒蛋白抗體(抗H5W病毒的HAl蛋白的單克隆抗體，參見文 獻[詹愛軍，王新衛，陳枝楠等.抗H5亞型AIV血凝素單克隆抗體的制備及亞型鑒定.畜 牧獸醫醫學，2008，M (6) :8-11])，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7. 4) 洗滌2次。3. sol-gel溶液(溶膠-凝膠法)制備①將15. 2ml正硅酸乙酯(購自國藥集團 化學試劑有限公司，產品編號=80124192)和80微升0. 07N HCl依次加入3. 6ml去離子水； ②將之置于冰浴上攪拌10分鐘；③室溫超聲20分鐘；④將3. 6ml的去離子水與7. 2ml聚 乙二醇 300 (PEG, Polyethyleneglycol，分子量為 300，購自 Fluka 公司，產品編號=90878, 美國)混勻，緩慢遞加入正硅酸乙酯溶液中；⑤上述溶液經過0. 45微米的濾膜過濾；⑥上 述溶液用緩沖液(緩沖液制備將0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. ^3g，加水定容到100ml，pH9. 6) 稀釋10倍后備用。4.分子馬達生物傳感器的芯片及試劑盒制備2μ 1，0. 5μ g/μ 1的 chromatophores (帶有分子馬達),0. 25 μ 1制備的sol-gel溶液，與48 μ 1緩沖液(緩沖液 制備將0. 16g Na2CO3, NaHCO3 0. 293g，加水定容到100ml, ρΗ9· 6)混合，滴在直徑為0. 5cm 的圓形濾紙上(Whatman公司，產品編號1450090，英國)，室溫干燥12小時備用。濾紙上 滴加30 μ 1，0. 12 μ M生物素化的分子馬達ε亞基多抗，37°C連接60分鐘，加100 μ 1磷酸 鹽緩沖液(PBS, ρΗ7· 4)洗滌1次；力口 30 μ 1，0. 6 μ M親和素，室溫連接5分鐘，加100 μ 1磷 酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌1次；加35μ 1,0. 18 μ M生物素化的病毒蛋白抗體，室溫連 接5分鐘，加100 μ 1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 4)洗滌2次，室溫干燥12小時備用。圓形 濾紙置于96孔ELISA過濾型微孔板上，該96孔ELISA過濾性微孔板即為本發明中的試劑
品.ο實施例2納米生物傳感器對致死型禽流感H5W的實時動態檢測人類致死型禽流感病毒H5m病毒[A/Anhui/1/2005(H5N1)](商購自中國農 業科學院哈爾濱獸醫研究所，參見文獻[董婕，張紅，劉運芝等.中國大陸首例人感染 高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的實驗室診斷.中華實驗和臨床病毒學雜志，2006， 20 (2) 14-16])或 H9N2 病毒液[A/Chicken/Shandong/6/1996](商購自中國農業科學 院哈爾濱獸醫研究所，參見文獻[Zhang Yun, Deng Zhengtao, Yue Jiachang，等.Using cadmiumtelluride quantum dots as a proton flux sensor and applying to detect H9 avianinfluenza virus. Analytical Biochemistry, 2007, 364 (2) : 122-127])(雞胚培 養液)，經 ATP 合成緩沖液(ImM Tricine，10%甘油，5mM NaH2PCM，5mMMgCl2，pH8. 0)倍比稀 釋，終濃度為10000個病毒粒子/微升的病毒溶液。將實施例1中制備的本發明的試劑盒用于該病毒檢測，將上述病毒溶液加入所述試劑盒，37°c反應5分鐘，熒光掃描儀(型號 Fluoroskan Ascent，廠家Thermo Labsystems，美國)96孔板掃描測定熒光強度，實時記錄 反應體系的熒光強度變化過程(圖4)。本實驗中使用了 ADP和NADH雙啟動。ADP的啟動 效果見圖5，由圖5可見，反應體系中增加了 ADP后，熒光強度變化幅度均發生了明顯增加， 其中，在反應體系中增加了 4mMADP后，熒光強度變化比值與沒有加入ADP的樣品相比，增加 了 2. 4 倍。以沒有加入病毒粒子的樣品作為對照組，與對照組(對照組組成為lmM 1^(^1^，10%甘油，51111 NaH2PO4, 5mM MgCl2, pH8. 0)比較，病毒蛋白組熒光強度更高，組間 差異具有顯著性(圖6)。實施例3納米生物傳感器對致死型禽流感H5W的快速靈敏檢測人類致死型禽流感病毒H5m病毒液[A/Anhui/1/2005 (H5N1)](雞胚培養液)， 經 ATP 合成緩沖液(ImM Tricine，10%甘油，5mM NaH2PO4, 5mMMgCl2, pH8. 0)倍比稀釋，終 濃度為3個梯度，分別為1000個病毒粒子/孔、1000個病毒粒子/孔、10000個病毒粒子/ 孔。將實施例1中制備的本發明的試劑盒用于該病毒檢測，將上述病毒溶液加入所述試劑 盒，37°C 反應 5 分鐘，熒光掃描儀(型號Fluoroskan Ascent，廠家Thermo Labsystems, 美國)96孔板掃描測定熒光強度，對照組(對照組組成為lmM TriCine，10%甘油，5mM NaH2PO4, 5mM MgCl2,pH8. 0)不含病毒蛋白粒子。檢測結果呈劑量-效應關系，即隨著病毒濃 度依次增加，檢測樣品的熒光強度依次上升。統計結果見圖7。
權利要求
1.一種納米生物傳感器，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達FtlF1-ATPase,其中 所述FtlF1-ATPase的ε亞基上連接有生物大分子。
2.根據權利要求1所述的納米生物傳感器，其中所述載色體是來自編號為ATCC27502 的嗜熱菌(Thermomicrobium roseum)。
3.根據權利要求1所述的納米生物傳感器，其中所述ε亞基是經由抗ε亞基抗體與 所述生物大分子連接。
4.根據權利要求3所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是多克隆抗體或單 克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的納米生物傳感器，其中所述抗ε亞基抗體是通過生物素-親 和素-生物素與所述生物大分子連接。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的納米生物傳感器，其中所述生物大分子是DNA、小 RNA、或蛋白質，優選病毒分子特異性抗原的抗體。
7.根據權利要求1-6任一項所述的納米生物傳感器在制備用于檢測生物大分子的試 劑中的應用，優選其中所述納米生物傳感器經過了 sol-gel技術(溶液-凝膠法)處理。
8.根據權利要求7所述的應用，其中所述試劑用于96孔芯片型快速靈敏檢測。
9.試劑盒，其包含根據權利要求1-6中任一項所述的納米生物傳感器。
10.根據權利要求9的試劑盒，其中所述試劑盒是96孔ELISA過濾性微孔板的形式。
全文摘要
本發明涉及一種全旋轉式生物傳感器，用于生物大分子(病毒蛋白)的快速檢測。該檢測體系以ATPase的ε亞基作為負載連接位點，以生物素-親和素-生物素為連接成分，該連接部分對生物大分子具有邊捕獲抗原，邊旋轉的雙重功能，減少了常用生物大分子測定研究中抗體抗原之間的結合的時間，明顯縮短了反應過程。另外，該檢測體系采用雙淬滅熒光新技術，起到雙淬滅的協同效應，從而提高反應的效率，有效提高了信噪比，實現了實時靈敏快速檢測；并且采用sol-gel技術(溶膠-凝膠法)，提高了分子馬達在介質表面的穩定性，使組內平行性更好。
文檔編號G01N33/577GK102135543SQ201010102258
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月27日 優先權日2010年1月27日
發明者樂加昌, 張旭, 李學仁, 陶寧 申請人:中國科學院生物物理研究所